大洋橋石藻Gephyrocapsaoceanica對(duì)海水酸化與營養(yǎng)鹽脅迫的復(fù)合響應(yīng)

蔡小霞，于培松，張海峰，胡佶，張海娜，潘建明*（．國家海洋局第二海洋研究所國家海洋局海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州3002）

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大洋橋石藻Gephyrocapsaoceanica對(duì)海水酸化與營養(yǎng)鹽脅迫的復(fù)合響應(yīng)

蔡小霞1，于培松1，張海峰1，胡佶1，張海娜1，潘建明1*
（1．國家海洋局第二海洋研究所國家海洋局海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310012）

摘要：本文選取了大洋橋石藻（Gephyrocapsaoceanica）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過C O2加富實(shí)驗(yàn)?zāi)M海水酸化環(huán)境，分析了氮充足和氮相對(duì)不足條件下海洋顆石藻對(duì)海水酸化的生理響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種營養(yǎng)鹽狀態(tài)下，C O2加富均能一定程度促進(jìn)大洋橋石藻種群增長與Chla濃度的增加。對(duì)比兩種營養(yǎng)鹽狀態(tài)，氮相對(duì)不足條件下的大洋橋石藻細(xì)胞密度和葉綠素含量均有最顯著的提高，表明低營養(yǎng)鹽濃度和低的氮磷比可能更有利于大洋橋石藻的生長繁殖。電鏡觀測結(jié)果顯示酸化對(duì)大洋橋石藻的鈣化作用具有顯著的負(fù)影響，并且在氮相對(duì)不足條件下，大洋橋石藻的細(xì)胞個(gè)體變小及比表面積升高。研究結(jié)果表明在未來寡營養(yǎng)的大洋上層水體，大氣C O2濃度升高會(huì)對(duì)大洋橋石藻的生理功能產(chǎn)生負(fù)面影響，但可能刺激大洋橋石藻的生長。

關(guān)鍵詞：海水酸化；C O2加富；營養(yǎng)鹽；顆石藻

1 引言

自工業(yè)革命以來，化石燃料消耗大增導(dǎo)致了大氣C O2濃度的快速升高，而海洋作為一個(gè)碳匯，吸收了大氣C O2增量的30%～35%［1］，這使得目前海水p H值下降了0.1［2—3］，相當(dāng)于海洋中氫離子的濃度上升26%。如果按照目前的C O2排放趨勢發(fā)展，至21世紀(jì)末海水p H可能會(huì)下降0.3～0.5［4—5］，引發(fā)海水酸化問題，對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生顯著影響。

海洋酸化嚴(yán)重影響了海洋生物的鈣化過程［2，6—7］。海水碳酸鹽系統(tǒng)各參數(shù)的濃度與比例的變化會(huì)直接或間接地對(duì)鈣化浮游微藻（顆石藻）的光合作用與鈣化作用產(chǎn)生影響，進(jìn)而可能會(huì)改變鈣化藻類與非鈣化藻類之間的競爭關(guān)系，威脅種群的生長，改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)［8—9］。研究表明多數(shù)鈣化浮游微藻與硅藻及棕囊藻相比，其光合作用速率在目前的大氣C O2濃度仍未達(dá)到飽和［10—11］，表明在大氣C O2升高的情況下，鈣化藻類的光合作用速率可能對(duì)大氣C O2濃度的升高產(chǎn)生正反饋過程。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)大氣C O2濃度過高，對(duì)顆石藻類的生長與鈣化會(huì)有抵制作用［10，12］，海水碳酸鹽系統(tǒng)各參數(shù)的濃度與比例的變化會(huì)直接或間接地對(duì)浮游藻類（尤其是鈣化浮游微藻）的鈣化作用產(chǎn)生影響［13—14］。目前國內(nèi)在高濃度C O2對(duì)海洋微藻的生理生態(tài)影響方面進(jìn)行了較多的研究［15—19］，但針對(duì)顆石藻的研究仍然較少。

此外，營養(yǎng)鹽水平對(duì)海洋浮游植物的生長及生理過程同樣都有著重要影響，世界大洋真光層水體營養(yǎng)鹽總體表現(xiàn)為氮限制（小于1μmol／L）［20］，在氮不足的情況下，顆石藻最終對(duì)海洋酸化和C O2濃度升高的趨勢產(chǎn)生了哪些反饋？目前，這方面的理解與研究仍然較為薄弱。大洋橋石藻（Gephyrocapsaoceanica）在分類學(xué)上屬于定鞭金藻門（Haptophyta）顆石藻綱（Coccolithophyceae），是海洋中優(yōu)勢的今生顆石藻。本文選取大洋橋石藻（G.oceanica）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，模擬了高氮和低氮的條件以及不同C O2濃度水平下大洋橋石藻的生長情況，探討了其對(duì)大洋橋石藻生長的復(fù)合影響，同時(shí)著重分析了海水酸化對(duì)大洋橋石藻的鈣化作用的影響，以期加深了解海洋酸化及營養(yǎng)鹽水平對(duì)顆石藻及其相關(guān)生物地球化學(xué)過程的作用。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析方法

