CRISPR/Cas9技術的發(fā)展及在基因組編輯中的應用

張凱麗 李瑞 胡桐桐 徐永杰

（信陽師范學院生命科學學院，信陽 464000）

技術與方法

CRISPR/Cas9技術的發(fā)展及在基因組編輯中的應用

張凱麗 李瑞 胡桐桐 徐永杰

（信陽師范學院生命科學學院，信陽 464000）

CRISPR/Cas9是由細菌和古細菌等微生物中特有的獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)展起來的基因組編輯技術，可以被一段短的RNA引導到復雜基因組中的特定位置，從而對靶標識別切割。該技術可以很容易對幾乎所有生物體中的內(nèi)源基因組DNA序列及其表達產(chǎn)物進行有選擇地被編輯或調(diào)控，已成為一種熱門的基因組編輯工具，正積極推動著從基礎生物學到生物技術和醫(yī)學等方面的發(fā)展。介紹CRISPR/Cas9的研究歷史、結構和功能以及、精確識別的分子基礎，并就其在基因組編輯中的應用進行了較為詳盡的綜述，以期為從事該領域的科研人員提供參考。

核酸內(nèi)切酶；Cas9；PAM；CRIPR/Cas；基因組編輯

基因組編輯是指對基因組或表達產(chǎn)物（如轉錄物）進行針對性修飾的過程。真核生物基因組包含上億萬個堿基，做到精確操縱很困難，但在真核生物中特別是哺乳動物細胞中能夠簡單有效地做到，這對生物學基礎理論、生物技術及醫(yī)藥領域等方面研究無疑都將起到巨大推動作用。目前，針對通過引入特定位點的DNA雙鏈斷裂來實現(xiàn)高效的基因編輯，已開發(fā)了4類DNA結合蛋白：來源于微生物移動遺傳元件的巨核酶技術［1］、基于真核轉錄因子的鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）［2］、來自黃單胞菌的真核轉錄激活因子樣效應物（transcription activator-like effectors，TALEs）［3］以及來自II型細菌免疫系統(tǒng)——成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）由短RNA介導的DNA核酸內(nèi)切酶Cas9［4，5］。巨核酶、ZFN和TALEN都是通過蛋白-DNA相互作用來識別特定的DNA序列。巨核酶整合了核酸酶和DNA結合結構域，而ZFN和TALEs蛋白由單個模板組成分別靶向DNA的3個或1個核苷酸，能夠以所需的組合方式被任意組裝，并連接上FokⅠ核酸酶結構域從而對特定基因位點切割。然而，這些技術平臺都或多或少都存在缺限。巨核酶蛋白的殘基及其靶向的DNA序列之間缺乏明確的對應關系，巨核酶作為一種基因編輯平臺并沒有被廣泛接受。而ZFN結構域被裝配成一個大的陣列時，由于相鄰模塊之間的干擾會造成背景依賴性的結合偏好［6］，盡管已開發(fā)出許多策略來彌補這些缺陷，但ZFN的功能組件與DNA的特異性結合仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)［7］。同樣的，盡管TALEs的DNA結合單體在大多數(shù)情況下是模塊化的，但仍然可能因為特定的背景依賴性受到影響，而且所需的大量重復序列致使構建新的TALE陣列工作變得費力且昂貴［8］。

考慮到DNA結合蛋白在組裝上的挑戰(zhàn)，新的識別模式應能顯著簡化核酸內(nèi)切酶的定制。CRISPR核酸酶 Cas9由一段短的gRNA（guide RNA）引導，依靠堿基互補配對識別靶DNA，幾乎可以在所有生物體內(nèi)有選擇地直接編輯基因組DNA，從而在系統(tǒng)水平上揭示基因組的功能組成，并確定遺傳變異的原因。目前，依靠Cas9的多重靶向也可以大規(guī)模地實現(xiàn)，它僅靠一連串短的gRNA介導而不是用大量的蛋白質(zhì)組裝。2015年，賓夕法尼亞州立大學的研究團隊開發(fā)了從多順反子基因生產(chǎn)大量gRNA的通用策略，大大提高了CRISPR的多重編輯效率［9］。因此，Cas9的快捷靶向以及其作為一種特定位點核酸酶的高效性和多重修飾的可能性，已經(jīng)為從生物學基礎研究到生物技術和醫(yī)學應用研究開辟了一個廣闊的領域，已在生物學研究上引發(fā)了繼20世紀70年代DNA重組技術后又一場新的革命。本文主要就CRISPR/Cas9技術的發(fā)展及其在基因組編輯中的應用進行了綜述。

1 CRISPR/Cas9的研究歷史

有關Cas9核酸內(nèi)切酶在基因組編輯中的應用，借鑒了過去10多年有關細菌和古細菌中神秘重復元件（現(xiàn)被稱作CRISPR）的生物學功能研究成果（圖1）。完整的II型CRISPR系統(tǒng)通常包括tracrRNA（反式激活嵌合RNA，trans-activating chimeric RNA）基因、Cas蛋白編碼基因和CRISPR識別序列三部分（圖2），tracrRNA位于5'端，一種非編碼RNA，能夠促進 crRNA的形成，也是Cas9蛋白發(fā)揮RNA介導的DNA切割作用必不可少的輔助因子；Cas蛋白編碼基因位于中間，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2；CRISPR識別序列位于3'端，由一個前導區(qū)（leader）、多個重復序列（repeat）和重復序列間的可變間隔序列（spacer）組成（圖2），Spacer主要來源于噬菌體或質(zhì)粒，包含21-72 bp堿基，不同的CRISPR基因座的間隔序列的數(shù)量差異較大，從幾個到幾百個不等。Cas基因被翻譯成蛋白質(zhì)，而大多數(shù)CRISPR序列首先被轉錄成一段單鏈RNA之后被加工成更短的CRISPR RNAs（crRNA），crRNA可以調(diào)控Cas酶的活性去降解靶核酸。

