發(fā)菜細胞培養(yǎng)的研究進展

韓培培，賈士儒

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

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發(fā)菜細胞培養(yǎng)的研究進展

韓培培，賈士儒

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

摘 要：傳統(tǒng)食材發(fā)菜是一種受國家一級保護的珍稀陸生藍細菌，具有較高的營養(yǎng)價值、藥用價值和重要的生態(tài)學作用，為了實現(xiàn)發(fā)菜生物資源的可持續(xù)利用，發(fā)菜的人工培養(yǎng)研究已廣泛開展.本文對近年來發(fā)菜細胞培養(yǎng)的研究，從發(fā)菜細胞的分離、不同模式的液體培養(yǎng)、發(fā)菜細胞的規(guī)模化培養(yǎng)以及發(fā)菜細胞的固態(tài)培養(yǎng)等方面進行了綜述，并提出了進一步的研究思路.

關鍵詞：發(fā)菜；細胞培養(yǎng)；液體培養(yǎng)

數(shù)字出版日期：2016-03-02；數(shù)字出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20160302.1746.006.html.

發(fā)菜，學名發(fā)狀念珠藍細菌（Nostoc flagelliforme），又名發(fā)狀念珠藻，是一種生長在荒漠、半荒漠地帶的陸生性藍細菌（藍藻），其分布具有很強的地域性，在我國主要分布在寧夏、內蒙古及甘肅部分地區(qū).其藻體呈黑色，貼附于地表，纏繞成團，因其外觀與人的頭發(fā)相似，故人們將其稱為“發(fā)菜”.發(fā)菜具有很強的固氮能力，對于光脅迫具有很強的抗性，對高溫、低溫、變溫條件均表現(xiàn)出了驚人的適應能力.發(fā)菜在生長過程中分泌的胞外多糖可黏結土壤顆粒形成結皮，對于干旱荒漠帶土壤的水土保持具有重要的意義，被列為國家一級重點保護植物［1］.食用發(fā)菜已有上千年歷史，由于發(fā)菜與“發(fā)財”諧音，并具有一定的營養(yǎng)價值和藥用價值而備受關注.近年來發(fā)菜多糖已被證明具有廣泛的生理活性，從野生發(fā)菜中提取的酸性多糖（nostoflan）對流感病毒、人巨細胞病毒和單皰疹病毒等多種具有封套的病毒有很強的抗性［2-3］.發(fā)菜中所含的多糖具有增強機體免疫力的能力，實驗證明發(fā)菜水抽提物具有抗腫瘤活性和能夠增加唾液中分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，S-IgA）濃度，進而能夠改善花粉敏感癥狀［4］.研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)菜多糖具有抑制癌細胞和增強免疫功能作用［1］.

由于發(fā)菜在野生狀態(tài)下生長緩慢，部分地區(qū)對發(fā)菜進行掠奪性采挖導致大量草場退化和土地荒漠化.從2000年7月起，我國禁止采集發(fā)菜，取締發(fā)菜貿易.因此，發(fā)菜的人工培養(yǎng)不僅具有補充和保護發(fā)菜資源的生態(tài)價值，而且具有滿足消費者需求的經濟價值.自1982年起，為高效獲得發(fā)菜這一生物資源，人們開始對發(fā)菜人工培養(yǎng)方法進行探索.

1　發(fā)菜原植體的人工培養(yǎng)

為高效率獲取發(fā)菜，人們嘗試了多種方法，早期的研究主要以原植體為研究對象（圖1），將其復水活化后切成合適長度進行培養(yǎng)，模擬自然條件培養(yǎng)發(fā)菜原植體.在人工培養(yǎng)過程中外界水分是影響其繁殖的主要生態(tài)因子［5］，但浸泡原植體會造成藻體結構由于附生微生物的分解作用而遭到破壞，而節(jié)律性供水能有效抑制野生發(fā)菜原植體附生微生物的活動［6］.