2．1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2．1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

藻種購自廈門大學(xué)近海海洋國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋藻類保種中心（CC M A），選取顆石藻中較有代表性的種屬，大洋橋石藻（G．oceanica），株系CC M BP98。藻類保種時(shí)采用的培養(yǎng)液為f／2培養(yǎng)基配方［21］，采用的海水取自南大洋貧營養(yǎng)表層海水（鹽度約為35），并用0.45μm的醋酸纖維膜過濾，于120℃條件下高壓滅菌30 min。

2．1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)采用光照培養(yǎng)架（濟(jì)南凱貝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，H T－III），實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)C O2濃度組（380×10－6、800×10－6和1 600×10－6），通過曝氣的方式使海水中C O2加富，達(dá)到培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的酸化條件（圖1）。通氣裝置通過面板式有機(jī)玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)（金姚市金泰儀表有限公司，LZ M－4 T）和兩通閥控制氣體分流與流速的穩(wěn)定性。

2．1.3 實(shí)驗(yàn)條件

在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行藻細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)至生長期，取等量生長狀況良好的藻種接種至新鮮培養(yǎng)液的玻璃三角瓶中，接種濃度控制在生物量O D665＝0.005左右，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件為25℃、光強(qiáng)7 000 lx、光周期14L∶10 D。各個(gè)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組同時(shí)進(jìn)行，歷時(shí)9 d，實(shí)驗(yàn)過程中每天振搖3～4次。實(shí)驗(yàn)設(shè)置高氮組和低氮組，其中高氮組的硝酸鹽初始濃度約為20μmol／L，氮磷比約為12，低氮組的硝酸鹽濃度約為6μmol／L，氮磷比約為6，每個(gè)C O2濃度組均設(shè)3個(gè)平行樣。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)定了3個(gè)濃度組，即C O2濃度分別為380×10－6、800×10－6和1 600×10－6。其中，380 ×10－6為當(dāng)前大氣中C O2濃度，作為參照組，而800 ×10－6組（實(shí)驗(yàn)組1）則以預(yù)測的21世紀(jì)末、22世紀(jì)初大氣C O2濃度作為參考濃度，同時(shí)設(shè)定一個(gè)較高濃度的1 600×10－6組（實(shí)驗(yàn)組2），模擬遠(yuǎn)期極端環(huán)境條件。

圖1 C O2加富培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置（a）及裝置示意圖（b）Eig．1 The sketch of C O2enrich ment culture experiments（a）and simplified schematic diagram（b）

2．2 分析方法

實(shí)驗(yàn)過程中每隔一定時(shí)間取樣，精確測定培養(yǎng)液的p H值（德國梅特勒實(shí)驗(yàn)室p H計(jì)，S20P），反映其p H值的細(xì)微變化。在營養(yǎng)鹽充足和氮相對(duì)不足的培養(yǎng)體系中，從第3天開始，3個(gè)C O2濃度組的大洋橋石藻培養(yǎng)液的p H值均維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，此時(shí)培養(yǎng)液中的C O2已達(dá)到飽和狀態(tài)，各組的p H均略有升高，但變化幅度均不超過0.04，表明C O2加富對(duì)海水環(huán)境的p H值影響基本一致。

同時(shí)，取一定體積的藻液，依據(jù)《海洋調(diào)查規(guī)范——海水化學(xué)要素觀測》［22］進(jìn)行水樣處理與分析，于營養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀（荷蘭斯柯拉，san＋＋Skalar）上進(jìn)行測定，其中，硝酸鹽＋亞硝酸鹽（N O－3＋N O－2）、磷酸鹽（P O3－4）分別采用鎘銅柱還原－重氮偶氮法和磷鉬藍(lán)法測定，檢測限分別為0.1μmol／L和0.03 μmol／L。

葉綠素a（Chl a）采用萃取熒光法［22］進(jìn)行過濾與萃取，并于唐納熒光儀（Turner Designs Eluorometer，M odel 10）上測定，觀測其濃度變化。此外，以Lugol碘液試劑固定適量藻液，于生物顯微鏡（Olympus，C X41）下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，同時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，取平均值，計(jì)算藻液的細(xì)胞密度。

以培養(yǎng)藻液的細(xì)胞密度，求出其比生長速率（μ），計(jì)算公式（1）如下［23］：

式中，μ為比生長速率，Cn和Cn－1分別代表第n和n－1天的細(xì)胞密度度，Tn和Tn－1分別代表培養(yǎng)第n 和n－1天。

實(shí)驗(yàn)后期，收集一定量的離心后的藻細(xì)胞，用2.5%的戊二醛進(jìn)行固定，采用離子濺射儀（日本日立公司，IB－3）鍍金，之后于高倍掃描電鏡（德國里奧電鏡有限公司，LE O1530）下進(jìn)行觀察，同時(shí)拍攝掃描電鏡圖片。

