豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌疫苗的研究進(jìn)展

趙浩飛,趙紅,徐永平,李曉宇,陳凱迪,楊雪瑩,王麗麗

(大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024)

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli， ETEC)是一種能夠感染人和動(dòng)物的重要病原菌。ETEC可導(dǎo)致人類出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉問題，不僅能引起嬰幼兒腹瀉，還會(huì)造成旅行者腹瀉[1]。仔豬、犢牛、羔羊等幼齡動(dòng)物也是ETEC主要的致病對(duì)象[2], 給養(yǎng)殖業(yè)尤其是養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一直以來，人們嘗試了各種策略來控制和預(yù)防ETEC造成的腹瀉，包括抗生素治療[3]，用特異性抗體進(jìn)行治療[4]，對(duì)具有ETEC抗性的原種豬進(jìn)行遺傳育種得到抗ETEC的后代[5]和疫苗接種[6]。使用抗生素治療可以緩解ETEC相關(guān)腹瀉和其他臨床癥狀。然而，抗生素濫用帶來了更嚴(yán)重的問題，如細(xì)菌耐藥性和藥物殘留；對(duì)妊娠母豬口服特定抗菌抗體可以在養(yǎng)殖過程中提供一定的保護(hù)，但代價(jià)昂貴且勞動(dòng)量巨大。同時(shí)，遺傳育種方法不僅很難確定具體的遺傳靶點(diǎn)，也很難將其應(yīng)用于篩選ETEC抗性或易感豬。疫苗接種是可以有效控制和預(yù)防ETEC引起的腹瀉的理想方法。本文就ETEC的致病機(jī)理以及相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ETEC主要致病因子

實(shí)際養(yǎng)殖過程中，ETEC 主要通過糞口途徑傳播，當(dāng)仔豬吸食母乳時(shí)，母豬皮膚上的ETEC細(xì)菌可進(jìn)入到仔豬腸道。同時(shí)，由于新生仔豬腸道黏膜免疫系統(tǒng)未發(fā)育健全，所以極易受到各類致病微生物的攻擊。在造成仔豬腹瀉的過程中，主要致病因子是黏附素和腸毒素。ETEC主要致病因子的理化性質(zhì)如表1[7]。

表1 豬源ETEC主要致病因子理化性質(zhì)

菌毛是ETEC最主要的黏附素，近年來的研究顯示豬源ETEC菌株常見的菌毛類型為F4、F5、F6、F18、F41，能介導(dǎo)ETEC定植于腸道并進(jìn)行繁殖，然后產(chǎn)生腸毒素引起腹瀉。腸毒素包括熱穩(wěn)定性腸毒素 (heat-stable enterotoxin, ST) 和熱不穩(wěn)定性腸毒素 (heat-labile enterotoxin, LT) 兩類。熱不穩(wěn)定性腸毒素 LTA是由五聚體B亞單位和A亞單位組成[8]。LT在ETEC對(duì)宿主腸上皮細(xì)胞的黏附和定植方面有著促進(jìn)作用，但機(jī)制尚未明確，新的研究發(fā)現(xiàn)，LTB亞基能與細(xì)菌外膜囊泡(OMVs)中的脂多糖(LPS)形成“OMVs-LT-GM1”橋梁，從而促進(jìn)細(xì)菌黏附[9]。ST是分子量很小的單體毒素，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、功能和免疫原性不同分為STa和STb，對(duì)兒童和幼畜有較強(qiáng)的毒性。STa的毒性強(qiáng)，STb常出現(xiàn)在ETEC引起的仔豬腹瀉的分離株中。另外，有研究發(fā)現(xiàn)STb在一定程度上會(huì)影響大腸桿菌的耐藥性[10]。

ETEC主要依賴黏附素和腸毒素引起仔豬腹瀉，ETEC首先在菌毛黏附素的介導(dǎo)下, 牢固地黏附于小腸表面，并大量繁殖，隨后產(chǎn)生多種腸毒素，分別與腸上皮細(xì)胞的不同受體結(jié)合并作用于上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸道水和電解質(zhì)失衡，無機(jī)鹽離子大量流失，引起仔豬腹瀉[11]。

