三七總皂甙對顱腦損傷大鼠血漿及海馬中ET-1 CGRP的影響*

許剛　鞏守平　崔剛　僧志遠(yuǎn)　高李貴　屈建強

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 陜西 西安 710004)

·論著·

三七總皂甙對顱腦損傷大鼠血漿及海馬中ET-1 CGRP的影響*

許剛鞏守平崔剛僧志遠(yuǎn)高李貴屈建強

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 陜西 西安 710004)

【摘要】目的探討大鼠顱腦損傷后血漿、海馬內(nèi)皮素(ET-1)及降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)水平的變化，以 及三七總皂甙(PNS)對其影響。方法80只Wister大鼠隨機分為空白組、模型組、PNS低劑量組、PNS高劑量組各20只，采用Feeney法建立大鼠顱腦損傷模型，RIA法測定顱腦損傷72小時大鼠血漿及海馬中ET-1、CGRP的含量,HE和Niss染色觀察大鼠大腦及海馬病理變化。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠血漿及海馬中ET-1顯著升高(P<0.05)，CGRP明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，PNS低、高劑量均能顯著降低血漿及海馬中ET-1水平(均P<0.05)，升高CGRP含量(均P<0.05)；高劑量組與低劑量組ET-1及CGRP水平比較均有顯著性差異(均P<0.05),提示PNS能減輕腦損傷大鼠腦組織的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，減少海馬神經(jīng)元的死亡數(shù)量。結(jié)論三七總皂甙可顯著降低顱腦損傷大鼠血漿及海馬中ET-1含量，升高CGRP水平，減輕顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害。

【關(guān)鍵詞】顱腦損傷；內(nèi)皮素；降鈣素基因相關(guān)肽；三七總皂甙

顱腦損傷不僅包括顱腦損傷瞬間造成的機械性原發(fā)性損傷，也包括缺血、缺氧等繼發(fā)損害，其中繼發(fā)性損害是其預(yù)后不良的重要影響因素[1]。因此如何減輕繼發(fā)性缺血、缺氧性損害，是提高顱腦損傷救治水平需要解決的關(guān)鍵問題之一。內(nèi)皮素(Endothelin,ET-1)是一種具有強力生物活性的血管收縮因子，在腦缺血的病理生理反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)廣泛分布于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)，是目前已知的最強的血管擴(kuò)張劑，與ET-1之間具有強烈的相互拮抗作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后血漿及腦脊液中ET-1水平顯著升高而CGRP水平顯著下降[3,4]。三七總皂甙(Panax notoginseng saponins, PNS)為三七干燥根莖提取成份，含人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1和三七皂甙R1，近年研究表明，它能夠降低顱腦損傷后自由基的產(chǎn)生，減輕腦水腫和腦組織病理性損害[5],然而其對顱腦損傷后血漿及海馬中ET-1、CGRP和海馬中神經(jīng)元變化的影響卻未見報道。本研究采用改良Feeney[6]法建立大鼠顱腦損傷模型，觀察顱腦損傷后血漿及海馬中ET-1、CGRP水平，以及海馬中神經(jīng)元變化和三七總皂甙對其的影響，探討其對顱腦損傷的作用及相關(guān)可能機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組健康清潔級Wister大鼠80只，雌雄不拘，體重(280±50)g,由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供(陜醫(yī)動字110033)。購后自然光照，隨意進(jìn)食，飼料為該中心提供的標(biāo)準(zhǔn)全價飼料，飲用水為自來水，觀察1周正常后進(jìn)行實驗。按照實驗設(shè)計隨機分為空白對照組(n=20)、模型組(n=20)和PNS低劑量組(n=20)、PNS高劑量組(n=20)。

1.2主要試劑及儀器三七總皂甙注射液(云南植物藥業(yè)有限公司，批號：0040509011，250 mg/10ml)；內(nèi)皮素放免試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所提供，編號：040602)；降鈣素基因相關(guān)肽放免試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所提供，編號：040671)；SN-695B型智能放免測量儀(上海原子核物理研究所研制)。冰凍切片機(CM1900型，德國Leica公司)。