取剩余藻液，用玻璃纖維濾膜（W hatman G E／E，孔徑0.7μm）進(jìn)行過濾，富集藻細(xì)胞于濾膜上，洗滌烘干稱取藻體干質(zhì)量，之后進(jìn)行濃酸酸熏24 h處理，除去碳酸鹽成分，洗滌烘干得藻體干質(zhì)量，以此差值計(jì)算藻體的無機(jī)碳含量（PIC）。同時(shí)，將酸處理后的藻細(xì)胞，于元素分析儀（德國Elementar，vario EL cube）上進(jìn)行測定（檢出限為0.045 mg），得藻細(xì)胞的有機(jī)碳含量（P O C）。從而得出細(xì)胞的鈣化比率占總化學(xué)組成的比率，以及在各個(gè)培養(yǎng)條件下藻體細(xì)胞的鈣化作用程度。

3 結(jié)果

3．1 營養(yǎng)鹽的消耗吸收

在氮充足的培養(yǎng)體系中，隨著培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，培養(yǎng)液中的硝酸鹽和磷酸鹽濃度逐漸降低，硝酸鹽濃度在第9天相對(duì)第1天平均降低4.1μmol／L，磷酸鹽則降低了0.54μmol／L（圖2a），消耗利用的氮和磷的比值接近于7.6∶1，低于Redfield比值（16∶1）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中，3個(gè)濃度組（380×10－6、800×10－6及1 600×10－6）硝酸鹽的消耗百分比分別為33.9%、27.8%及31.8%，磷酸鹽的消耗百分比分別為40.1%、39.9%及41.2%。在低氮組的培養(yǎng)體系中硝酸鹽濃度在第9天相對(duì)第1天平均降低了6.2μmol／L，磷酸鹽則降低了0.54μmol／L，3個(gè)濃度組的硝酸鹽消耗百分比分別為53.4%、69.5%、64.7%，磷酸鹽的消耗百分比分別為38.2%、43.8%、37.3%。低氮組消耗利用的氮磷比值平均為11∶1，明顯高于氮充足的實(shí)驗(yàn)組，顯然，在氮相對(duì)不足的條件下大洋橋石藻對(duì)無機(jī)氮具有過度吸收的營養(yǎng)鹽策略。

3．2 大洋橋石藻的生長狀況

在高氮的培養(yǎng)體系中，大洋橋石藻的細(xì)胞數(shù)在3種不同的C O2濃度加富條件下均有所增加，平均從0.37×103個(gè)／m L增長到第9天的平均4.05×103個(gè)／m L。如圖3a所示，在培養(yǎng)初期，各組的比生長速率分別為0.25 d－1、0.13 d－1、0.07 d－1。在培養(yǎng)中期（第7天），800×10－6組具有最高的細(xì)胞增長，其次是1 600×10－6組，380×10－6組最低（圖3a）。Chla含量變化與細(xì)胞數(shù)相似，培養(yǎng)初期3個(gè)濃度組的Chl a含量基本一致并緩慢增加，從第5天開始增長加快，各組之間也表現(xiàn)出了明顯的差異，以800×10－6組增長最為迅速，至第8天達(dá)到頂峰（3.69μg／L），1 600× 10－6組的增長幅度次之，最高濃度可達(dá)2.20μg／L。顯然，C O2濃度加富對(duì)大洋橋石藻種群增長與Chl a含量有較為顯著的促進(jìn)作用，并且在C O2濃度為800 ×10－6時(shí)表現(xiàn)最為明顯。

對(duì)于低氮的培養(yǎng)體系，大洋橋石藻的細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)初期增長緩慢，3個(gè)濃度組之間并無差異，從第6天開始，不同的C O2濃度加富的影響才表現(xiàn)出差異性，并且隨著時(shí)間的推移，差異顯著增大（圖3c）。與參照組相比，低氮培養(yǎng)組800×10－6組和1 600×10－6組的細(xì)胞數(shù)較為迅速，并且其細(xì)胞數(shù)明顯高于高氮培養(yǎng)組。800×10－6組的最大比生長速率為1.34 d－1，其在第7天達(dá)到種群數(shù)量最大值（2.17×104cells／m L），為3個(gè)濃度組中最高。1 600×10－6組的最大比生長速率為0.85 d－1，其在第8天達(dá)到種群數(shù)量最大值，1.47×104cells／m L，略高于參照組。Chl a含量變化與細(xì)胞數(shù)的增長相似（圖3d），其含量增長總體水平由低到高依次為：380×10－6組、1 600× 10－6組、800×10－6組。可以看出，在低氮的培養(yǎng)條件下，C O2濃度加富對(duì)細(xì)胞數(shù)的增長與Chl a含量的增加均有促進(jìn)作用，并且這種促進(jìn)作用以800×10－6組最為顯著，這與氮充足的培養(yǎng)條件相一致，但低氮培養(yǎng)下其種群增長明顯強(qiáng)于高氮培養(yǎng)。