1.1 CRISPR的發(fā)現(xiàn)

關于CRISPR的研究最早可以追溯到1987年，Nakata等在研究大腸桿菌中Iap酶參與的堿性磷酸酶同工酶轉換時發(fā)現(xiàn)，Iap基因下游有一段非常奇怪的29 nt重復序列［10］。該序列與其他重復元件不同的是這些序列 大多以串聯(lián)重復的方式出現(xiàn)，其后 被5個32 nt的非重 復序列間隔開。但這個發(fā)現(xiàn)當時并沒有引起足夠重視，直到10多年后，隨著越來越多的微生物基因組被測序，又陸續(xù)報道了來自不同細菌和古細菌菌株基因組的重復元件。這種重復元件在微生物基因組中可出現(xiàn)許多次，但每一重復元件都可以由不同的重復片段和間隔片段組成。Mojica等［11］把間隔重復序列分類，作為一個獨特的家族，發(fā)現(xiàn)這些成簇的重復序列在超過40%的細菌和90%的古細菌中都存在，這也說明了CRISPR對細菌的重要性。

這些早期的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了科研人員對微生物重復元件的興趣，隨后，Jansen［12］和Mojica［11］創(chuàng)造了用首字母縮寫CRISPR來統(tǒng)一命名這些間隔重復序列［12，13］。與此同時，幾組CRISPR相關基因也被確定是高度保守的，并且通常與重復元件相鄰，這成為3種不同類型的CRISPR最終分類（類型I-III）的依據(jù)［14-16］。I型和III CRISPR系統(tǒng)包含多種Cas蛋白，形成crRNA復合物（CASCADE復合體為I型，CMR或CSM RAMP復合體為III型），以促進靶核酸的識別和切割，而II型系統(tǒng)Cas蛋白的數(shù)目卻很少，只有Cas9（圖2）。很快研究者就都把目光鎖定在了II型系統(tǒng)上，因為依賴Cas9蛋白的CRISPR系統(tǒng)要比其他類型更簡單。然而，盡管越來越多CRISPR位點被詳細地描繪和注解，但其具體的生物學意義仍未闡明。

圖1 CRISPR/Cas9技術發(fā)展歷程

1.2 CRISPR的生物學意義

2005年，多個研究小組在對分離的重復間隔區(qū)序列進行系統(tǒng)分析時發(fā)現(xiàn)這些 CRISPR中的間隔DNA總是能夠與噬菌體的DNA序列互補匹配［17-19］。這個發(fā)現(xiàn)是非常令人興奮的，尤其是考慮到CRISPR基因座轉錄后病毒不能再感染攜帶有與病毒基因組一致的間隔序列的古細菌。同時，這些發(fā)現(xiàn)也引起了生物學家對CRISPR序列用作免疫記憶和防御機制的思考，并且個別間隔區(qū)可以通過利用核酸堿基互補配對來促進抵御噬菌體感染［18，19］。盡管這些顯著的成就表明CRISPR位點可能參與了微生物免疫，但那些間隔序列如何介導病毒防御的特定機理仍不清楚。于是，美國馬里蘭州美國國家癌癥生物技術信息中心的Eugene Koonin等提出了一個新的想法，即細菌和古細菌能夠吸收噬菌體的DNA，然后將其留作己用，并轉錄出相應的RNA，與入侵的外源DNA結合，指導Cas酶裂解病毒DNA，這與真核生物采用的RNA干擾（RNAi）機制類似［17］。

2007年，丹麥的食品添加劑公司Danisco的Horvath等發(fā)現(xiàn)了II型CRISPR系統(tǒng)作為一個適應性免疫系統(tǒng)的實驗證據(jù)：CRISPR間隔序列在以核酸為基礎的免疫系統(tǒng)中指導特異性的靶向，而Cas酶控制間隔序列的獲取和噬菌體防御［13］。隨后，一系列研究闡明了CRISPR的防御機制，同時建立了3種類型CRISPR位點適應性免疫的機制。通過對大腸桿菌I型CRISPR基因座的研究，van der Oos等揭示了CRISPR序列被轉錄并轉變成含有單個間隔序列的小crRNAs，并介導Cas核酸酶的活性［20］。同年，來自于表皮葡萄球菌的III-A型CRISPR系統(tǒng)中CRISPR介導的防御被證實可以阻礙質(zhì)粒的結合，確立Cas酶的靶向活性是DNA而非RNA，后來在嗜熱鏈球菌中發(fā)現(xiàn)不同的III-B型系統(tǒng)的研究顯示crRNA指導的RNA也具有酶切活性［21，22］。

隨著CRISPR的研究步伐推進，研究人員很快揭開每種類型CRISPR系統(tǒng)的許多細節(jié)。Bolotin等［17］證實間隔序列相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）可指導II型Cas9核酸酶切割DNA。Moineau等進一步明確了PAM序列的重要性，并揭示了PAM突變的噬菌體基因組可以有效避免被切割［23］。此外，在I型和II中，CRISPR序列內(nèi)缺少PAM位點，有效避免了了CRISPR系統(tǒng)的自我靶向。2009年后，CRISPR系統(tǒng)的基本功能和機制已逐漸清晰，許多研究小組已開始將自然的CRISPR系統(tǒng)應用于各種生物技術，包括抗噬菌體乳酸菌的培養(yǎng)、細菌菌株的進化分類等［24］。然而，有關在基因組編輯的應用尚未被開發(fā)。

