戊型肝炎病毒長(zhǎng)爪沙鼠感染模型的初步研究

朱光澤屈勇剛李一權(quán)蘭添范園園胡寧寧張諾娜李霄金寧一

（1.長(zhǎng)春中藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003）

戊型肝炎病毒長(zhǎng)爪沙鼠感染模型的初步研究

朱光澤1，2屈勇剛2，3李一權(quán)2蘭添2范園園2胡寧寧2張諾娜2李霄2金寧一2

（1.長(zhǎng)春中藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003）

旨在探索應(yīng)用長(zhǎng)爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）構(gòu)建戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）動(dòng)物模型的可行性，從豬糞便稀釋懸液中提取HEV RNA并鑒定，經(jīng)腹腔和口服接種HEV于長(zhǎng)爪沙鼠，并每周采集血液、相關(guān)器官（心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟）及糞便。用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和免疫組化等檢測(cè)方法分析各個(gè)樣品。結(jié)果表明，感染后第7天開(kāi)始，可從血液、腎臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、肺、糞便中檢測(cè)到HEV RNA；通過(guò)免疫組化和組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)HEV可在肝臟中進(jìn)行表達(dá)，并且能引起肝組織病理變化，但感染HEV后長(zhǎng)爪沙鼠均缺乏較明顯的臨床表現(xiàn)癥狀。結(jié)果提示，長(zhǎng)爪沙鼠對(duì) HEV具有易感性，感染后肝臟出現(xiàn)小葉性肝炎的病理變化，具有作為HEV感染動(dòng)物模型的潛在價(jià)值。

戊型肝炎病毒；長(zhǎng)爪沙鼠；動(dòng)物模型

病毒性肝炎是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，尤其是戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的戊型肝炎［1，2］。戊型肝炎病毒為單鏈RNA，無(wú)包膜病毒，屬于肝炎病毒科肝炎病毒屬［3-6］。以往的研究提出了4種HEV的傳播途徑，分別為糞-口傳播、食源性傳播、輸血和母嬰垂直傳播［7］。感染戊型肝炎病毒可導(dǎo)致體內(nèi)長(zhǎng)期的凝血和膽汁淤滯，并且還會(huì)提高孕婦的死亡率［8-10］。近年來(lái)研究還表明，戊型肝炎病毒感染除了提高孕婦的死亡率之外，還會(huì)導(dǎo)致男性和非妊娠婦女的死亡［11］。 在孕婦中產(chǎn)生高死亡率的原因尚不明確，也沒(méi)有具體的治療方法，同時(shí)，HEV促進(jìn)疾病進(jìn)展的細(xì)胞蛋白質(zhì)和途徑仍不明確。這些都?xì)w根于HEV難以分離及純化、同時(shí)缺乏穩(wěn)定的HEV細(xì)胞感染培養(yǎng)系統(tǒng)，阻礙了對(duì)HEV生物學(xué)的理解。

1983年首次用戊肝患者的糞便提取物成功感染了2只獼猴，成為了戊型肝炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的先例［12］。此后國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有10多種靈長(zhǎng)類動(dòng)物品系和豬對(duì)HEV易感，適宜于做動(dòng)物模型。但靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有昂貴、來(lái)源有限、實(shí)驗(yàn)條件要求高等缺點(diǎn)。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)野鼠可自然感染HEV，但選用野鼠作為動(dòng)物模型也具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，并且其來(lái)源也相對(duì)有限。

長(zhǎng)爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）亦稱蒙古沙鼠，是一種具有廣闊開(kāi)發(fā)前景的多功能性嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域里作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已有20-30年的歷史。其某些特有的生理學(xué)、解剖學(xué)和行為學(xué)特征對(duì)于多種疾病的研究具有重要價(jià)值，如腦血管疾病、營(yíng)養(yǎng)代謝病和自發(fā)性腫瘤等［13］。長(zhǎng)爪沙鼠不僅對(duì)多數(shù)病原易感，而且在 某些病原感染下，會(huì)表現(xiàn)出與人類相似的病理特征和臨床癥狀。因此，長(zhǎng)爪沙鼠作為一種“多能”性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有非常重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

本研究擬用豬源HEV病毒感染長(zhǎng)爪沙鼠，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，組織病理學(xué)觀察等方法，探索將長(zhǎng)爪沙鼠作為HEV感染模型的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬HEV陽(yáng)性糞便采自長(zhǎng)春某豬場(chǎng)，經(jīng)RT-PCR鑒定為陽(yáng)性、屬基因Ⅳ型，-70℃保存。