3 .3 大洋橋石藻在不同CO2濃度水平的電鏡觀察結(jié)果

掃描電鏡觀察結(jié)果顯示低氮培養(yǎng)體系下，參照組（380×10－6）大洋橋石藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，其外層的鈣殼清晰可見，僅有少數(shù)細(xì)胞存在著外層鈣殼脫落的現(xiàn)象（圖4a）。在C O2濃度倍增的條件下，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為形態(tài)不完整，外層鈣殼脫落，在所觀察的樣本上隨處可見散落的鈣殼（圖4b），表明培養(yǎng)液C O2濃度倍增，p H降低對(duì)顆石藻鈣化作用具有顯著的負(fù)影響。對(duì)于C O2濃度為1 600×10－6的實(shí)驗(yàn)組，大部分細(xì)胞因鈣殼脫落，表面破碎，出現(xiàn)明顯的缺失現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。不同C O2濃度加富培養(yǎng)下的細(xì)胞個(gè)體大小有所差異，由大到小依次為380× 10－6組、800×10－6組、參照組（380×10－6），表明低氮條件下海水酸化可能引起大洋橋石藻的細(xì)胞體積的降低和比表面積的升高。

圖2 不同C O2濃度加富條件下（380×10－6、800×10－6、1 600×10－6），培養(yǎng)液中硝酸鹽（N O－3）和磷酸鹽（P O3－4）濃度隨時(shí)間的變化Eig．2 The time series change of nitrate concentration and phosphate concentration in the C O2enrich ment（380×10－6；800×10－6and 1 600×10－6）culture experiments a．高氮組硝酸鹽濃度的變化（μmol／L）；b．高氮組磷酸鹽濃度的變化（μmol／L）；c．低氮組硝酸鹽濃度的變化（μmol／L）；d．低氮組磷酸鹽濃度的變化（μmol／L）a．Nitrate concentration（μmol／L）under sufficient nutrients；b．phosphate concentration（μmol／L）under sufficient nutrients；c．nitrate concentration（μmol／L）under nitrate deficiency；d．phosphate concentration（μmol／L）under nitrate deficiency

3．4 細(xì)胞有機(jī)碳與無機(jī)碳合成

表1所示為氮充足與氮不足兩種條件下，大洋橋石藻經(jīng)不同C O2濃度加富培養(yǎng)后，其細(xì)胞中的有機(jī)碳與無機(jī)碳含量，及各自占細(xì)胞總干質(zhì)量比。結(jié)果顯示，800×10－6組的有機(jī)碳合成比重遠(yuǎn)低于其他2個(gè)濃度組，但其無機(jī)碳合成比重卻是3個(gè)濃度組中最高的?？梢?，當(dāng)C O2濃度加倍（800×10－6）時(shí)，光合作用合成有機(jī)碳量減少，但鈣化作用合成無機(jī)碳量卻在增加。而當(dāng)C O2濃度達(dá)到1 600×10－6時(shí)，光合作用過程略有增強(qiáng)，鈣化作用反而有所下降。表明大洋橋石藻對(duì)C O2加富的響應(yīng)呈現(xiàn)相反的趨勢。就細(xì)胞的無機(jī)碳與有機(jī)碳比而言，3個(gè)濃度組分別為77.7∶1、329.4∶1、66.7∶1，進(jìn)一步體現(xiàn)了800×10－6組顯著的鈣化作用。

在氮相對(duì)不足條件下，大洋橋石藻的有機(jī)碳與無機(jī)碳合成量也受到不同C O2濃度水平的影響。800 ×10－6組的無機(jī)碳含量占細(xì)胞總干質(zhì)量比在3個(gè)濃度組中最高，而有機(jī)碳含量占細(xì)胞總干質(zhì)量比僅僅略高于參照組。1 600×10－6組的有機(jī)碳與無機(jī)碳的合成比重均高于參照組，但與800×10－6組相比，則有機(jī)碳比重較高而無機(jī)碳比重較低?？梢?，在氮不足條件下，當(dāng)C O2濃度加倍（800×10－6）時(shí)，大洋橋石藻的有機(jī)碳與無機(jī)碳合成量均有所增加，其中無機(jī)碳的增加更為顯著。就細(xì)胞的無機(jī)碳與有機(jī)碳比而言，3個(gè)濃度組分別為26.6∶1、27.5∶1、24.2∶1，800×10－6組的光合作用與鈣化作用同步增強(qiáng)，三者的比值沒有顯著差異。

圖3 不同C O2濃度加富條件下（380×10－6、800×10－6及1 600×10－6），細(xì)胞數(shù)和Chl a含量隨時(shí)間的變化Eig．3 The time series change of cell density and chlorophyll a in the C O2enrich ment（380×10－6，800×10－6and1 600×10－6）culture experiments a．高氮組細(xì)胞數(shù)的變化（103cells／m L）；b．高氮組Chl a含量的變化（μg／L）；c．低氮組細(xì)胞數(shù)的變化（103cells／m L）；d．低氮組Chl a濃度的變化（μg／L）a．The cell nu mber（103cells／m L）under sufficient nutrients；b．chlorophyll a（μg／L）under sufficient nutrients；c．the cell nu mber （103cells／m L）under nitrate deficiency；d．chlorophyll a（μg／L）under nitrate deficiency