圖2 II型CRISPR系統(tǒng)［30］

1.3 CRISPR/Cas9用于基因組編輯

2010年，兩個研究II型CRISPR系統(tǒng)功能機理的小組發(fā)現(xiàn)設計一個簡單可編輯的RNA對于基因組編輯是至關重要的。首先，Garneau和Moineau［25］及其同事利用遺傳學研究嗜熱鏈球菌證明了Cas9是Cas基因簇中唯一可以單獨介導靶DNA裂解的酶。而Deltcheva和Charpentier等［26］發(fā)現(xiàn)II型CRISPR系統(tǒng)編碼的tracrRNA可以指導RNaseⅢ和Cas9完成前體crRNA的成熟，而tracrRNA還可與成熟的crRNA的重復序列配對形成異源RNA二聚體，進而和Cas9結合成蛋白復合體，發(fā)揮識別和切割入侵的外源DNA的功能。這兩項研究表明至少有3個組成部分（Cas9、成熟crRNA和tracrRNA）是對II型CRISPR核酸酶系統(tǒng)是必不可少的，這為將CRISPR用于基因組編輯奠定了基礎。

2011年，Sapranauskas和Siksnys［27］和同事首先證明II型CRISPR系統(tǒng)是可轉移的，將II型CRISPR基因座從嗜熱鏈球菌移植到大腸桿菌中能夠重建CRISPR干擾。到2012年，多個研究小組進一步作了生物化學鑒定，表明從嗜熱鏈球菌或化膿性鏈球中純化的Cas9可以通過crRNAs引導在體外切割靶DNA，這與之前的細菌研究結果是一致的［28，29］。此外，Jinek等［29］。提出了將tracrRNA和間隔RNA組合起來形成一個單鏈向導RNA（sgRNA，single-guide RNA）的想法，并且成功地構建出了sgRNA，將其與Cas9蛋白混合在一起，實現(xiàn)了對特定的DNA位點進行了切割這一重要發(fā)現(xiàn)，為進一步改造和利用CRISPR系統(tǒng)進行基因編輯奠定了堅實的基礎。

2013年，兩個研究小組首次報道了從嗜熱鏈球菌和化膿性鏈球菌構建II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于哺乳動物細胞中的基因組編輯［4，5］。異源表達成熟的crRN A-tracrRNA雜交體以及sgRNAs指導Cas9切割哺乳動物細胞基因組可以激發(fā)內(nèi)源性的NHEJ或HDR途徑介導的DNA修復，從而實現(xiàn)基因組的定點編輯（圖3），多種sgRNAs也可以一次性用于靶向多個基因［9］。從這些研究開始，Cas9逐漸受到研究者的青睞，被用于各種實驗模型系統(tǒng)中的基因組編輯［8，30］。

圖3 CRISPR/Cas9介導的基因編輯［58］

2 Cas9的結構與功能的多樣性

2.1 Cas9蛋白晶體結構

Cas9蛋白有兩個核酸酶結構域——RuvC和HNH，HNH是一個單一的核酸酶結構域，而RuvC結構域卻貫穿整個線性蛋白并被分成3個子結構域，RuvC I鄰近Cas9蛋白N末端區(qū)域，RuvC II和III位于HNH結構域兩側臨近蛋白的中間［31，32］。來自瑞士蘇黎世大學和美國加州大學伯克利分校的研究人員利用X射線晶體分析法首次獲得兩種主要類型（鏈球菌和放線菌）的Cas9酶的三維晶體結構圖，分辨率分別達到2.6埃和2.2埃分，然后利用單顆粒電子顯微術揭示出Cas9與gRNA如何合作從而與靶DNA序列相互作用［32］。他們還發(fā)現(xiàn)盡管這兩種Cas9酶催化區(qū)域外的結構有顯著差異，但都具有相同的核心結構，該結構可以裂開兩瓣形成鉗狀，當gRNA與Cas9結合后，可以激活Cas9活性。

此外，麻省理工的研究人員首次報道了Cas9復合體的高分辨率圖像［33］，發(fā)現(xiàn)Cas9主要分為兩葉，即識別葉和核酸酶葉，其中識別葉參與識別gRNA和靶DNA組份，而核酸酶葉可分為Ruvc核酸酶結構域和HNH核酸酶結構域，前者主要結合切割靶基因的非互補鏈，而后者則結合切割互補鏈，導致雙鏈斷裂，破壞靶基因功能。他們還發(fā)現(xiàn)Cas9與gRNA之間的界面上的關鍵性結構，當Cas9準備切割靶DNA鏈時，這些結構允許Cas9在gRNA和靶DNA周圍自我組裝。而最近來自加州大學伯克利分校、德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所的研究人員解析了具有催化活性的化膿鏈球菌Cas9與85 nt sgRNA形成復合物的晶體結構，分辨率達到了2.9?，由此揭示出了為識別靶DNA并預先組織形成一種Cas9-gRNA復合物的構象，這是一種不同于DNA結合狀態(tài)的獨特構象［34］。研究人員證實在該構象中識別DNA必需的10 nt的RNA“種子”序列呈現(xiàn)一種前序形態(tài)，而這一gRNA“種子區(qū)域”是啟動識別DNA靶序列的基礎?？偟膩碚f，Cas9晶體結構的揭示是CRISPR/Cas9技術有效用于基因組編輯技術的里程碑式發(fā)現(xiàn)，有望為科學家更好地完善該技術提供有力的支持。

2.2 Cas9蛋白的多樣性

Cas9是II型CRISPR系統(tǒng)的主要特征，是一個大分子量的多功能蛋白，既能參與加工pre-crRNA產(chǎn)生成熟的crRNA，也能切割降解外源靶DNA。Cas9蛋白具有豐富的多樣性，目前從同源序列數(shù)據(jù)庫已鑒定出超過1 000個Cas9核酸酶，這些蛋白質(zhì)長度變異較大，單大致在900-1 600個氨基酸，大多數(shù)Cas9蛋白的長度分布可分為兩個分別以1 100和1 350個氨基酸為中心的群體［31］。