將陽(yáng)性糞便用PBS制成1∶10的懸液，4℃，4 000 r/min離心20 min，取上清，用0.22 μL無(wú)菌濾器濾過(guò)除菌，測(cè)定RT-PCR滴度后備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40-50日齡的長(zhǎng)爪沙鼠獲贈(zèng)于浙江省疾病預(yù)防控制中心。

1.1.3 檢測(cè)試劑盒 雙抗原夾心ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)公司；TRIZOL Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；UltrasensitiveTMS-P超敏試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 長(zhǎng)爪沙鼠人工感染實(shí)驗(yàn) 選取檢測(cè)為HEV陰性的健康長(zhǎng)爪沙鼠24只。每只沙鼠分別以腹腔接種及口服接種的途徑接種方法1.1.1中處理后的HEV陽(yáng)性材料0.5 mL，并連續(xù)觀察50 d。分別在7、14、21、28、35和50 d無(wú)痛處死2只長(zhǎng)爪沙鼠，并采血及分離血清檢測(cè)HEV抗體和檢測(cè)HEV RNA，同時(shí)采集心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、小腸、回腸、直腸檢測(cè)HEV RNA。

1.2.2 HEV抗體檢測(cè) 使用北京萬(wàn)泰生物制藥公司提供的抗-HEV抗體酶聯(lián)免疫試劑（雙抗原夾心法），按照說(shuō)明書檢測(cè)血清中抗-HE V抗體并判斷結(jié)果。

1.2.3 HEV RNA的RT-PCR檢測(cè)

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中注冊(cè)的HEV各基因型的保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并引物，以M1、M2為外引物；M3、M4為內(nèi)引物。

M1：5'-AAC（T）TATGCA（C）CAGTACCGGGTTG-3'（5 725-5 746 bp）；M2：5'-CCCTTATCCTGCTGAGCATTCTC-3'（6 433-6 455 bp）；M3：5'-GTC（T）ATGC（T）TGCATACATGGCT-3'（6 010-6 031 bp）；M4：5'-AGCCGACGAAATC（T）AATTCTGTC -3'（6 336-6 357 bp）。

1.2.3.2 HEV正鏈RNA的RT-PCR檢測(cè) 按照TRIZOL Reagent說(shuō)明書提取HEV RNA。取RNA 14 μL加1 μL的Oligo（dT），于75℃加熱5 min后迅速冰浴10 min，然后加入5×M-MLV buffer 6 μL，dNTP 1.5 μL，RNasin 1 μL，M-MLV 1 μL，雙蒸水6.5 μL，混勻后42℃ 1 h，95℃ 5 min，-20℃ 30 min。

取上述合成的cDNA進(jìn)行兩輪PCR。首輪使用的引物為M1和M2，PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。第二 輪使用的引物為M3和M4，PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 HEV負(fù)鏈RNA的RT-PCR檢測(cè) 對(duì)檢測(cè)到HEV 正鏈的RNA的樣品，進(jìn)行HEV負(fù)鏈RNA的RT-PCR檢測(cè)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)觀察 先將組織制成常規(guī)石蠟切片，經(jīng)脫蠟和脫水后對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。加過(guò)氧化酶阻斷液，室溫下孵育10 min。然后在每張切片中先后加入50 μL正常非免疫動(dòng)物血清、50 μL兔抗p293（ORF2 aa382-674）抗體（1∶1 000）及50 μL生物素標(biāo)記的二抗，分別在室溫下孵育1 h、1 h及10 min。再往切片加入50 μL鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育10 min。最后往切片加入100 μL DAB溶液，作用3 min左右后，沖洗干凈，蘇木素復(fù)染，再?zèng)_洗干凈；切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固后顯微鏡下觀察。

1.2.5 病理組織學(xué)觀察 將待觀察的病料用10%中性甲醛溶液固定及石蠟包埋后，以3.5 μm 的厚度連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)蘇木素-伊紅染色后顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 糞便懸液的RT-PCR滴度測(cè)定

糞便懸液經(jīng)10遞倍稀釋后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。計(jì)算結(jié)果表明，接種用豬糞便懸液的RTPCR滴度為10-6.78。

表1 接種用豬糞便懸液中HEV RNA 的RT-PCR滴度

2.2 ELISA檢測(cè)人工感染長(zhǎng)爪沙鼠HEV抗體

長(zhǎng)爪沙鼠在接種糞便懸液之后 ，在接種后的前2 d內(nèi)表現(xiàn)出精神不振，但之后的未再出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。血清抗體最早于感染后的第21天轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，可持續(xù)到感染后第50天（表2）。