表1 高氮組和低氮組中細(xì)胞中有機(jī)碳及無機(jī)碳含量及比例Tab .1 The concentration and proportion of organic carbon and inorganic carbon under condition of sufficient nutrients and nitrate limitation

圖4 低氮培養(yǎng)下大洋橋石藻細(xì)胞的典型掃描電鏡照片Eig.4 The typical scanning electron micrograph of G．oceanic cell under nitrate deficiency a．C O2濃度為380×10－6的培養(yǎng)條件下，比例尺為5μm；b．C O2濃度為800×10－6的培養(yǎng)條件下，比例尺為10μm；c．C O2濃度為1 600×10－6的培養(yǎng)條件下，比例尺為5μm a．The set concentration of C O2is 380×10－6，the scaleis 5μm；b．C O2is 800×10－6，the scale is 10μm；c．C O2is 1 600×10－6，the scale is 5 μm

4 討論

4．1 海水酸化與營養(yǎng)鹽不足的復(fù)合響應(yīng)

為了模擬大洋橋石藻對(duì)營養(yǎng)鹽相對(duì)不足和海水酸化的復(fù)合響應(yīng)，設(shè)置了高氮組和低氮組兩種不同的營養(yǎng)鹽狀況以及3組不同的C O2濃度加富（380× 10－6、800×10－6及1 600×10－6），其中低氮組硝酸鹽的初始濃度約為6μmol／L，高氮組的硝酸鹽初始濃度約為20μmol／L。對(duì)大洋橋石藻在3組C O2濃度加富下的Chl a生物量（最高Chl a濃度）進(jìn)行基于IB M SPSS Statistics 20.0的單因素方差分析及多重比較（顯著性水平為0.05），結(jié)果顯示Chl a生物量在3個(gè)濃度組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值為0.01），表明C O2加富對(duì)大洋橋石藻的生長起到了促進(jìn)作用；多重比較分析結(jié)果則顯示380×10－6與800×10－6組有顯著差異（P值為0.01），但與1 600×10－6組差異不顯著（P值為0.06），主要由于C O2濃度1 600×10－6已達(dá)到抑制藻類的閾值，顯然800×10－6組最有利于大洋橋石藻的生長繁殖，鈣化藻類大洋橋石藻的光合作用在當(dāng)前大氣C O2濃度仍未達(dá)到飽和，與前人的研究一致［10］。

此外，進(jìn)一步對(duì)大洋橋石藻在高氮和低氮環(huán)境下的Chl a生物量（最高Chl a濃度）及種群增長（最大細(xì)胞密度）進(jìn)行單因素分析（顯著性水平為0.05），結(jié)果顯示藻類生物量及種群增長在不同營養(yǎng)鹽狀態(tài)下差異十分顯著（P值均為0.01）。如圖5所示，營養(yǎng)鹽充足條件下，不同C O2加富組的細(xì)胞數(shù)普遍不高。而在氮不足和低氮磷比的條件下，大洋橋石藻的細(xì)胞數(shù)很高，與營養(yǎng)鹽充足時(shí)相比，高了1個(gè)數(shù)量級(jí)，并且由高到低依次為800×10－6組、1 600×10－6組、380 ×10－6組。大洋橋石藻對(duì)氮不足和C O2加富表現(xiàn)出相反的響應(yīng)機(jī)制。對(duì)比兩種營養(yǎng)鹽狀態(tài)，氮不足下的大洋橋石藻各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)一步提高，顯然，作為培養(yǎng)液的唯一變量，營養(yǎng)鹽濃度和營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)起到了重要的作用，低氮磷比可能促進(jìn)了大洋橋石藻的生長繁殖，同時(shí)細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)鹽的利用效率增強(qiáng)，其與C O2加富相結(jié)合則使這種作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

4．2 氮不足和酸化耦合下顆石藻的生理生態(tài)響應(yīng)

海水中的DIC濃度較高，但大洋橋石藻的光合固碳卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有飽和［24—27］，自然條件下的DIC條件對(duì)顆石藻細(xì)胞的生長并不會(huì)起到限制作用，因此，C O2或DIC的增加通常并不能促進(jìn)其生長［28—30］。在營養(yǎng)鹽方面，研究表明光合作用與氮代謝是兩個(gè)緊密相連的過程［31］。Nimer等［32］的研究則表明，在營養(yǎng)鹽限制時(shí)，p H降低（pC O2700×10－6）不影響顆石藻的生長。在氮限制培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)［31］，氮限制可誘導(dǎo)小球藻的C O2濃縮機(jī)制（CC M）形成，同時(shí)提高微藻細(xì)胞的氮利用率，使細(xì)胞的C O2固定速率維持在合理水平，以減少對(duì)氮的需求。而在本文實(shí)驗(yàn)中，無論是在氮充足或氮不足條件下，當(dāng)C O2濃度增加時(shí)，大洋橋石藻的有機(jī)碳含量均略有增加，細(xì)胞的光合固碳作用有所增強(qiáng)，并且在氮不足條件下大洋橋石藻細(xì)胞的有機(jī)碳比重均遠(yuǎn)大于氮充足條件，暗示在海水酸化下，寡營養(yǎng)鹽條件可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有機(jī)碳含量的增加。