盡管蛋白質(zhì)長度有明顯差異，但是所有Cas9蛋白有著相似的結構域，包括RuvC和HNH核酸酶結構域以及REC域，還有一個螺旋富集區(qū)與富含精氨酸的螺旋橋［35，36］。不同于可在細菌和古細菌中存在的I型和III CRISPR系統(tǒng)，II型CRISPR系統(tǒng)迄今只存在于細菌中，大多數(shù)Cas9的直系同源物屬于擬桿菌、變形菌和厚壁菌門類。

3 CRISPR/Cas9精確識別的分子機制

3.1 可插入驗證模塊（pluggable authentication

modules，PAM）

PAM是Cas9系統(tǒng)特異識別的一個重要特征，位于靶DNA序列的3'側翼區(qū)，在Cas9靶向結合和切割中發(fā)揮關鍵作用。此外，外源DNA中靶位點附近的PAM存在和宿主基因組中PAM的缺乏能使Cas9準確區(qū)分自身DNA和必須被降解的非自身DNA，盡管這兩者之間可能幾乎相同［37，38］。釀膿鏈球菌cas9的生化和結構特征表明PAM序列還參與了觸發(fā)cas9與目標結合和切割構象之間的轉換［32，33］，表明PAM也是激活Cas9酶活性所必需的，并且決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割發(fā)生的位點。單分子成像也證實Cas9-crRNA-tracrRNA復合體在整個基因組內(nèi)首先與PAM序列結合，而后引發(fā)DNA雙鏈的分離［38］。PAM位點和目標配體的結合可以激活HNH和Ruv C結構域從而引發(fā)Cas9的核酸酶活性，在Cas9-sgRNA-DNA三元復合體的內(nèi)部可以觀察到HNH的結構域為這一說法提供了有力佐證［33］。

PAM序列在不同類型CRISPR系統(tǒng)中存在差異，對基因組編輯效率也有重要影響。對于常用的釀膿鏈球菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)來說，5'-NGG是它的主要PAM序列，在人類全基因組中平均每8 bp就有一個［4］。此外，釀膿鏈球菌Cas9還可以靶向5'-NAG和5'-NGA PAM序列，雖然效率不高，但是這遠遠增加了編輯的多樣性［39，40］。PAM序列對于每一個同源的Cas來說都是特異的，甚至在同一物種之中也是如此。例如，嗜熱鏈球菌CRISPR1是5'-NAAGAAW，但是嗜熱鏈球菌CRISPR3是5'-NGGNG［23，41］。腦膜炎奈瑟球菌的PAM序列則為5'-NNNNGATT，最近已成功被應用于人類多能干細胞的基因組編輯研究［42，43］。

PAM序列的特異性也可以被修飾，嗜熱鏈球菌Cas9的PAM相互作用域和釀膿鏈球菌對應區(qū)域的同源重組可以把PAM序列從5'-NGGNG改變?yōu)?'-NGG［44］。哈佛醫(yī)學院和麻省總醫(yī)院的研究人員Kleinstiver等［45］建立了一套工程化系統(tǒng)，用進化研究的方法從大量隨機突變的化膿鏈球菌Cas9變種中找到了可以識別新PAM序列的突變組合，這些新的Cas9變種將序列識別的范圍擴大了兩倍，可以識別那些野生型Cas9無法修飾的人類和斑馬魚基因的位點，這大大增加了CRISPR技術在基因組中的應用。此外，還首次證實Cas9可以用定向蛋白質(zhì)進化的方法改進，利用類似的方法還可以改進Cas9酶其他的特點來滿足更多的需要。

3.2 影響Cas9核酸酶特異性的主要因素

基因組編輯在基因組中能產(chǎn)生可遺傳的修飾，因此，Cas9靶向的特異性倍受關注，尤其是在臨床應用和基因治療等方面。Cas9靶標識別是RNA與DNA的結合，其特異性由堿基互補配對決定，所以Cas9的脫靶效應相對比較容易進行實驗處理分析和系統(tǒng)評價。近年來，多個研究小組利用錯配gRNA文庫、體外篩選和基因組測序廣泛地鑒別了化膿鏈球菌Cas9的特異性，證實Cas9以一種對錯配數(shù)量、位置和分布敏感的方式可以容忍sgRNA中的一些錯配［39，46，47］。先前研究也同樣表明Cas9的特異性是由PAM近端引導序列的前8-12個堿基核心序列決定的，其余遠離PAM處12-8 bp堿基的錯配對靶位點的識別影響不明顯［4，29］，而要想在一個基因組中產(chǎn)生特異性位點至少需要16個堿基的配對才可實現(xiàn)特異。同時也有文獻報道Cas9也可以識別NAG或NNG PAM附近的序列并進行脫靶裂解，證明了在脫靶分析中也應考慮5'-NNG和5'-NAG PAM序列［31］。這些研究直接說明CRISPR/Cas9存在脫靶效應，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性以及研究工作的大量增加，這一問題可能會限制Cas9的應用。而有趣的是，Cas9系統(tǒng)要求gRNA和靶DNA高度同源以便進行切割，但當sgRNA和靶DNA只有以小段序列互補時仍能保持短暫的結合，這表明Cas9雖然有許多潛在的脫靶位點，但是只能切割它們的一小部分［48］。因此，即使Cas9存在脫靶效應，但仍然值得開發(fā)應用于DNA結合或DNA切割。