1.3實驗動物的造?？瞻捉M不造模，其余各組均采用Feeney[6]自由落體腦損傷的方法造成顱腦損傷模型。大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉后，俯臥位固定于底板上，固定頭部，剪去頂毛并消毒，沿正中矢狀線切開頭皮，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm、中線旁開2.5mm處鉆一直徑5mm的骨窗，保持硬腦膜完整，將直徑4.5mm的圓錐型撞擊端置于骨窗硬膜外，用20g砝碼由30cm高度自由下落撞擊撞擊端，造成右頂葉腦挫裂傷,充分止血后，骨蠟封閉骨窗，碘伏消毒傷口后縫合頭皮。

1.4給藥劑量及方法給藥劑量：依據(jù)D大鼠=D人×R大鼠÷R人公式[7]計算大鼠PNS注射液用藥量，低劑量組藥量的2倍定義為高劑量。于大鼠造模完成后5min及24、48、70h，空白組及模型組腹腔注射與PNS低劑量組同劑量的生理鹽水；低劑量組腹腔注射PNS 100mg/kg;高劑量組腹腔注射PNS 200mg/kg。

1.5實驗標(biāo)本的制備與檢測

1.5.1血漿標(biāo)本制備各組大鼠飼養(yǎng)72小時后，各組取12只，斷頭處死采血4ml, 注入含7.5%EDTA60μl和抑肽酶80μl的試管中，混勻，4℃3000rpm離心10min,分離血漿，分裝2份，-20℃保存。

1.5.2海馬標(biāo)本制備將1.5.1中斷頭處死大鼠的頭顱放入液氮中冷凍5min，分出右側(cè)海馬，稱重，按1∶5(W/V)加入0.1mol醋酸略做研磨，然后在100℃水浴中煮沸10min，再次研磨制成勻漿，4℃ 3000rpm離心15min，取上清液分裝2份-20℃保存。

1.5.3ET-1、CGRP檢測用放免法測定腦創(chuàng)傷大鼠血漿及海馬中ET-1、CGRP含量(按照說明書標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行操作)。

1.5.4病理檢查取各組大鼠8只，斷頭處死，右腦置入100g/L福爾馬林液中固定72小時，遞增乙醇脫水，常規(guī)石臘包埋，病灶組織石蠟塊連續(xù)冠狀切片，片厚 51μm，隔 10 張取3張，共取12張，標(biāo)記編號，晾干烤片, 行HE及尼氏體染色，對海馬CA-1區(qū)進(jìn)行檢查。尼氏體染色采用1%甲苯胺藍(lán)方法：①切開脫蠟至水。②1%甲苯胺藍(lán)染10分鐘，37℃。③蒸餾水洗。④95%酒精分化至尼氏小體僅成藍(lán)色。⑤純酒精脫水、透明、封固。結(jié)果：尼氏小體紫色，膠質(zhì)細(xì)胞淡紫色，背景無色。

2結(jié)果

2.1各組血漿及海馬中ET-1及CGRP水平比較于造模后72小時，與空白組比較，模型組血漿及海馬ET-1水平顯著升高(P<0.05)；CGRP水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，PNS低、高劑量組血漿及海馬ET-1水平均顯著下降(均P<0.05)，CGRP水平均顯著升高(均P<0.05)；PNS低、高劑量組間ET-1及CGRP水平差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2右側(cè)大腦HE染色結(jié)果空白組未見異常；模型組神經(jīng)細(xì)胞變性，溶解壞死，腦細(xì)胞疏松水腫，間質(zhì)水腫及大片出血改變伴中性粒細(xì)胞浸潤，并有圍血管現(xiàn)象；PNS低劑量組神經(jīng)細(xì)胞壞死減少，可見神經(jīng)細(xì)胞變性，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血伴部分疏松水腫，見灶性出血；PNS高劑量組所有標(biāo)本神經(jīng)細(xì)胞壞死不明顯，神經(jīng)細(xì)胞變性減輕，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血，見圖1～4。