圖1　 發(fā)菜原植體形態(tài)圖Fig.1　The morphology of Nostoc flagelliforme thallus

在野生發(fā)菜室內人工培養(yǎng)的基礎上，通過對種植地土壤狀態(tài)、噴水量、水滴直徑、空氣濕度、蒸發(fā)量等指標和發(fā)菜耗水規(guī)律進行研究，并結合發(fā)菜對節(jié)律性供水的要求，目前大面積發(fā)菜原植體的人工培養(yǎng)已經實施，其流程為：制種—播種—供水—營養(yǎng)液噴施—采收，培養(yǎng)周期6～7個月.可選擇與野生發(fā)菜生長地土壤相似的西北荒漠、半荒漠地區(qū)作為試驗地，采用固定式微噴灌方式供水，選擇合適的供水周期，以達到既有利于發(fā)菜生長，又可以節(jié)約水資源的目的，預計藻體的凈產量可達到播種量的1倍以上［1］.但此方法仍存在發(fā)菜生長緩慢、成本高、供水難、易受自然環(huán)境變化影響等問題.因此，野外條件下發(fā)菜的大規(guī)模培養(yǎng)仍然有許多困難需要克服.

2　發(fā)菜細胞的分離與培養(yǎng)

2.1發(fā)菜細胞的分離

雖然從1982年就已經開始對發(fā)菜原植體人工培養(yǎng)進行研究，但結果都不理想，并未真正意義上達到發(fā)菜人工培養(yǎng)的目的.這是因為發(fā)菜原植體的生長要求控制其干燥程度和無菌程度，否則原植體極易被細菌分解，并且原植體增重緩慢，而發(fā)菜的人工培養(yǎng)的目的不僅僅意味著原植體的增重和增長，更重要的是使藻絲體數(shù)量的增殖.發(fā)菜的膠質鞘結構在一定程度上限制了發(fā)菜細胞的生長.雖然可將發(fā)菜藻體作為培養(yǎng)對象進行栽培式試驗，但仍無法擺脫自然環(huán)境的限制，難以實現(xiàn)商業(yè)化生產.為了提高發(fā)菜的生長速率，研究者嘗試采用去除膠質鞘、從發(fā)菜藻體中分離出細胞或單體藻絲進行培養(yǎng)的方法［1］.發(fā)菜藻細胞或單體藻絲的獲得也使得利用已有的微藻產業(yè)化培養(yǎng)技術實現(xiàn)發(fā)菜細胞和代謝產物的工廠化生產成為可能.

獲得和培養(yǎng)發(fā)菜細胞種是對發(fā)菜進行液體人工培養(yǎng)的前提.獲得發(fā)菜單體細胞主要的方法是將原植體消毒后復水活化進行勻漿.野生發(fā)菜存在附生微生物［7］，單一的純化方法很難獲得理想效果，需要多種方法聯(lián)合使用.采用單細胞分離與抗生素法結合能實現(xiàn)發(fā)菜細胞純培養(yǎng)，如圖2和圖3所示.抗生素法是藻種純化過程中一種制備無菌藻種的有效方法［1］，因為不同微生物對抗生素的敏感性存在差異，所以可以通過添加不同種類抗生素組合來去除細菌和雜藻.根據(jù)敏感性試驗結果，純化發(fā)菜單體細胞所用抗生素種類和劑量為氨芐青霉素（10，mg/L）、硫酸慶大霉素（1，mg/L）、硫酸卡那霉素（1，mg/L）、壯觀霉素（1，mg/L）［8］.

圖2　 發(fā)菜單體細胞的分離Fig.2　Isolation of Nostoc flagelliforme single cell

圖3　 發(fā)菜細胞純化前后的顯微鏡觀察Fig.3　Microscope observation of Nostoc flagelliforme culture before and after purification

2.2液體培養(yǎng)

發(fā)菜是典型的光合自養(yǎng)生物，可以在光照條件下固定CO2或碳酸鹽，除此之外還可以以異養(yǎng)模式和混養(yǎng)模式生長.研究者對光合自養(yǎng)模式下發(fā)菜細胞形態(tài)、生長及產物進行了大量的研究工作［1］，對發(fā)菜細胞的液體培養(yǎng)基成分［1］和培養(yǎng)條件如光照［9-10］、CO2濃度［11-12］、pH［13］等進行了優(yōu)化，為發(fā)菜細胞液體培養(yǎng)提供了有價值的信息.雖然與野生發(fā)菜相比，自養(yǎng)模式下細胞生長速率提高了上千倍.但是，培養(yǎng)周期長、細胞密度低等導致的經濟可行性低仍是阻礙發(fā)菜商業(yè)化生產的關鍵因素.為此，有必要探討新的發(fā)菜細胞培養(yǎng)模式.