2 豬ETEC疫苗的研究現(xiàn)狀

2.1 全菌滅活疫苗

全菌滅活疫苗是指培養(yǎng)好的細(xì)菌未經(jīng)過菌毛或腸毒素提取，直接進(jìn)行全菌滅活制作的疫苗，這是目前實(shí)驗(yàn)中和商品化ETEC疫苗的主要制備方法, 如Elanco生產(chǎn)的商用疫苗由4種ETEC疫苗(F4、F5、F6和F41菌株)的混合物組成，Vencofarma開發(fā)的商用疫苗抗原包含滅活的F4、F5、F41和987P菌株[12]，以及國內(nèi)瑞普生物藥業(yè)生產(chǎn)的豬痢安和上海海利生物技術(shù)生產(chǎn)的痢無憂等大腸桿菌滅活疫苗。這種疫苗制備方法成本低，簡單易得，而且制備的全菌抗原針對(duì)性強(qiáng)，對(duì)動(dòng)物的免疫效果明顯。楊德鴻等[13]通過對(duì)蘇北地區(qū)21個(gè)豬場(chǎng)采樣調(diào)查，以其優(yōu)勢(shì)血清O8、O101為前提研制出二價(jià)滅活疫苗，并對(duì)感染小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)，以PBS為對(duì)照，結(jié)果顯示，該二價(jià)滅活疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)率在83%以上。劉澤文等[14]將ETEC培養(yǎng)后取其K88、K99和F6菌毛上清, 經(jīng)滅活后與氫氧化鋁佐劑、凍干保護(hù)劑混合制備成凍干疫苗,懷孕母豬經(jīng)過2次免疫后, 使用同源ETEC對(duì)其后代仔豬口服攻毒, 結(jié)果表示, 該滅活疫苗對(duì)后代仔豬的保護(hù)率均在80%以上, 而對(duì)照組則全部發(fā)病。但全菌滅活疫苗也有一些局限性：ETEC血清型較多且毒力因子復(fù)雜，易發(fā)生突變[15]，使得全菌滅活疫苗應(yīng)用范圍較窄，受地域和環(huán)境影響較大。另外，全菌滅活疫苗能發(fā)揮免疫效應(yīng)的成分較少，不具有高效性。

2.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗就是用分子生物學(xué)技術(shù)分析出病原體的主要抗原基因，將其轉(zhuǎn)入原核或真核表達(dá)系統(tǒng)使其生產(chǎn)出相應(yīng)的抗原，進(jìn)而制備成疫苗；或者把毒力因子刪除或突變，將其變?yōu)闊o毒性的基因缺失疫苗。菌毛和腸毒素是ETEC的主要毒力因子，應(yīng)用基因重組技術(shù)，將菌毛或腸毒素基因定向插入到細(xì)菌細(xì)胞中，并使其充分表達(dá)，制成ETEC基因工程疫苗?；蚬こ桃呙绾芎玫慕鉀Q了ETEC多血清型且毒力因子復(fù)雜的問題；可制成多價(jià)疫苗，達(dá)到預(yù)防多種疾病的效果；免疫原性好，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)，國內(nèi)的中牧實(shí)業(yè)股份有限公司江西生物藥廠生產(chǎn)的仔豬大腸桿菌腹瀉K88-LTB雙價(jià)基因工程疫苗和上海海利生物藥品生產(chǎn)的(K88/K99)雙價(jià)基因工程疫苗以及碩騰公司生產(chǎn)的利特佳?大腸桿菌病二聯(lián)疫苗均已商品化生產(chǎn)使用，對(duì)保護(hù)動(dòng)物免受ETEC感染有著較好的防護(hù)效果。

菌毛基因工程疫苗研究較為理想，Duan等[16]應(yīng)用多表位融合抗原(mutiple-epitope fusion antigen，MEFA)技術(shù)構(gòu)建了FaeG-FedF-FAc-FasA-FIM41a MEFA，使用主要菌毛K88和F18的黏附亞基作為骨架，還整合了菌毛K99、F6和F41的黏附亞基的表位，進(jìn)行小鼠免疫和體外細(xì)菌黏附評(píng)估。經(jīng)過MEFA蛋白皮下免疫的小鼠產(chǎn)生了針對(duì)五種菌毛的IgG抗體。此外，由MEFA蛋白誘導(dǎo)的抗菌毛抗體顯著抑制K88+、F18+、K99+、F6+和F41+ETEC菌株對(duì)仔豬小腸IPEC-1和IPEC-J2細(xì)胞系的黏附。Matías等[17]從參與仔豬感染的主要ETEC菌株(F4和F18血清型)中獲得的外膜囊泡(OMV)被包封在涂有Gantrez?AN-甘露糖胺綴合物的玉米醇溶蛋白納米顆粒中，對(duì)小鼠和妊娠母豬進(jìn)行口服免疫，結(jié)果表明相對(duì)于游離口服給藥，納米顆粒誘導(dǎo)IL-2、IL-4和 IFN-γ水平升高，而且后代哺乳仔豬在血清中呈現(xiàn)特異性IgG，證明這種新型口服亞單位疫苗具有良好的感染保護(hù)能力。

腸毒素基因工程疫苗也有較好的發(fā)展，Zhang等[18]將腸毒素STa、STb和LTB基因通過連接肽進(jìn)行連接，構(gòu)建重組SLS表達(dá)質(zhì)粒，并導(dǎo)入E.coliBL21菌株中制備重組 SLS 抗原蛋白，同時(shí)提取純化 K88、K99、F6、F41 菌毛抗原蛋白，制備成腸毒素-菌毛復(fù)合多價(jià)疫苗， 在母豬產(chǎn)仔前30和15 d分別免疫接種一次，發(fā)現(xiàn)免疫組后代仔豬無腹瀉現(xiàn)象，對(duì)照組30%出現(xiàn)腹瀉，說明候選疫苗對(duì)ETEC腸毒素或菌毛抗原起到了較好的免疫效果。Song等[19]構(gòu)建了三價(jià)腸毒素蛋白STa-LTB-STb和F5菌毛的抗原融合蛋白(SLS-F5)以乳酸乳球菌為載體，制備了抗ETEC口服疫苗，對(duì)小鼠口服免疫后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平黏膜SIgA和血清IgG抗體和多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。而且，口服免疫小鼠在ETEC攻擊后產(chǎn)生了完全的保護(hù)。