表2 感染沙鼠HEV抗體的ELISA檢測(cè)

2.3 人工感染長(zhǎng)爪沙鼠的HEV正鏈RNA RT-PCR檢測(cè)

感染后第7天可從血液、心、腎臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、肺等臟器或糞便中檢測(cè)到HEV正鏈RNA，最長(zhǎng)的可持續(xù)到感染后第50天（圖1和表3）。

圖1 長(zhǎng)爪沙鼠感染21 d后組織樣品正鏈RNA 的RT-PCR檢測(cè)

表3 長(zhǎng)爪沙鼠感染組織樣品的正鏈RNA1 RT-PCR檢測(cè)

2.4 人工感染長(zhǎng)爪沙鼠的HEV負(fù)鏈RNA RT-PCR檢測(cè)

感染長(zhǎng)爪沙鼠的負(fù)鏈RNA RT-n-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2和表4。

表4 長(zhǎng)爪沙鼠感染組織樣品的負(fù)鏈RNART-n-PCR檢測(cè)

2.5 病理組織學(xué)觀 察

觀察發(fā)現(xiàn)大部分臟器組織中缺少典型的病理變化。而肝臟的主要病變?yōu)閺V泛肝細(xì)胞變性、空泡變性、濁腫、水樣變性而致氣球樣變，肝細(xì)胞胞漿疏松、空泡變性、胞核大小不等，出現(xiàn)雙核、肝竇擴(kuò)張或變窄，病理符合小葉性肝炎（圖3）。

圖2 長(zhǎng)爪沙鼠感染21 d后組織樣品的負(fù)鏈RNA RT-PCR檢測(cè)

2.6 免疫組織化學(xué)觀察

免疫組織化學(xué)觀察可見(jiàn)在細(xì)胞質(zhì)中有HEVAg大量分布，細(xì)胞核與周圍邊的細(xì)胞界限清晰可見(jiàn)（圖4）。

圖4 人工感染長(zhǎng)爪沙鼠的免疫組織化學(xué)照片（100×）

3 討論

目前，可實(shí)驗(yàn)感染HEV的動(dòng)物主要有非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和豬，其中以非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物最為常用［14］。自1983年Balayan等［12］首次使用戊肝患者的糞便提取物成功感染2只獼猴以來(lái)，許多非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型（黑猩猩、恒河猴、梟猴、短尾猴、小絹猴、非洲綠猴等）逐步的建立了起來(lái)，其中較為常用的還是獼猴模型。豬作為基因Ⅲ型、Ⅳ型的自然宿主，也可應(yīng)用于HEV感染的研究。1990年Balayan等［15］首次用1株亞洲人HEV成功感染豬，實(shí)現(xiàn)了HEV豬模型的制作。然而以非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物或豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有繁殖周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)管理繁、價(jià)格昂貴及來(lái)源有限等缺點(diǎn)［16］。

長(zhǎng)爪沙鼠因其獨(dú)特的生物學(xué)特性在病毒學(xué)領(lǐng)域、細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域及寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。如在病毒學(xué)領(lǐng)域方面，廣泛應(yīng)用于腎綜合征出血熱［17］、流行性出血熱病毒［18］和乙型肝炎病毒［19］等研究。說(shuō)明，其在研究人類疾病及新藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有重要的價(jià)值。

本研究首先將HEV陽(yáng)性豬糞便稀釋懸液接種于長(zhǎng)爪沙鼠，并每周采集血清和多種組織（心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、小腸、回腸、直腸），隨后通過(guò)ELISA和RT-PCR、免疫組織化學(xué)及病理組織學(xué)觀察進(jìn)行了感染后檢測(cè)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠不僅可感染HEV，并且能產(chǎn)生HEV抗體，并且在血液、心、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)、糞便中檢測(cè)到了HEV RNA。再通過(guò)對(duì)負(fù)鏈RNA的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在肝、脾、肺、腸系膜淋巴結(jié)中存在HEV負(fù)鏈RNA，進(jìn)而表明HEV可以在以上組織中進(jìn)行復(fù)制，其中病毒在肝臟中殘留時(shí)間最久。Kasorn-dorkbua等［20］用HEV陽(yáng)性樣品接種至SPF豬體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接接種在心、胰組織的SPF豬未感染HEV，而直接接種在肝組織的SPF豬成功感染HEV，表明豬體內(nèi)肝臟是HEV復(fù)制的主要器官；Lee等［21］使用原位雜交技術(shù)檢測(cè)機(jī)體內(nèi)不同組織中的HEV RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在于肝臟部位的HEV RNA雜交信號(hào)最強(qiáng)。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果均說(shuō)明肝臟是HEV復(fù)制的主要器官部位［22］。

