下調(diào)Rab11基因?qū)m頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞侵襲遷移的影響及機(jī)制探討

闞巖巖，張建華，周 敏，章龍珍，王 俠

1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院腫瘤學(xué)系，江蘇 徐州 221002；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科，江蘇 徐州 221002

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下調(diào)Rab11基因?qū)m頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞侵襲遷移的影響及機(jī)制探討

闞巖巖1，張建華1，周 敏1，章龍珍2，王 俠2

1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院腫瘤學(xué)系，江蘇 徐州 221002；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科，江蘇 徐州 221002

［摘要］背景與目的：Rab11基因在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，可能與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。本研究采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Rab11基因表達(dá)，并探討其對(duì)宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞侵襲遷移的影響及可能的相關(guān)機(jī)制。方法：將HeLa/SiHa細(xì)胞分為2組：陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的小干擾RNA)和Rab11 siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染小干擾Rab11siRNA)。蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)Rab11干擾效果，檢測(cè)轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA后，侵襲相關(guān)蛋白R(shí)ac1、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9表達(dá)的變化；細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲；細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)角度探索在小干擾Rab11后Rac1蛋白在細(xì)胞膜上聚集位置的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染小干擾Rab11siRNA到HeLa/SiHa細(xì)胞后，Rab11蛋白表達(dá)受到高效抑制(P<0.01)；細(xì)胞遷移、侵襲能力受到抑制(P<0.05)，Rac1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，MMP2、MMP9蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，Rab11 siRNA處理組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前端細(xì)胞膜下Rac1蛋白聚集量減少。結(jié)論：Rab11基因表達(dá)下調(diào)可以抑制HeLa/ SiHa細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能與Rac1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量下降及Rac1定位的改變有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］Rab11；Rac1；基質(zhì)金屬蛋白酶；宮頸癌；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

Correspondence to: WANG Xia E-mail: wangxia_66@163.com

隨著宮頸癌癌前篩查的普及、診斷率的提高，宮頸癌發(fā)病年齡呈低齡化趨勢(shì)［1］。盡管手術(shù)和同步放化療對(duì)早期宮頸癌患者治愈率達(dá)80%~95%，但對(duì)局部晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者仍未有令人滿意的治療手段，亟需尋找有效的治療方式。Rab基因于1983年第一次被發(fā)現(xiàn)并命名，目前為止有60多個(gè)家族成員被發(fā)現(xiàn)［2］。Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一個(gè)亞家族成員，最早由Hale發(fā)現(xiàn)并命名，參與多種蛋白的運(yùn)輸，與乳腺癌、直腸癌等的侵襲、遷移密切相關(guān)［3-5］。Rac1(Ras-related C3 botulinum substrate 1)是Rho家族Rac亞家族的成員，主要調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架重組、細(xì)胞周期的進(jìn)行和特定基因表達(dá)［6］。有研究認(rèn)為，Rac1參與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移［7］，Rab11可以調(diào)控Rac1來(lái)控制細(xì)胞發(fā)生集體遷移的過(guò)程［8］，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)可在多種癌組織中表達(dá)，且其表達(dá)的強(qiáng)弱與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)［9］，但目前在宮頸癌細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)Rac1和MMP在Rab11基因的誘導(dǎo)下發(fā)生遷移和侵襲作用的報(bào)道。本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)，將Rab11基因的特異性小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染入HeLa/SiHa細(xì)胞，以觀察阻斷Rab11基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移的影響；同時(shí)檢測(cè)Rac1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)和Rac1蛋白聚集位置的變化，初步了解其在Rab11 siRNA干擾后在宮頸癌中的分子機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa及SiHa購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，DMEM-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青生物科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司，anti-Rab11、anti-actin購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司，anti-Rac1購(gòu)自美國(guó)PTG公司，anti-MMP2、anti-MMP9和二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司，免疫熒光二抗購(gòu)自徐州微科曼得生物工程有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，細(xì)胞侵襲細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)Corning公司。Rab11 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，si-Rab11序列為：5’-GAGCACCAUUGGAGUAGAGTT-3’， 小干擾陰性對(duì)照組(si-negative control)siRNA序列為：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HeLa、SiHa細(xì)胞用含10%滅活的FBS DMEM-1640培養(yǎng)液，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化、傳代。