2.3 弱毒疫苗

弱毒疫苗是指用人工致弱或自然篩選的弱毒株，經(jīng)過培養(yǎng)后制備成病原致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗。該疫苗可在免疫動(dòng)物體內(nèi)繁殖，用量?。幻庖咴院?，成本低。Coliprotec?F4[20]和二價(jià)F4/F18疫苗[21]是為免疫斷奶仔豬腹瀉而設(shè)計(jì)的弱毒疫苗。Harutyunyan等[22]基于一種減毒的志賀氏菌活菌株，通過異源表達(dá)兩種ETEC抗原LTB和無毒的ST突變體STN12S構(gòu)建了一種志賀氏菌和ETEC氏菌聯(lián)合疫苗(ShigETEC)，并在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)高滴度的抗細(xì)菌裂解物的免疫球蛋白和免疫球蛋白抗體，以及具有中和能力的抗ETEC毒素抗體。Nadeau等[21]將2株非致病性ETEC F4和F18制備為二價(jià)弱毒疫苗, 經(jīng)一次口服免疫仔豬, 結(jié)果顯示, 該二價(jià)弱毒疫苗能預(yù)防7～21 d由F4和F18 ETEC引起的仔豬腹瀉, 另外免疫組仔豬F4和F18 ETEC菌株的定植明顯減少, 同時(shí)能夠在仔豬體內(nèi)檢測(cè)到F4或F18特異性IgM和IgA抗體。弱毒疫苗使用的弱毒株是活的生命體，易通過胃酸環(huán)境進(jìn)入小腸并定植在腸上皮細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體黏膜免疫，有著較好的免疫效果，但弱毒株的毒力在傳代過程中有毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，存在一定的安全問題。

2.4 DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指將含有編碼蛋白抗原基因的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體。DNA疫苗使用一次能產(chǎn)生長期保護(hù)效果，疫苗的免疫原性好，一種DNA疫苗就能誘導(dǎo)多個(gè)抗原表位的免疫保護(hù)作用，具有較好的靈活性，便于生產(chǎn)且成本低。Melkebeek等[23]將編碼ETEC F4ac菌毛faeG基因的重組質(zhì)粒和編碼不耐熱性腸毒素LT基因的重組質(zhì)粒分別以500 μg皮內(nèi)注射和250 μg肌內(nèi)注射到5周齡的仔豬, 21 d后加強(qiáng)免疫1次, 測(cè)定仔豬血清FaeG特異性抗體, 顯示IgG能長時(shí)間持續(xù)較高水平,而IgA和IgM抗體水平非常低。Lu等[24]通過使用缺乏腸毒性但保留免疫原性的抗原決定簇替代LT類毒素作為呈現(xiàn)兩個(gè)ETEC菌毛和四種毒素的中和抗原決定簇的骨架，我們生成了菌毛毒素MEFA并對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫，免疫的小鼠對(duì)K88、F18、LT和STb產(chǎn)生了強(qiáng)烈的IgG反應(yīng)，對(duì)毒素Stx2e和STa產(chǎn)生了中和反應(yīng)。另外，MEFA誘導(dǎo)的抗體抑制了K88或F18細(xì)菌對(duì)豬腸道細(xì)胞的黏附，并中和了LT、STa、STb和Stx2e毒素的毒性，證明了該疫苗的具有一定的應(yīng)用潛力。但是DNA疫苗有一定的局限性，編碼抗原的基因可能會(huì)整合到宿主基因上，安全性較低，在機(jī)體中長期存在還可能引起免疫耐受現(xiàn)象，這也是DNA疫苗研究待解決的問題。

3 展望

ETEC引起的仔豬腹瀉給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，抗生素的廣泛使用帶來了嚴(yán)重的安全問題，因此接種疫苗成為預(yù)防仔豬腹瀉的重要手段。盡管對(duì)ETEC疫苗的研究取得了很大的進(jìn)展，但這疫苗的局限性也很明顯。ETEC的菌毛抗原種類較多，而且地域分布差異較大，使得研制安全有效的疫苗變得更加困難。目前許多ETEC疫苗大部分只包括了部分菌毛黏附素和腸毒素，對(duì)動(dòng)物的免疫效果不夠全面，缺乏廣譜性，以期通過對(duì)免疫方式、抗原類型及疫苗形式的優(yōu)化，更好地誘發(fā)機(jī)體全身和黏膜免疫反應(yīng)?；蚬こ碳夹g(shù)的應(yīng)用不僅能增強(qiáng)疫苗免疫的效果及安全性，通過對(duì)多種抗原的融合還增加了疫苗防護(hù)的廣譜性，具有較好的研究前景，這對(duì)于ETEC感染的預(yù)防具有十分重要的意義。