酶的濃度也是決定Cas9脫靶發(fā)生突變的重要因素之一，因為在通常情況下靶位點上Cas9能承受5個以內(nèi)的堿基錯配［46］，而當酶濃度較高時Cas9可承受更多的錯配，這會導致脫靶位點具有更高的活性。所以，降低Cas9的濃度會顯著提高靶點與脫靶位點的比率，但這是以降低靶點的切割效率為代價的［39，49］。此外，Cas9表達的持續(xù)時間可能也是調(diào)節(jié)脫靶位點活性的另一因素，但還有待深入研究。

脫靶位點一般通過搜尋與目的基因座高度同源的基因組序列來計算決定，而全基因組測序或其他全基因組范圍標記雙鏈斷裂的DNA的方法進一步分析脫靶位點情況。無偏的全基因組鑒定分析已成功用于鑒定ZFNs脫靶位點的突變，這很容易被應用到Cas9核酸酶活性［50］。來自韓國首爾大學研究人員Kim等［51］開發(fā)出一種強大、敏感、無偏見和具有成本效益的方法——Digenome-seq，利用基因組測序查找CRISPR-Cas9可能突變產(chǎn)生的打靶和脫靶序列。這樣的數(shù)據(jù)，或許結合sgRNA和靶DNA雜合鏈的動力學特征后，有可能為評估和預測Cas9脫靶位點活性提供了一個衡量標準。此外，耶魯大學醫(yī)學院的Moreno-Mateos等［52］分析了影響體內(nèi)sgRNA穩(wěn)定性、活性和裝載的分子特征，確定了影響Cas9活性的決定因素，并為體內(nèi)基因組打靶的高效sgRNA設計提供了一個框架，構建了一種預測性的sgRNA評分算法——CRISPRscan，可有效地捕捉到影響CRISPR/Cas9體內(nèi)活性的序列特征。

3.3 提高Cas9靶位點識別精確度的策略

為了提高靶位點DNA雙鏈斷裂的特異性，可以通過類似二聚ZFNs和TALENs的雙切口方法來增加在目的基因中可以特異識別的堿基數(shù)目。使用一對gRNA和一個釀膿鏈球菌Cas9 HNH+/RuvC-切口酶突變體（D10A），適當?shù)母糸_協(xié)同的切口可以模擬DNA雙鏈斷裂高效介導插入缺失的形成，能有效減少意外的脫靶基因修飾［47，53］。因為它分別在相對的兩條DNA鏈上產(chǎn)生切口，從而形成功能性的雙鏈斷裂，這種設計能最大限度降低脫靶效應，同時保持高效而又特異的基因修飾，這種策略可以將有關野生型Cas9的特異性提高50-1 500倍［47，53］。

除了雙切口策略，截短的sgRNA可以通過減少2-3個核苷酸來顯著增加釀膿鏈球菌Cas9靶向的特異性，可能是由更高的錯配敏感度造成的［54］。這些被截短的sgRNA可以和多切口策略結合，進一步降低脫靶突變。另外，未來對Cas9的結構功能分析和通過合理設計或定向進化的蛋白質(zhì)工程可能會進一步提高Cas9的特異性。

NHEJ和同源介導修復（homology-directed，HDR）是幾乎所有的細胞和生物體都利用的兩種DNA修復機制，相比HDR細胞往往更依賴NHEJ，然而，在使用CRISPR/Cas9時HDR則是首選的、更精確的機制。但以往的應用中CRISPR/Cas介導的HDR效率遠遠低于20%，因此，不利于通過生成足夠數(shù)量的多基因精確突變轉基因小鼠來構建人類疾病模型。為了提高HDR的活性，Maruyama等［55］將抗癌藥物Scr7添加到細胞（經(jīng)過遺傳編輯的受精卵）中，Scr7可與NHEJ信號通路中的一個關鍵酶Ligase IV結合，從而阻止經(jīng)由NHEJ的DNA修復，因此，細胞內(nèi)的DNA修復主要由更為精確的HDR機制來接管，這一過程中CRISPR/Cas的效率顯著提高了19倍。這種基于藥物的方法真正地改進科學家構建轉基因小鼠的方式，使之攜帶上想研究的特異突變，生成更復雜突變的變異小鼠。

最近，來自哈佛大學、麻省總醫(yī)院的研究人員Davis等［56］提出對靶向位點進行修飾可以直接調(diào)控及降低基因組編輯蛋白的活性，這有可能成為提高它們特異性的一種潛在方法。他們通過將4-羥基他莫昔芬（hydroxytamoxifen）反應性的內(nèi)含肽插入到Cas9的特異位點，開發(fā)出了可被一種細胞滲透性小分子激活的Cas9核酸酶。證實在人類細胞中，條件性激活的Cas9將改造靶基因組位點的特異性提高了25倍。相信通過這些及其他新的策略來不斷提高Cas9的特異性，Cas9未來在臨床及基因治療等方面的應用將是令人期待的。

4 CRISPR/Cas9技術在基因組編輯中的應用

3類CRISPR系統(tǒng)中TypeⅡ型系統(tǒng)的組成相對簡單，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一個蛋白，其具體作用機制也比其他類型CRISPR系統(tǒng)研究的更為清楚，因此對動植物基因組的編輯過程中都是采用該類型。2013 年初，發(fā)表在同一期《Science》研究論文報道了來自于麻省理工學院的Zhang等和哈佛大學的Mali等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠和人類細胞中首次實現(xiàn)了基因組的定點編輯，并且獲得較高的打靶效率［4，5］。隨后，在世界范圍內(nèi)掀起了CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因編輯研究的熱潮，在短短的幾年里，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛的應用到許多物種和各類細胞中，成功地對目的基因進行定向缺失、插入、活化或抑制等遺傳改造操作，其中包括人類、細菌、斑馬魚、酵母、小鼠、果蠅、農(nóng)作物、家畜和猴子［8，57，58］。CRISPR/Cas9大大增加了遺傳上易處理的模式生物的數(shù)目。例如，南京大學模式動物研究所等的研究人員成功地利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對孿生的食蟹猴進行了精確的基因修飾［44］。這是人類首次利用基因編輯技術在靈長類動物中獲得成功，使得對靈長類動物的研究前景變得光明，這一重要發(fā)現(xiàn)于將來某一天能夠幫助構建出與多種突變相關的其他人類疾病模型。