圖5 氮充足（藍(lán)色）與氮不足（紅色）以及不同C O2加富濃度（380×10－6、800×10－6、1 600×10－6）條件下，培養(yǎng)過程的細(xì)胞數(shù)最高值的對(duì)比Eig．5 The comparison of cell density maxima in different C O2enrich ment culture experiments（380×10－6，800× 10－6，1 600×10－6）under condition of sufficient nutrients（blue）and nitrate limitation（red）

電鏡觀察結(jié)果顯示，海洋酸化嚴(yán)重削弱了大洋橋石藻的鈣化作用。從PIC／P O C值的變化結(jié)果來看，C O2濃度加富下均呈降低趨勢，不管是氮不足還是氮充足條件。在野外的圍隔實(shí)驗(yàn)研究中，實(shí)驗(yàn)條件的差異以及顆石藻種類的不同可能使研究結(jié)果有所不同，隨著p H值的降低，PIC與P O C的變化總結(jié)起來基本為以下3種情況：（1）PIC減少，PIC／P O C值降低；（2）P O C增加，PIC／P O C值降低；（3）PIC、P O C均減少，PIC／P O C值幾乎不變［33—35］。可見，p H的降低，PIC／P O C值也隨之降低，這在室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)與野外圍隔實(shí)驗(yàn)中是基本一致，而不同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)PIC與P O C的變化影響則略有不同。

5 結(jié)論

在氮充足和氮不足的條件下，C O2加富均能一定程度上促進(jìn)大洋橋石藻種群增長（細(xì)胞數(shù)和比生產(chǎn)速率）和Chl a含量的提高，并且這個(gè)促進(jìn)作用在C O2濃度為800×10－6時(shí)表現(xiàn)最為明顯。對(duì)比兩種營養(yǎng)鹽狀態(tài)，氮相對(duì)不足的營養(yǎng)鹽狀態(tài)下的大洋橋石藻各項(xiàng)生理指標(biāo)均有顯著提高，顯然，作為培養(yǎng)液的唯一變量，營養(yǎng)鹽濃度和營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)起到了重要的作用，低氮磷比可能促進(jìn)了大洋橋石藻的生長繁殖。電鏡觀測結(jié)果表明海水酸化對(duì)鈣化作用具有顯著的負(fù)影響，此外PIC／P O C值在C O2濃度加富下呈一定的降低趨勢。海水酸化會(huì)使大洋橋石藻表面的顆石粒發(fā)生畸變，或者缺角不完整顆石層的厚度變薄，以及使得細(xì)胞個(gè)體的變小和比表面積的升高。大洋橋石藻對(duì)海水酸化及氮相對(duì)不足的復(fù)合響應(yīng)，暗示在大洋寡營養(yǎng)鹽環(huán)境下，未來大氣C O2濃度的升高一定程度上可能刺激大洋橋石藻的生長。

致謝：本所江志兵博士協(xié)助進(jìn)行SPSS方差統(tǒng)計(jì)分析，兩位審稿專家提出了嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的意見，在此一并致謝。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Quay P D，Tibrook B，W ong C S．Oceanic uptake of fossilfuel C O2：carbon13 evidence［J］．Science，1992，256（5053）：74－79．

［2］ Orr J C，Eabry V J，Au mont O，et al．Anthropogenic ocean acidification over the twenty-first century and itsimpact on calcifying organisms［J］．Nature，2005，437（7059）：681－686．

［3］ Doney S C，Eabry V J，Eeely R A，et al．Ocean Acidification：the other C O2problem［J］．Annu Rev M ar Sci，2009，1：169－192．

［4］ Caldeira K，Wickett M E．Oceanography：anthropogenic carbon and ocean p H［J］．Nature，2003，425（6956）：365，doi：10.1038／425365a．

［5］ Raven J A．Ocean acidification due to increasing atmospheric carbon dioxide［M］．London，U K：Royal Society，2005．

［6］ Eeely R A，Sabine C L，Lee K，et al．Impact of anthropogenic C O2on the CaC O3system in the oceans［J］．Science，2004，305（5682）：362－366．

［7］ Zondervan I，Zeebe R E，Rost B，et al．Decreasing marine biogenic calcification：a negative feedback on rising atmospheric pC O2［J］．Global Biogeochemical Cycles，2001，15（2）：507－516．

［8］ Rochelle-Newall E，Delille B，Erankignoulle M，et al．Chromophoric dissolved organic matterin experimental mesocosms maintained under different pC O2levels ［J］．M arine Ecology Progress Series，2004，272：25－31．