表1　各組大鼠血漿及海馬中ET-1、CGRP水平比較

注：與空白組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與PNS低劑量組比較，③P<0.05

圖1空白組(HE×20)

Fig 1Blank group (HE×20)

圖2模型組(HE×20)

Fig 2Model group (HE×20)

圖3PNS低劑量組(HE×20)

Fig 3PNS low dose group (HE×20)

圖4PNS高劑量組(HE×20)

Fig 4PNS high dose group (HE×20)

2.3右側(cè)海馬尼氏染色CA1區(qū)神經(jīng)元計數(shù)各組大鼠海馬CA1區(qū)平均數(shù)目如下：空白組180個/HP，模型組80個/HP，PNS低劑量組120個/HP，PNS高劑量組140個/HP，見圖5～8。

圖5空白組(Niss×20)

Fig 5Blank group (Niss×20)

圖6模型組(Niss×20)

Fig 6Model group (Niss×20)

圖7PNS低劑量組(Niss×20)

Fig 7PNS low dose group (Niss×20)

圖8PNS高劑量組(Niss×40)

Fig 8PNS high dose group (Niss×40)

3討論

腦血管痙攣在中重型顱腦損傷患者中的發(fā)生率約為5%～41%[8]。顱腦損傷后腦血管痙攣可使腦血流下降，腦組織灌注不足，造成腦組織缺血缺氧，從而加重腦損害。重型顱腦損傷患者腦血流量降低，傷后72小時腦氧攝取率明顯下降[9，10]。ET作為一種具有強烈收縮血管作用的神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞均可分泌。CGRP是一種具有強烈舒血管作用的神經(jīng)肽，廣泛存在于支配腦血管的神經(jīng)末梢。研究發(fā)現(xiàn)[11]，腦損傷后腦血管痙攣與血漿ET-1濃度變化呈正相關(guān),與CGRP呈負(fù)相關(guān)。苑玉清等[12]發(fā)現(xiàn)，急性重型顱腦損傷患者血漿中ET與CGRP含量差值及平均動脈壓與對照間有顯著性差異,且二者間呈正相關(guān)。表明ET的縮血管活性明顯超過CGRP的舒血管活性，從而對急性重型顱腦損傷患者傷后平均動脈壓的升高起主要作用,差值越大平均動脈壓越高。平均動脈壓的升高在一定范圍內(nèi)提高腦動脈灌注壓,以對抗因血管痙攣所致的供血不足,進(jìn)一步保護(hù)腦功能。但當(dāng)血壓持續(xù)增高并突破其調(diào)節(jié)上限時,則會發(fā)生腦過度灌注,此時MABP越高,過度灌注越嚴(yán)重。腦血流的過度灌注可進(jìn)一步加重腦水腫和血腦屏障的損害,使病情急劇發(fā)展,最終導(dǎo)致腦疝,危及生命。急性重型顱腦損傷中ET、CGRP與平均動脈壓三者間的病理生理反應(yīng)過程在某種程度上與急性顱高壓危象時的Cushing反應(yīng)相吻合。急性重型顱腦損傷患者傷后ET過度的產(chǎn)生和釋放以及CGRP的非同步性增高,是造成急性重型顱腦損傷患者病情惡化的極為重要的病理生理反應(yīng)因素。同時ET/CGRP比值的變化是影響腦損傷患者病情及預(yù)后的一個客觀指標(biāo)[13]。本實驗結(jié)果表明,大鼠顱腦損傷后血漿、海馬中內(nèi)皮素含量增高,降鈣素基因相關(guān)肽水平下降，海馬神經(jīng)元壞死數(shù)增加。