4.1 細胞和動物模型的快速制備

Cas9介導的基因組編輯可以加快轉基因模型的產(chǎn)生，擴展超越了傳統(tǒng)生物學研究，更容易得到可遺傳模式生物。例如，通過重現(xiàn)患者群體中的基因突變，基于CRISPR/Cas9的編輯可以用來快速建立特異的遺傳突變模型，而不是依賴疾病模型中表型模擬一個特殊的病癥［44，59］。這可以應用于開發(fā)新的轉基因動物模型，來設計帶有引入或修正特異基因突變的ES和iPS疾病模型，或者在體內(nèi)和體外進行基因修正［60］。

Cas9能夠通過質(zhì)粒和sgRNA一起瞬時轉染很容易導入到靶細胞，產(chǎn)生需要的細胞模型。此外，Cas9的多種功能為研究人類常見疾病提供了一種新的方法，如糖尿病、心臟病、精神分裂癥和自閉癥等。例如，大規(guī)模的全基因組關聯(lián)研究（GWAS）在鑒別與疾病風險密切相關的單倍型上發(fā)揮了重要作用，但通常很難確定在緊密連鎖不平衡中哪幾個遺傳變異和這個區(qū)域的單倍體中哪些基因控制表型。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)，人們可以通過編輯干細胞并使其分化成我們想要的細胞類型的方法來研究每個突變體的結果，或者在等位基因的背景下測試單個處理的效果，從而精確確定哪些基因控制表型［61］。

Cas9蛋白和轉錄的sgRNA還可以直接被注射到小鼠的受精卵中來獲得可遺傳的基因修飾，從而獲得轉基因動物模型，如一個或多個等位基因修飾的嚙齒動物和猴子模型［44，59，62，63］。通過傳統(tǒng)的胚胎干細胞來獲得轉基因品系，得到小鼠和大鼠突變體的時間將由一 年減少到短短幾周。這樣的改進使得在嚙齒目動物模型中進行大規(guī)模的體內(nèi)誘變研究變得更經(jīng)濟，并且能與高特異性編輯結合從而避免脫靶誘變的混淆［53，54］。此外，Cas9能夠利用對體細胞的直接修飾從而無需胚胎操作即可實現(xiàn)基因治療。

然而，通過受精卵注射CRISPR試劑產(chǎn)生的轉基因動物模型的一個突出的挑戰(zhàn)是遺傳嵌合體，部分原因是由于核酸酶誘導的誘變速率緩慢。迄今為止，有關轉基因動物模型的研究都普遍依賴于向受精卵（胚胎受精的單細胞階段）中注射Cas9。由于轉錄和翻譯活動在小鼠的受精卵中都受到抑制，Cas9 mRNA轉換成酶的形式很可能被延遲到第一次細胞分裂之后［64］。而NHEJ介導的修復作用是引入隨機長度的插入或缺失DNA片段，這個翻譯延遲很可能是CRISPR修飾小鼠形成遺傳嵌合體的主要原因。為了克服這個局限，Cas9蛋白和sgRNA可以被直接注射到單細胞受精卵中，通過NHEJ介導的DNA修復過程可能會減少一些我們不希望有的遺傳嵌合體，因為向Cas9識別位點引入插入或缺失突變將不得不與受精卵的分裂速度競爭。

4.2 功能基因組學篩選

隨著對CRISPR/Cas9工具的進一步開發(fā)，該系統(tǒng)已用于全基因組功能篩選，以極高的靈敏度和精密度幫助研究人員發(fā)掘新的基因，并精確鑒定哪種或哪類基因在期望的表型匯總中扮演重要角色。例如，使用具有成千上萬個gRNA（可靶定人類或其他物種基因組中所有功能基因）的CRISPR/cas9系統(tǒng)，可讓研究人員在基因組規(guī)模上進行功能獲得或功能缺失突變篩選，再通過快速掃描基因組中所有的基因，包括來自各種各樣試驗的新候選基因。北京大學的研究人員構建了一套基于新型CRISPR/Cas9 sgRNA文庫的高效遺傳篩選技術［65］，這項技術主要包括預先建立穩(wěn)定表達Cas9的細胞系并確定sgRNA能夠在該細胞系實現(xiàn)基因修飾、建立sgRNA慢病毒文庫以及細胞文庫、功能性篩選和富集、PCR擴增和深度測序分析、數(shù)據(jù)分析及候選基因的驗證等幾個步驟。通過該技術，研究人員成功地鑒別出了對于炭疽和白喉毒素毒性至關重要的宿主基因，并在隨后的細胞實驗中對這些候選基因進行了進一步的功能驗證。該研究發(fā)現(xiàn)了與病菌侵染宿主蛋白及通路有關的基因，這將為對抗病菌提供新型藥物靶點，而且更重要的是，這一強大的高通量基因篩選技術的建立可以廣泛應用于生物學問題的研究，惠及眾多生物醫(yī)學相關領域。此外，其他一些相關研究小組也分別報道了與之相類似的技術路線，通過構建哺乳細胞CRISPR/Cas9敲除文庫實現(xiàn)高通量功能性基因的篩選［66-68］。

sgRNA文庫未來還可能應用于基因組非編碼元件的編輯，如基因調(diào)節(jié)區(qū)的系統(tǒng)靶向可促進遠端增強子、一般啟動子結構以及對轉錄水平有影響的任何額外調(diào)節(jié)元件的發(fā)現(xiàn)［31］。此外，還可以應用于研究大量的無具體特征的基因組區(qū)域，這些序列研究或大規(guī)模的全基因組關聯(lián)研究（GWAS）中都有涉及。