將培養(yǎng)He La/Si Ha細(xì)胞分為2組：sinegative control組及小干擾Rab11 siRNA組。轉(zhuǎn)染前一天將HeLa/SiHa細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)到60%～80%，按LipofectamineTM2000說(shuō)明書的步驟分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組和Rab11 siRNA組。

1.2.2蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)

分組同細(xì)胞轉(zhuǎn)染，HeLa/SiHa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后，蛋白裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。30 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗，4℃溫育過(guò)夜，加入熒光二抗(1∶10 000稀釋)室溫溫育2 h。TBST洗膜后，曝光分析。

1.2.3細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

按BioCoat Matrigel invasion chamber試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)，顯微鏡下取6個(gè)不同的視野(×200)進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，計(jì)算侵襲細(xì)胞的平均數(shù)。

1.2.4細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

待轉(zhuǎn)染后細(xì)胞數(shù)達(dá)70%生長(zhǎng)融合時(shí)，用移液槍頭沿培養(yǎng)板底部呈一字型劃痕，用PBS洗，換上無(wú)血清的培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)0、6、12、24和36 h時(shí)在倒置顯微鏡下(10×10)測(cè)量劃痕的寬度。細(xì)胞遷移率=(1-測(cè)量時(shí)劃痕寬度/初始劃痕寬度)×100%。

1.2.5細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rac1的定位改變

將兩組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h的6孔板(鋪有蓋玻片)從培養(yǎng)箱中取出，PBS洗后，4%多聚甲醛固定20 min，0.5%TritonX-100處理細(xì)胞10 min，2%BSA封閉l h，每個(gè)蓋玻片上滴加50 μL稀釋好的一抗，置于4℃過(guò)夜，每個(gè)蓋玻片上加入50 μL左右稀釋好的熒光二抗，室溫溫育1 h，每孔加入染核試劑DAPI少許，室溫下放置5 min，加入封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有研究均設(shè)3份平行實(shí)驗(yàn)，采用SPSS 16.0軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1Rab11 siRNA干擾后Rab11蛋白的抑制情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在25×103處有灰色條帶顯示，Rab11蛋白在Rab11 siRNA組的表達(dá)量明顯低于si-negative control組(HeLa組t=5.120，P＜0.01，SiHa組t=4.956，P＜0.01，圖1)。

2.2Rab11 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-negative control組相比，轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA組HeLa/ SiHa細(xì)胞的侵襲能力明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HeLa組t=16.841，P＜0.01；SiHa組t=18.244，P＜0.01，圖2)。

圖 1　Rab11 siRNA對(duì)于Rab11蛋白表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of Rab11 siRNA on Rab11 expression

圖 2　Rab11 siRNA對(duì)宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響Fig. 2 Effect of Rab11 siRNA on cervical cancer HeLa/SiHa cell invasion capacity

2.3Rab11 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)

細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rab11 siRNA組與si-negative control組相比，HeLa/SiHa細(xì)胞的遷移能力明顯降低(HeLa組24 h t=3.909，P＜0.01，36 h t=2.997，P＜0.05，SiHa組24 h t=4.007，P＜0.01，36 h t=2.838，P＜0.05，圖3)。

2.4Rab11 siRNA干擾后Rac1、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在21×103、72×103和92×103處有灰色條帶顯示，Rac1、MMP2和MMP9蛋白在Rab11 siRNA組的表達(dá)量明顯低于si-negative control組(Rac1蛋白HeLa組t=8.794，P<0.01，SiHa組t=15.650，P<0.01；MMP2蛋白HeLa組t=5.634，P<0.01，SiHa組t=4.391，P<0.05；MMP9蛋白HeLa組t=3.430，P<0.05，SiHa組t=4.082，P<0.05，圖4)。