［9］ 阮祚禧．海洋酸化對(duì)鈣化浮游植物顆石藻的影響［D］．汕頭：汕頭大學(xué)，2008．Ruan Zuoxi．Effects of ocean acidification on the calcifying phytoplankton coccolithophore［D］．Shantou：Shantou U niversity，2008．

［10］ Riebesell U，Zondervan I，Rost B，et al．Reduced calcification of marine plankton in response to increased atmospheric C O2［J］．Nature，2000，407 （6802）：364－367．

［11］ Rost B，Riebesell U，Burkhardt S，et al．Carbon acquisition of bloom-forming marine phytoplankton［J］．Limnol Oceanogr，2003，48（1）：55－67．

［12］ 蔡小霞，潘建明，張海娜，等．C O2加富對(duì)顆石藻Emilianiahuxleyi生長及鈣化作用的影響［J］．海洋環(huán)境科學(xué)，2013，32（2）：249－253．Cai Xiaoxia，Pan Jian ming，Zhang Haina，et al．Effects of elevated C O2concentration on growth and calcification of the coccolithes Emilianiahuxleyi［J］．M arine Environ mental Science，2013，32（2）：249－253．

［13］ Raven J A，Crawfurd K．Environ mental controls on coccolithophore calcification［J］．M arine Ecology Progress Series，2012，470：137－166．

［14］ Eeng Y，W arner M E，Zhang Y，et al．Interactive effects of increased pC O2，temperature and irradiance on the marine coccolithophore Emiliania huxleyi（Prymnesiophyceae）［J］．European Journal of Phycology，2008，43（1）：87－98．

［15］ 夏建榮，高坤山．高濃度C O2對(duì)極大螺旋藻生長和光合作用的影響［J］．水生生物學(xué)報(bào)，2001，25（5）：474－480．Xia Jianrong，Gao Kunshan．Effects of high C O2concentration on growth and photosynthesis of Spirulina maxima［J］．Acta H ydrobiologica Sinica，2001，25（5）：474－480．

［16］ 夏建榮，高坤山．C O2濃度升高對(duì)斜生柵藻生長和光合作用的影響［J］．植物生理學(xué)通訊，2002，38（5）：431－433．Xia Jianrong，Gao Kunshan．Effect of elevated C O2concentration on growth and photosynthesis of Scenedesmusobliquus［J］．Plant Physiology Com munications，2002，38（5）：431－433．

［17］ 夏建榮．大氣C O2濃度升高對(duì)海洋浮游植物影響的研究進(jìn)展［J］．湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（3）：106－110．Xia Jianrong．Advancesin the study ofthe effects of elevaed atmospheric C O2concentrations on marine phytoplankton［J］．Journal of Zhanjiang O-cean U niversity，2006，26（3）：106－110．

［18］ 鄒定輝，高坤山．高C O2濃度對(duì)大型海藻光合作用及有關(guān)過程的影響［J］．生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，22（10）：1750－1757．Zou Dinghui，Gao Kunshan．Effects of elevated C O2concentration on the photosynthesis and related physiological processes in marine macroalgae ［J］．Acta Ecologica Sinica，2002，22（10）：1750－1757．

［19］ 徐智廣，鄒定輝，張鑫，等．C O2和硝氮加富對(duì)龍須菜（Gracilarialemaneiformis）生長、生化組分和營養(yǎng)鹽吸收的影響［J］．生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，28 （8）：3752－3759．Xu Zhiguang，Zou Dinghui，Zhang Xin，et al．Effects ofincreased atmospheric C O2and N supply on growth，biochemicalcompositions and uptake of nutrients in Gracilarialemaneiformis（Rhodophyta）［J］．Acta Ecologica Sinica，2008，28（8）：3752－3759．

［20］ Ealkowski P G．Evolution ofthe nitrogen cycle and itsinfluence on the biological sequestration of C O2in the ocean［J］．Nature，1997，387（3872）：272－275．

［21］ 程兆第，高亞輝，劉師成．福建沿岸微型硅藻［M］．北京：海洋出版社，1993：1－125．Cheng Zhaodi，Gao Yahui，Liu Shicheng．Nano-planktonic diatoms in Eujian coast［M］．Beijing：China Ocean Press，1993：1－125．

［22］ 國家海洋標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量中心，國家海洋局第一海洋研究所．海洋調(diào)查規(guī)范G B／T 12763－2007［S］．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008．National Technical Supervision Bureau，Eirst Institute of Oceanography，State Oceanic Administration．Specificationsfor oceanographic survey G B／T 12763－2007［S］．Beijing：Chinese Standard Press，2008．

［23］ 陳雄文，高坤山．C O2濃度對(duì)中肋骨條藻的光合無機(jī)碳吸收和胞外碳酸酐酶活性的影響［J］．科學(xué)通報(bào)，2003，48（21）：2275－2279．Chen Xiongwen，Gao Kunshan．Effects of C O2concentration on the photosynthetic inorganic carbon uptake and extracellular carbonic anhydrase ctiveity of Skeletonemacostatum［J］．Chinese Science Bulletin，2003，48（21）：2275－2279．