4.3 轉錄調(diào)控

Cas9-sgRNA作為一種可與靶序列特異性識別并切割的技術，其應用不僅僅局限于對靶序列的精確編輯，還可拓展到基因轉錄調(diào)控方面。通過點突變使Cas9蛋白的RuvC和HNH核酶結構域活性全部喪失獲得dCas9（Catalytically dead Cas9）的能力，但dCas9仍保留了與靶序列特異性結合的能力，這樣可將dCas9-sgRNA作為與DNA特異性識別的平臺，同樣具有較大的應用價值。dCas9-sgRNA與DNA轉錄元件結合可能會對RNA聚合酶造成空間位阻，從而阻斷該位點上的基因轉錄，起到轉錄抑制的效果。例如，在dCas9蛋白的C末端融合轉錄抑制結構域（krüppel associated box，KRAB），獲得的dCas9-KRAB-sgRNA具有更強的轉錄抑制效果，將可以替代脫靶效應明顯的siRNA技術，稱之為CRISPR干擾或CRISPRi［69，70］。dCas9蛋白的C末端還可融合轉錄激活結構域疹病毒轉錄激活子VP16或NF-κB p65亞基活性域AD（p65AD），則可構建具有轉錄激活活性的CRISPR-on系統(tǒng)，用于激活特定靶基因的轉錄［70-72］。通過以上這兩個方面的改造可以使Cas9-sgRNA 成為對基因表達的調(diào)控工具。但這些系統(tǒng)都是組成型的，無法打開和關閉轉錄本，2015年，3個研究小組各自均開發(fā)出了基于CRISPR-Cas9的轉錄激活系統(tǒng)，可以用光進行控制，很好地解決了這一難題［73-75］。該系統(tǒng)包括一對融合蛋白，一個蛋白把dCas9結合到一個稱為CIb1的蛋白；另外一個蛋白將一個轉錄激活結構域結合到隱花色素2（CRY2），用藍光照亮表達這兩個蛋白質(zhì)的細胞和gRNA，可使兩個蛋白質(zhì)配對，將轉錄激活結構域拴在DNA上，并激活轉錄。該設計為以前這種構成性的合成轉錄因子引入了一種調(diào)控機制，該方法可通過光激活靶向的、用戶界定的基因，可有助于眾多生物醫(yī)學的應用，如利用其在體內(nèi)外精確控制細胞的功能。

4.4 細胞內(nèi)基因組的活體成像

細胞內(nèi)功能和結構元件的空間組織對基因組的功能性輸出能夠動態(tài)的增強或抑制作用，然而基因組被修飾的方式以及在體內(nèi)結構組織調(diào)節(jié)功能的方式仍然不清楚。開發(fā)用于能直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為至關重要，目前現(xiàn)有技術主要有染色質(zhì)構象捕獲（3C）和使用高分辨率顯微鏡的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）分析，但這些技術很難探索基因組和基因表達隨時間而發(fā)生的空間組織變化，動態(tài)信息的獲取，對高階基因調(diào)控的全面了解是必需的。因此，迫切需要開發(fā)新的技術來分析基因轉錄和空間組織的動力學。目前，基于CRISPR/Cas9的特定DNA位點的熒光標記Cas9標簽替代了DNA-FISH技術發(fā)展成了一種功能強大的活細胞成像技術［76］，這將用于研究復雜的染色體結構和核組織。Ochiai等［77］建立了一種被稱為“Real-time Observation of Localization and Expression（ROLEX）”系統(tǒng)的新的實時成像方法，該系統(tǒng)可同時測量內(nèi)源基因的轉錄活性和核定位，具有很高的特異性，且不影響靶基因的表達水平。ROLEX系統(tǒng)可用于研究通過遠程基因組相互作用的高階基因調(diào)控動力學，揭示活細胞中基因轉錄和細胞核動態(tài)之間的關系，并評估細胞的基因組結構變異，是否會引起基因表達中的細胞間異質(zhì)性。無疑ROLEX將會成為一種強大的工具，不僅用于細胞生物學，也可應用于生物醫(yī)學研究和臨床療法等領域。

4.5 遺傳性疾病的治療

CRISPR/Cas9在短短幾年的發(fā)展中，在從基礎研究到農(nóng)業(yè)領域以及生物醫(yī)學方面都展現(xiàn)出強大的應用潛力，但Cas9作為一種基因治療技術，用于徹底根治遺傳性疾病是未來發(fā)展方向。利用CRISPR/ Cas9技術通過體細胞基因組編輯，糾正致病突變，可以直接治療有害的遺傳疾病。例如，對于由功能缺失突變引起的單基因隱性遺傳?。ㄈ缋w維囊泡癥、鐮狀細胞性貧血及杜氏肌營養(yǎng)不良癥等），Cas9可能用于修正致病突變。Long等［78］采用CRISPR/Cas9技術成功阻止了杜氏肌營養(yǎng)不良小鼠模型中的肌肉退化，研究人員移除了攜帶突變dystrophin的小鼠的胚胎，并在胚胎中注射了靶向糾正dystrophin突變的CRISPR編輯元件，然后將胚胎返回到野生型雌鼠體內(nèi)，這樣子代小鼠具有正常的dystrophin和骨骼肌功能，而且雖然只有17%的細胞得到了糾正，但也能令其骨骼肌恢復功能。盡管這種技術目前未應用于人體，但是這一概念為未來治療肌營養(yǎng)不良癥帶來了希望。而中國科學家首次實現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術用于編輯人類胚胎基因組，改造了導致一種潛在致命血液疾病——β-地中海貧血的基因（HBB基因），但編輯成功率較低［79］，這讓人們看到通過胚胎基因編輯治療遺傳性疾病的光明未來。