異養(yǎng)培養(yǎng)過程為在無光照的條件下，發(fā)菜利用培養(yǎng)基中添加葡萄糖等有機物作為碳源和能源，可達到高細胞密度，旨在降低下游成本.當BG-11培養(yǎng)基中添加葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖時發(fā)菜均可以生長并產胞外多糖，通過比較4種有機物對于發(fā)菜細胞生物量和多糖產量的影響［1，14-15］可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖是發(fā)菜較為適宜的碳源.但當初始葡萄糖質量濃度達到4.0，g/L時，發(fā)菜生長速率反而下降，造成細胞生物量的降低.一種解決方法是使用混合碳源，可以將葡萄糖（4.0，g/L）和醋酸（2.0，g/L）作為混合碳源添加到BG-11培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7，d時的細胞生物量最高可達到1.79，g/L，與僅用葡萄糖作碳源相比，細胞生物量有所提高.另一種方法是采用異養(yǎng)流加培養(yǎng)方法［1］，即采用與分批培養(yǎng)相同的初始條件，在葡萄糖濃度接近系統(tǒng)效率最高時，開始流加葡萄糖，使得異養(yǎng)培養(yǎng)條件下獲得高產量的發(fā)菜細胞和胞外多糖.

與異養(yǎng)培養(yǎng)相比，混合營養(yǎng)培養(yǎng)過程在添加有機物作為碳源的同時，還需要光照，所以混合營養(yǎng)培養(yǎng)又可以稱為光異養(yǎng)培養(yǎng).分別對發(fā)菜進行光合自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)，在光合自養(yǎng)培養(yǎng)基中添加葡萄糖作為異養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)基，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下培養(yǎng)7，d，混養(yǎng)培養(yǎng)得到的最高細胞生物量明顯高于光合自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)（見表1）［16］.雖然混合培養(yǎng)的方法可以理解為光合自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)兩種方法的綜合，但在培養(yǎng)過程中可以發(fā)現(xiàn)，混合營養(yǎng)培養(yǎng)得到的細胞生物量并不等于兩種情況下獲得的細胞生物量的總和（表1），說明在發(fā)菜生長過程中光合作用和葡萄糖的氧化代謝間存在相互影響.

表1　不同營養(yǎng)模式下發(fā)菜細胞的生長速率及細胞生物量Tab.1　Growth rate and cell biomass of Nostoc flagelliforme in different nutritional mode

不同營養(yǎng)模式液體懸浮培養(yǎng)發(fā)菜細胞的基本生化組成、金屬元素和胞外多糖組成等與野生發(fā)菜基本相似，只是各組分的相對含量有差異.混養(yǎng)培養(yǎng)雖然可以得到較高的細胞生物量，但由于其添加了有機物作為碳源，也增添了雜菌污染的風險.因此，為了進一步得到高濃度的發(fā)菜細胞生物量和胞外產物的同時防止雜菌污染，可采用兩階段培養(yǎng)法［1］：第一階段采用光合自養(yǎng)培養(yǎng)，抑制雜菌生長，獲得具有生長優(yōu)勢的高濃度發(fā)菜細胞生物量；第二階段采用混養(yǎng)培養(yǎng)，在較高細胞生物量的基礎上獲得高產量胞外多糖.采用此方法培養(yǎng)發(fā)菜細胞16，d，多糖和發(fā)菜細胞產量分別為單一光合自養(yǎng)階段結果的30倍和5.6 倍.發(fā)菜細胞具有異養(yǎng)和混合營養(yǎng)生長能力的證實，為發(fā)菜細胞高密度培養(yǎng)提供了基礎數(shù)據(jù)，并為發(fā)菜細胞工業(yè)化生產提供了新思路.

3　發(fā)菜細胞的擴大培養(yǎng)

光合自養(yǎng)微藻的大規(guī)模培養(yǎng)一般可分為開放式培養(yǎng)系統(tǒng)和封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)兩大類.