目前顱腦損傷后ET-1及CGRP變化的機制不甚清楚,可能與下列因素有關(guān)[14]:①顱腦損傷后全身應(yīng)激反應(yīng),腎上腺素生成增加,刺激ETmRNA的表達(dá),導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞大量分泌ET-1。②顱腦損傷時,血管內(nèi)皮直接受損造成ET-1外溢。③顱腦損傷時顱內(nèi)出血尤其是SAH,紅細(xì)胞破裂釋放氧合血紅蛋白,刺激內(nèi)皮細(xì)胞增加ET-1的分泌。④顱腦損傷時顱內(nèi)壓升高,腦血流量下降,腦缺血缺氧刺激ETmRNA的表達(dá)。⑤顱腦損傷時大量神經(jīng)元受損,因顱內(nèi)壓升高,灌注壓降低致腦缺血,大量神經(jīng)元變性壞死,以致CGRP合成與釋放減少,消耗增多。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，PNS低、高劑量治療后大鼠血漿及海馬中內(nèi)皮素下降及降鈣素基因相關(guān)肽上升，海馬神經(jīng)元死亡數(shù)量減少；且PNS高劑量明顯優(yōu)于PNS低劑量組，表明PNS在顱腦損傷中有十分明顯的腦保護(hù)作用，且呈一定的量效關(guān)系。PNS能夠改善微循環(huán)，增加腦血流量，降低機體耗氧，提高機體對缺氧的耐受能力，不僅廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管疾病，而且對重型顱腦損傷患者也具有明顯的治療效果。推測其機制可能與以下作用有關(guān)：①PNS阻斷受體依賴鈣通道開放，抑制腦血管平滑肌鈣內(nèi)流，降低顱腦損傷后的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，抑制線粒體跨膜電位下降，保護(hù)線粒體功能[15]。②PNS阻斷了顱腦損傷后ET-1與CGRP比例失衡，通過調(diào)節(jié)腦血管的舒縮狀態(tài)及糾正腦血流量的自身調(diào)節(jié)失衡，改善微循環(huán)及血腦屏障通透性，增加大腦局部血流量，減輕血管源性腦水腫，降低腦代謝率，減少興奮性氨基酸的產(chǎn)生，清除自由基，減輕神經(jīng)細(xì)胞損害，增強損傷腦組織的修復(fù)[16]。③PNS可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的完整性，這也可能是其降低ET-1水平的因素之一。

4結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，顱腦損傷后血漿及海馬中內(nèi)皮素升高，降鈣素基因相關(guān)肽下降，海馬缺血，神經(jīng)元壞死明顯；PNS能夠明顯降低顱腦損傷后大鼠血漿及海馬中的內(nèi)皮素含量，升高降鈣素基因相關(guān)肽水平，減少海馬神經(jīng)元壞死，且呈一定的量效關(guān)系，這可能是其在顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害過程中發(fā)揮腦保護(hù)作用的機制之一。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Ormatad H, Aass HC, Lund-Srensen N,etal.Serum levels of cytokines and creative protein in acute ischemic stroke patients and their relationship to stroke lateralization type and infarct volume[J]. J Neurol, 2011, 258(4):677-685.

[2]Waton RE, Supowit SC, Zhao H,etal. Role of sensory nervous system Vasoactive peptides in Hypertension[J]. Braz J Med Biol Res, 2002, 35(9) :1033-1045.

[3]王時龍, 丁花艷. TNF、ET、CGRP在急性顱腦損傷患者血液及腦脊液中的變化及意義[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2013, 24(18):2759-2760.

[4]官明, 陳禮剛, 陳躍, 等. 依達(dá)拉奉對創(chuàng)傷性腦損傷患者血漿內(nèi)皮素、降鈣素基因相關(guān)肽、神經(jīng)組織蛋白的影響[J]. 中國神經(jīng)精神疾病雜志，2007,33(11):643-644.

[5]韓金安, 匡永勤, 周虎田,等. 三七總皂甙對家兔腦損傷后腦組織中丙二醛含量變化的影響[J].中國病理生理雜志, 2000,16(3):269-271.