有些單基因疾病是由于基因組序列的重復引起的，對于這些疾病，用Cas9可以刪除這些重復元件。例如，三核苷酸重復疾病可以通過同時用兩個DSBs來切除重復區(qū)域進行處理達到治療目的［80］。此策略的成功有可能治療更復雜的遺傳性疾病如弗里德賴希共濟失調(diào)癥（在致病基因的非編碼區(qū)存在較多三核苷酸重復）［81］。

此外，為了修復潛在的遺傳性疾病，Cas9介導的基因組編輯可在體細胞或組織中引入一種保護性突變來對抗非基因或復雜的疾病。例如，NHEJ介導的淋巴細胞中CCR5受體的失活可能對防止艾滋病感染是一種不錯的策略［82］，而缺失PCSK9或血管生成素可能有抵抗高膽固醇血癥或高血脂癥的療效［83，84］。雖然這些目標也可通過siRNA介導的蛋白質(zhì)抑制達到，但NHEJ介導的基因失活無需持續(xù)治療即可獲得永久療效。如同所有的基因療法，用低風險率的方法建立各自的治療方法非常重要。

盡管基因組編輯為基礎的遺傳性疾病的徹底根治帶來希望，許多研究團體正努力使CRISPR/Cas9療法成為現(xiàn)實，但眾多的挑戰(zhàn)依然擺在面前。成功的臨床治療取決于向特定的疾病組織靶標中恰當高效的注入CRISPR/Cas9系統(tǒng)，而為了獲得高效的治療效果和同時治療多種遺傳病，高效的同源重組需要高度重視。即使永久的遺傳修飾對于單克隆抗體或siRNA治療來說具有優(yōu)勢，但其需要對分子治療進行反復實驗，其長期影響尚不清楚。此外，研究人員需進一步測試用于臨床治療的Cas9，用多種多樣的臨床模型來證明Cas9的安全性和生理效應是十分重要的。

4.6 病毒感染性疾病的治療

病毒通過特異的受體侵染細胞，在細胞內(nèi)發(fā)生復制、轉錄、翻譯等過程完成其生活周期，病毒感染疾病是危害人類健康的主要威脅之一，與人類密切相關的有呼吸道病毒、皰疹病毒、肝炎病毒和艾滋病病毒等。目前治療病毒感染性疾病主要依賴疫苗防御和藥物治療，但很多還沒有完全有效或徹底的治療方法，如艾滋病等。CRISPR/Cas9隨著基因定點編輯技術的成熟與完善，使得抗病毒治療逐漸成為可能。美國坦普爾大學Hu等［85］構建了靶向HIV-1啟動子的gRNA-Cas9質(zhì)粒，轉染整合到有HIV感染的小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞以及T淋巴細胞，均成功地根除了HIV基因組，表明該技術具有徹底清除潛伏的HIV基因組的可能性。盡管CRISPR/ Cas9可以對培養(yǎng)的感染細胞中的HIV進行編輯，但這種技術的精度仍然不足以應用于臨床，因其往往切入基因組的隨機區(qū)域，易于產(chǎn)生有害的、非靶目標效應，還有待進一步提高精準度。此外，相似的研究也被應用于皰疹病毒［86］、乙型肝炎病毒［87］、丙型肝炎病毒［88］及人乳頭瘤病毒［89］等基因組的編輯，并已達到徹底清除病毒的目的，無疑給這些病毒感染性疾病的徹底治療帶來希望。

5 總結

短短的幾年，由在細菌和古細菌等原核生物中發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)靶向編輯系統(tǒng)演變而來的CRISPR/ Cas9技術取得了令人欣喜的發(fā)展，使得研究人員能快速地對遺傳物質(zhì)進行隨心所欲地操作或修飾，與成熟的ZFN和TALEN等基因靶向編輯系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有得天獨厚的優(yōu)越性，如構建簡單、方便、快捷，安全性高、毒性小等。相信基于Cas9的基因編輯工具極有可能是未來進行精確和高效的基因修飾的解決辦法，在臨床治療、基礎理論研究和農(nóng)牧漁業(yè)等領域必將發(fā)揮巨大的作用，并且將會對分子生物學研究和基因治療領域產(chǎn)生深遠的影響。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Development of CRISPR/Cas9 Technique and Its Applications in Genome Editing

ZHANG Kai-li LI Rui HU Tong-tong XU Yong-jie
（College of Life Sciences，Xinyang Normal University，Xinyang 464000）

CRISPR/Cas9 is one of novel genome editing technologies developed from the unique prokaryotic acquired immune system in bacteria and archaea，and it can be guided to specific locations within complex genomes by a short RNA，and thus cleavage of the target can be recognized. Using this technology，DNA sequences within the endogenous genome and their expressed products are now easily edited or regulated in virtually any organism of choice. The technology has become the most popular genome editing tool，promoting the development of basic biology，biotechnology and medicine. This paper introduced the research progress on CRISPR/Cas9 from the aspects of development history，structure and function，and the mechanism of precise recognition，also reviewed the application of this new technology in genome editing in detailed，aiming at providing a reference for related researchers.

engineered endonuclease；Cas9；PAM；CRISPR/Cas；genome editing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.007

2015-08-08

國家自然科學基金項目（U1204326），國家大學生創(chuàng)新訓練項目（20150477021）

張凱麗，女，碩士研究生，研究方向：動物分子遺傳；E-mail：kaili_scc@sina.com

徐永杰，男，博士，副教授，究方向：動物分子遺傳；E-mail：yongjx81@126.com