2.5轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞骨架蛋白R(shí)ac1定位的影響

Rab11 siRNA組與si-negative control組相比，分布在細(xì)胞周圍的紅色熒光強(qiáng)度降低，集中在細(xì)胞膜前端上的紅色熒光明顯減少(紅色熒光為分布在細(xì)胞膜上的Rac1蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核DAPI染色，圖5)。

圖 3　Rab11 siRNA對(duì)宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞遷移能力的影響Fig. 3 Effect of Rab11 siRNA on cervical cancer HeLa/SiHa cell migration capacity

圖 4　Rab11 siRNA對(duì)宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞中Rac1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of Rab11 siRNA on Rac1， MMP2 and MMP9 expression in human cervical cancer HeLa/SiHa cell

圖 5　免疫熒光法檢測(cè)Rab11 siRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞Rac1定位的影響Fig. 5 Immunoflorescence analysis of Rac1 localization in human cervical cancer cell transiently transfected withRab11 siRNA

3　討 論

全世界范圍內(nèi)，宮頸癌占女性腫瘤發(fā)病率的第5位，占女性腫瘤死亡率的第4位［10］。近10年宮頸癌發(fā)病率不斷增高，尤其是亞洲發(fā)展中國(guó)家。宮頸癌患者的預(yù)后與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已成為提高患者生存率的主要障礙。深入研究宮頸癌的遷移、侵襲機(jī)制對(duì)于改善宮頸癌患者的總體預(yù)后水平起著至關(guān)重要的作用。

Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一個(gè)亞家族成員，在內(nèi)吞再循環(huán)過(guò)程中，Rab11作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)再循環(huán)內(nèi)體的形成、運(yùn)輸，并引導(dǎo)攜帶受體的膜泡錨定于質(zhì)膜之上，實(shí)現(xiàn)了受體和脂質(zhì)的循環(huán)利用［11］。Rab11基因在乳腺癌、食管癌及皮膚癌等腫瘤中高表達(dá)，并在部分腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用［12-14］。然而，Rab11在宮頸癌細(xì)胞中的研究目前報(bào)道甚少。本研究采用siRNA技術(shù)，轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞，經(jīng)Western blot證明沉默效果的基礎(chǔ)上，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，Rab11下調(diào)表達(dá)24和36 h后，HeLa/SiHa細(xì)胞的遷移能力明顯下降；Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，HeLa/SiHa細(xì)胞的侵襲能力明顯下降，與未下調(diào)組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Rac1是Rho家族Rac亞家族的成員。在細(xì)胞的遷移過(guò)程中，Rac1是形成含豐富肌動(dòng)蛋白的膜上褶皺所必需的，這種褶皺被稱為板狀偽足，它被認(rèn)定為引導(dǎo)細(xì)胞遷移和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的驅(qū)動(dòng)力［6］。近年研究表明，Rac1在結(jié)腸癌、胃癌和肺癌組織中的表達(dá)明顯升高，且與其侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］。Liu等［15］發(fā)現(xiàn)，干涉HeLa 和SiHa細(xì)胞中Rab5a基因的內(nèi)源性表達(dá)后，活化的Rac1水平下調(diào)，腫瘤細(xì)胞侵襲能力降低，證明Rac1與宮頸癌的侵襲遷移密切相關(guān)。Rab11 與Rab5同屬于Rab小分子GTP酶家族的成員，其作用有所不同，Rab11主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸，Rab5主要負(fù)責(zé)調(diào)控胞吞泡與早期內(nèi)體的融合。同時(shí)有研究顯示，在肺癌細(xì)胞中，下調(diào)Rab11后Rac1蛋白表達(dá)量顯著降低［14］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot檢測(cè)，在HeLa/SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA后，與對(duì)照組相比，Rac1蛋白的表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了Rab11能夠調(diào)控Rac1蛋白的表達(dá)。有研究提示，Rac1的高度表達(dá)可破壞鈣黏蛋白依賴的細(xì)胞連接，并通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的聚合重組改變細(xì)胞的形態(tài)表型，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移侵襲能力［16］。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，細(xì)胞免疫熒光強(qiáng)度減弱，Rac1的表達(dá)受到抑制，使細(xì)胞骨架重構(gòu)，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前端的胞膜下Rac1蛋白聚集減少，進(jìn)而抑制片狀偽足的形成及膜的多極化，抑制腫瘤細(xì)胞，最終抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲。有文獻(xiàn)報(bào)道，在集體細(xì)胞遷移過(guò)程中，Rab11調(diào)控酪氨酸激酶的下游分子Rac1來(lái)控制膜突蛋白的活性以調(diào)節(jié)細(xì)胞間信息傳遞，本研究結(jié)果與之相符［8, 17］。在腫瘤細(xì)胞分泌的MMP中，MMP2和MMP9是最主要的降解型膠原酶，在腫瘤的新生血管形成、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移灶的形成過(guò)程中均起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與未下調(diào)組相比，轉(zhuǎn)染組MMP2與MMP9蛋白表達(dá)降低，提示Rab11可以通過(guò)調(diào)控宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞中MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的侵襲、遷移。