開放式培養(yǎng)技術簡單、應用廣泛.在室內條件下，可在發(fā)菜細胞液體懸浮培養(yǎng)的基礎上逐步放大發(fā)菜培養(yǎng)，進行開放培養(yǎng).何茜［17］進行了25，L容積的開放式培養(yǎng)池實驗，初步探究了培養(yǎng)發(fā)菜細胞所需要的光照周期、液位及通氣量等實驗條件.郭偉［18］則在不同放大培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)方式方面綜合地對發(fā)菜細胞擴大培養(yǎng)進行了研究，采用5，L光生物反應器對發(fā)菜進行開放式和封閉式培養(yǎng)實驗，結果表明增加光強并連續(xù)光照有利于發(fā)菜細胞生長和多糖積累，且封閉式培養(yǎng)效果較好.在25，L開放式培養(yǎng)池培養(yǎng)過程中，通過階段性流加新鮮培養(yǎng)基和逐步提高光強的方法提高了發(fā)菜細胞生物量和多糖積累量.在室外條件下，藻類應用最多的為開放式跑道培養(yǎng)池培養(yǎng)方式（圖4）.通常跑道培養(yǎng)池中附有CO2補充系統(tǒng)，促進藻類對CO2的固定和生長.目前已在小規(guī)模跑道培養(yǎng)池中實現(xiàn)了發(fā)菜細胞的開放式培養(yǎng)［1］.但與封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)相比，開放式培養(yǎng)系統(tǒng)雖然結構較為簡單、造價較低，但存在受環(huán)境影響大、易被雜菌或害蟲污染、耗水量大等不足，對于種群競爭力弱的發(fā)菜來說需要綜合考慮.

圖4　 開放式跑道培養(yǎng)池結構示意圖Fig.4　Schematic diagram of open raceway pond

封閉式光生物培養(yǎng)系統(tǒng)（圖5）克服了開放式培養(yǎng)系統(tǒng)的一些弊端，可以用于培養(yǎng)大多數(shù)生長條件溫和、生長速率不快的藻種，但也存在著成本高等缺點.對于光合自養(yǎng)培養(yǎng)來說，在20，L光生物反應器進行循環(huán)培養(yǎng)會使營養(yǎng)元素不斷消耗從而出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，需要在循環(huán)培養(yǎng)過程中不斷補加營養(yǎng)鹽來維持發(fā)菜細胞生物量和多糖積累量在較高的水平.因此在室內進行大規(guī)模液體光合自養(yǎng)培養(yǎng)時，可以進行半連續(xù)培養(yǎng)，其中適時取出一定量的細胞并補充合適量的營養(yǎng)元素是此培養(yǎng)方法的關鍵.在培養(yǎng)過程中，攪拌通氣為發(fā)菜細胞生長提供碳源CO2，有利于細胞生長，但是攪拌也會對發(fā)菜的鏈狀形態(tài)產生影響，還影響莢膜多糖（形成膠囊或黏液層多糖）和胞外多糖（釋放到液體培養(yǎng)基中多糖）的比例［19］，因此攪拌的控制對細胞大規(guī)模培養(yǎng)及多糖的生產提供了新思路.

對于混養(yǎng)培養(yǎng)來說，兩階段培養(yǎng)同樣適用于發(fā)菜細胞培養(yǎng)及其多糖制備工藝的放大［1］.在80，L氣升式光反應器中，與單階段培養(yǎng)相比，兩階段培養(yǎng)不僅減少了染菌的隱患，而且顯著地提高了細胞的生長速率及多糖的合成效率.戶外條件下，采用液體懸浮培養(yǎng)方式，通過控制培養(yǎng)液pH、流量、溫度等條件，實現(xiàn)了在160，L和300，L管式光生物反應器（外徑分別為50，mm和110，mm）中發(fā)菜細胞的擴大培養(yǎng)［20］.實驗結果與室內80，L氣升式光生物反應器相比較， 細胞生物量、藻粉中蛋白質含量和莢膜多糖含量均高于室內氣升式光生物反應器，證明管式光生物反應器適宜于培養(yǎng)發(fā)菜細胞，具有可行性，為發(fā)菜戶外大規(guī)模培養(yǎng)的實現(xiàn)提供了基礎數(shù)據(jù)；但同時受自然條件如光照、溫度等影響較大，培養(yǎng)條件需要進一步探索.