在接種后的前2天內(nèi)長(zhǎng)爪沙鼠表現(xiàn)出了精神不振等癥狀，但之后的未再出現(xiàn)較為明顯的臨床癥狀，這與趙素元等［23］使用子午沙鼠作為HEV動(dòng)物模型的結(jié)果相似，說(shuō)明嚙齒類動(dòng)物模型在具有可大量用于實(shí)驗(yàn)，以降低偶然因素帶來(lái)的影響，增加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性等優(yōu)勢(shì)之外，在臨床表現(xiàn)方面還存在一些不 足之處。但在HEV免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中有大量戊型肝炎病毒抗原（HEV-Ag）的分布，同時(shí)在組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，除肝臟之外大部分臟器組織中缺少典型的病理變化，肝臟的主要病變?yōu)閺V泛肝細(xì)胞變性、空泡變性、濁腫、水樣變性而致氣球樣變，肝細(xì)胞胞漿疏松、空泡變性、胞核大小不等，出現(xiàn)雙核、肝竇擴(kuò)張或變窄，病理現(xiàn)象均與小葉性肝炎相符合。有研究表明，在發(fā)展中國(guó)家大約有一半HEV感染患者表現(xiàn)出急性肝炎的癥狀［24］，病理學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞排列紊亂、匯管區(qū)有多形核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象［25］。Ji等［26］用Ⅳ型豬HEV通過(guò)靜脈注射感染獼猴后，肝組織病理學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞有輕到中度水腫、肝門周圍存在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等與人急性肝炎病理學(xué)現(xiàn)象相似的病變。說(shuō)明長(zhǎng)爪沙鼠在感染HEV后所顯示的病變與人及非靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有一定的相似性，這一結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)爪沙鼠具備作為HEV動(dòng)物模型的潛在價(jià)值。我們有必要進(jìn)一步對(duì)最佳接種途徑、時(shí)間、環(huán)境及對(duì)不同基因型HEV的易感性、系統(tǒng)比較病理學(xué)觀察等進(jìn)行研究。長(zhǎng)爪沙鼠HEV感染模型的建立，將為今后的HEV研究提供一種更為理想的途徑，加速HEV的研究進(jìn)程。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探索了使用長(zhǎng)爪沙鼠作為HEV感染模型的可行性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)爪沙鼠具有可感染HEV及體內(nèi)復(fù)制病毒的能力，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其組織病理學(xué)特征與人類具有相似性，說(shuō)明其具有作為HEV動(dòng)物模型的潛在價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Preliminary Study on Infection Model of Mongolian Gerbil by Hepatitis E Virus

ZHU Guang-ze1，2QU Yong-gang2，3LI Yi-quan2LAN Tian2FAN Yuan-yuan2HU Ning-ning2ZHANG Nuo-na2LI Xiao2JIN Ning-yi2
（1. The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021；2. Institute of Veterinary Science，The Academy of Military Medical Sciences，Changchun 130122；3. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003）

To explore the feasibility of using Mongolian gerbils（Meiiones unguiculataus）to construct an animal model of hepatitis E virus（HEV），HEV RNA was extracted from the diluted suspension of swine feces，then Mongolian gerbils were experimentally inoculated with the HEV via intraperitoneal and oral. Subsequently，the samples of blood，relevant organs（heart，liver，spleen，lungs，kidneys，mesenteric lymph nodes，and spleen）and feces were collected weekly. Samples were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. As a result，from day 7 after infection，HEV RNA was detected from the blood，kidney，spleen，mesenteric lymph nodes，liver，lung and feces. The analysis of immunohistochemistry discovered that HEV was expressed in the liver，and caused the pathological changes in liver tissue，but it was lack of obvious clinical manifestations in Mongolian gerbils after HEV infection. All above results suggest that Mongolian gerbils have susceptibility to HEV，and have pathological changes of lobular hepatitis in the liver after HEV infection，indicating that Mongolian gerbils have a potential value to be the animal model of HEV infection.

hepatitis E virus；Mongolian gerbils；animal model

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.032

2015-07-20

朱光澤，男，博士，教授，研究方向：分子病毒學(xué)；E-mail：zhuguangze820@126.com

金寧一，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子病毒學(xué)；E-mail：ningyiK@126.com