[6]Feeny DM, Boyeson MG, Linn RT,etal. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat [J]. Brain Res,1981,211(1):67-77.

[7]賀石林,王鍵,王凈凈.中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)[M].長沙:湖南科技出版社,2003:49.

[8]Cherian L, Hlatky R, Robertson CS. Comparison of tetrahydrobiopterin and L-arginine on cerebral blood flow after controlled cortical impact injury in rats [J]. J Neurosurg, 2004, 21(9):1196.

[9]羅大山, 鄧峰. 腦氧攝取率變化對重型顱腦損傷患者預(yù)后影響的觀察[J].西部醫(yī)學(xué),2007,19(5):821.

[10] 趙愛軍, 楊立豐, 王守臣, 等. 經(jīng)顱多普勒監(jiān)測重度顱腦損傷患者的血流變化[J].西部醫(yī)學(xué),2010,22(10):1835-1836.

[11] 丁建軍,李維平,付友增,等.ET-1、CGRP在顱腦損傷后腦血管痙攣中的作用[J].中華實驗外科雜志,2002,19(4):326-327.

[12] 苑玉清,蔡博文,游潮. 急性重型顱腦損傷時內(nèi)皮表和降鈣素基因相關(guān)肽含量變化及其對動脈壓的影響[J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2004,13(7):476-477.

[13] 白亮. 顱腦損傷急性期患者的血糖和乳酸脫氫酶及C反應(yīng)蛋白的水平變化及臨床意義[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2011,14(5B)：1599-1600.

[14] 官明, 陳禮剛, 董勁虎, 等. 半胱氨酸蛋白酶-3抑制劑z-DEVD-fmk對大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及血漿血管內(nèi)皮素、降鈣素基因相關(guān)肽水平的影響[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2014,27(3):207-209.

[15] 宋月英, 閏玉仙, 陳海生,等.三七總皂甙對缺血再灌注大鼠腦組織CaMKⅡ-βmRNA及蛋白的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2011,31(3):835-837.

[16] 劉旺華, 李花,周小青,等. 三七總皂甙對大鼠缺血再灌注海馬細(xì)胞Ca2+及線粒體膜電位的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(1):99-101.

Effects of Panax notoginseng on levels of endothelin-l and calcitongene related peptide in the plasma and hippocampus of rats with brain trauma

XU Gang, GONG Shouping, CUI Gang, et al

(DepartmentofNeurosurgery,TheAffiliatedSecondHospital,SchoolofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the change and the effect of Panax notoginseng (PNS) on the levels of endothelin-1 (ET-1) and Calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the plasma and hippocampus of rats with brain trauma. Method80 Wister rats were randomly divided into blank group, model group, PNS low dose group and PNS high dose group. The brain trauma model was established by improved Feeney’s method. ET-1and CGRP in the plasma and hippocampus of rats were determined by RIA. The pathological change of brain and hippocampus was observed with HE and Niss dyeing. Result Compared with that of the blank group, the levels of ET-1 in the plasma and hippocampus of of model group significantly increased(P<0.05),but the levels of CGRP in the plasma and hippocampus of model group significantly decreased(P<0.05). The levels of ET-1 and CGRP in the plasma and hippocampus of PNS low group and high dose group were significantly different(P<0.05). The levels of ET-1 and CGRP in the plasma and hippocampus of PNS high dose group vs PNS low dose group were significantly different(P<0.05). PNS could relieve the deterioration of brain cell morphology, meainwhile it could decrease the death amounts of neurons in hippocampus after rats with brain trauma. ConclusionPNS can significantly decrease the levels of ET-1, increase the levels of CGRP in the plasma and hippocampus and relieve secondly brain damage after brain trauma.

【Key word】Brain trauma; Endothelin; Calcitonin gene related peptide; Panax notoginseng saponins

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(81271339)

通訊作者：崔剛，E-mail:cg6814@163.com

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.004

(收稿日期：2016-02-02； 編輯：母存培)