圖5　 管式光生物反應器結構示意圖Fig.5　Schematic diagram of tubular photobioreactor

4　發(fā)菜細胞的固態(tài)培養(yǎng)

發(fā)菜為陸生固氮藍藻，人工培養(yǎng)的最理想結果是實現(xiàn)在干旱荒漠地區(qū)實現(xiàn)發(fā)菜的低成本大規(guī)模種植.液態(tài)培養(yǎng)的發(fā)菜在一定失水條件下仍具有較高的光合速率，對干旱環(huán)境仍有較高的耐受力，使得其仍然可以作為陸地培養(yǎng)的“種子”.因此對其固態(tài)培養(yǎng)的研究有利于未來進行野外種植，對改良荒漠化生態(tài)環(huán)境具有重要意義.光強、固體基質種類和濕潤程度等因素都會對發(fā)菜細胞的發(fā)育形態(tài)和聚集狀態(tài)有重要影響.Chen等［21-22］選取粗沙、PA6和玻璃渣作為固態(tài)培養(yǎng)基質，對比發(fā)菜細胞的固態(tài)培養(yǎng)基及其生長狀態(tài)，結果表明：雖然玻璃碎渣和PA6濕潤性較好，但粗沙更利于發(fā)菜細胞的生長.進一步研究結果表明：沙粒粒度大小也對發(fā)菜生長速度有影響，細沙增速高于粗沙，并能形成生物結皮（圖6）.但在實驗條件下，發(fā)菜細胞在固體培養(yǎng)基上形成團狀群落而不像自然條件下形成絲狀［1］，形成的生物結皮具有一定的透水性和保水性，說明發(fā)菜對提高土壤質量、固定沙粒、減緩沙漠化有著重要作用，為發(fā)菜的人工培養(yǎng)實現(xiàn)野外種植提供了基礎數(shù)據(jù).

圖6　 接種發(fā)菜細胞的沙粒與對照比較Fig.6　Comparison of sand inoculated with and without Nostoc flagelliforme

5　展 望

綜上所述，對于發(fā)菜細胞人工培養(yǎng)，無論實驗室規(guī)模的研究還是室外大規(guī)模實踐都已取得了一定的進展，對發(fā)菜細胞的生長狀態(tài)、生長條件、產物生產條件等方面都有了進一步的認識，這些都為未來發(fā)菜工業(yè)化培養(yǎng)提供了寶貴的數(shù)據(jù).但是，許多問題依然存在并需要解決，如發(fā)菜的抗逆性機理、高密度快速培養(yǎng)發(fā)菜細胞條件優(yōu)化以及固體培養(yǎng)天然絲狀結構的重建等都還需要進行深入研究.可借助現(xiàn)代生物技術加強對發(fā)菜生長中關鍵代謝途徑、關鍵酶以及關鍵產物生產機理等的研究，以期望推動發(fā)菜工業(yè)化生產，保護生態(tài)環(huán)境，滿足消費者需求.

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責任編輯：郎婧

Research Progress in Cell Culture of Nostoc flagelliforme

HAN Peipei，JIA Shiru

（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Food Safety & Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：The traditional food Nostoc flagelliforme，a national level protected plant，is a valuable terrestrial cyanobacteria，which has high nutritional，medicinal and ecological values.To realize the sustainable use of biological resources，extensive research on artificial culture of N.flagelliforme has been carried out.The recent research progress in cell culture of N.flagelliforme，including isolation of N.flagelliforme cells，different modes of liquid culture，large-scale cultivation of N.flagelliforme cells，and solid culture，was reviewed in this paper，and further research suggestions were also put forward.

Key words：Nostoc flagelliforme；cell culture；liquid culture

中圖分類號：Q93

文獻標志碼：A

文章編號：1672-6510（2016）02-0001-05

收稿日期：2015-11-05；修回日期：2015-12-24

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31201405）

作者簡介：韓培培（1983—），女，山東人，副教授；通信作者：賈士儒，教授，jiashiru@tust.edu.cn.

DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150193