［24］ Paasche E．A tracer study oftheinorganic carbon uptake during coccolith formation and photosynthesisin the coccolithophorid Coccolithushuxleyi ［J］．Physiol Plantaru m，1964，3（suppl．）：1－82．

［25］ Nielsen M V．Photosynthetic characteristics of the coccolithophorid Emiliania huxleyi（Prymnesiophyceae）exposed to elevated concentrations of dissolved inorganic carbon［J］．J Phycol，1995，31（5）：715－719．

［26］ Berry L，Taylor A R，Lucken U，et al．Calcification and inorganic carbon acquisition in coccolithophores［J］．Eunct Plant Biol，2002，29（2／3）：289 －299．

［27］ Zondervan I，Rost B，Riebesell U．Effect of C O2concentration on the PIC／P O C ratio in the coccolithophore Emilianiahuxleyi grown underlightlimiting conditions and different daylengths［J］．J Exp M ar Biol Ecol，2002，272（1）：55－70．

［28］ Paasche E，Brubak S，Skatteb?l S，et al．Growth and calcification in the coccolithophorid Emiliania huxleyi（Haptophyceae）at low salinities［J］．Phycologia，1996，35（5）：394－403．

［29］ Buitenhuis E T，De Baar H J W，Veldhuis M J W．Photosynthesis and calcification by Emilianiahuxleyi（Prymnesiophyceae）as a function ofinorganic carbon species［J］．J Phycol，1999，35（5）：949－959．

［30］ Clark D R，Elynn K J．The relationship between the dissolved inorganic carbon concentration and growth ratein marine phytoplankton［J］．Proc R Soc Lond B，2000，267：953－959．

［31］ Turpin D H，W eger H G．Steady-state chlorophyll a fluorescence transients during am moniu m assimilation by the N-limited green alga Selenastrum minutum［J］．Plant Physiol，1988，88（1）：97－101．

［32］ Nimer N A，Brownlee C，M errett M J．Carbon dioxide availability，intracellular p H and growth rate of the coccolithophore Emilianiahuxleyi［J］．M ar Ecol Prog Ser，1994，109：257－262．

［33］ Beardall J，Griffiths H，Raven J A．Carbon isotope discrimination and the C O2accu mulating mechanism in Chlorellaemersonii［J］．J Exp Bot，1982，33（4）：729－737．

［34］ Delille B，Harlay J，Zondervan I，et al．Response of primary production and calcification to changes of pC O2during experimental blooms ofthe coccolithophorid Emilianiahuxleyi［J］．Global Biogeochem Cy，2005，19（2）：G B2023．

［35］ Engel A，Zondervan I，Aerts K，et al．Testing the direct effect of C O2concentration on a bloom ofthe coccolithophorid Emilianiahuxleyiin mesocosm experiments［J］．Limnol Oceanogr，2005，50（2）：493－507．

Combined effects of seawater acidification and nitrogen deficiency on Gephyrocapsaoceanica

Cai Xiaoxia1，Yu Peisong1，Zhang Haifeng1，H u Ji1，Zhang Haina1，Pan Jian ming1
（1．Laboratoryof Marine Ecosystem and Biogeochemistry，Second Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Hangzhou 310012，China）

Abstract：Combined influences of nutrients status and seawater C O2concentration on microalgae growth and physiology of Gephyrocapsaoceanic was investigated．It was shown that the abundance of G.oceanic significantly increased during C O2enrich ment experiments at different nutrient levels（nitrogen-deficiency vs．nutrient-rich）．H owever，the strongestresponse was observed in cell density and chlorophylla concentration of G.oceanic when nitrogen was deficiency，suggesting low nutrients concentration and low N／P ratio might be favor to the cell growth．Besides，electron microscopy resultsindicated that seawater acidification had significant negativeimpact on the calcification and cell size distribution（became smaller）of G.oceanic when nitrogen was deficiency．H owever，in future oligotrophic open ocean，increasing C O2concentration might stimulate G.oceanic thrive．

Key words：seawater acidification；C O2enrich ment；nutrients；Coccolithophores

*通信作者：潘建明，男，研究員，長期從事海洋環(huán)境化學(xué)和生物地球化學(xué)研究。E-mail：jmpan＠sio．org．cn

作者簡介：蔡小霞（1987—），女，福建省漳州市人，助理研究員，從事近海海洋環(huán)境化學(xué)研究。E-mail：caixx1987＠163．com

基金項(xiàng)目：國家海洋局第二海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助（JG1406）；國家海洋局全球變化與海氣相互作用專項(xiàng)（G ASI-03-01-03-02）；浙江省自然科學(xué)基金（L Y14 D060008）。

收稿日期：2015-07-21；

修訂日期：2016-01-09。

中圖分類號(hào)：Q948.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0253-4193（2016）04-0130-09