目前有關(guān)Rab11基因與宮頸癌侵襲遷移關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞中，通過(guò)RNA干擾使Rab11基因表達(dá)沉默，進(jìn)而對(duì)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為產(chǎn)生抑制作用，這種抑制作用是通過(guò)對(duì)細(xì)胞中Rac1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)下調(diào)和對(duì)Rac1蛋白位置的改變而引發(fā)腫瘤細(xì)胞性狀改變，從而抑制其轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，siRab11對(duì)宮頸癌HeLa/SiHa細(xì)胞的遷移、侵襲有較好的抑制作用，為進(jìn)一步開(kāi)展宮頸癌分子靶向治療奠定了基礎(chǔ)，為降低宮頸癌患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率提供了理論依據(jù)。為更好地了解Rab11基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，有必要進(jìn)一步研究Rab11與其他調(diào)節(jié)侵襲、遷移相關(guān)基因之間的關(guān)系和體內(nèi)試驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

［參 考 文 獻(xiàn)］

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Effect of silencing Rab11 by RNAi on invasion and migration of cervical cancer cell lines HeLa/SiHa and its mechanism

KAN Yanyan1, ZHANG Jianhua1, ZHOU Min1, ZHANG Longzhen2, WANG Xia2(1. Department of Oncology, the Graduate School, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; 2.Department of Radiotherapy, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China)

［Key words］Rab11；Rac1；Matrix metalloproteinase；Cervical cancer；Cell invasion；Cell migration

［Abstract］Background and purpose: The expression of Rab11 gene was increased in cervical cancer cell and may be involved in the cellular malignant transformation. This study used the sequence-specific siRNA knocking down the expression of Rab11 gene and aimed to investigate its effect on invasion and migration of cervical cancer cell lines HeLa/SiHa and its mechanism. Methods: HeLa/SiHa cells were divided into 2 groups: non-specific siRNA group transfected with unrelated siRNA (Rab11-NC) and Rab11 siRNA group transfected with Rab11 siRNA (Rab11siRNA). Western blot was used to examine the Rab11 protein expression. Cell migration and invasion were detected by cell scratch and Transwell invasion assay. Western blot was used to further investigate the expression of Rac1, matrix metalloproteinase 2 （MMP2） and MMP9 which were critical for regulating cell invasion. Moreover， immunofluorescence was used to identify intracellular location of Rac1 in HeLa/SiHa cells. Results: The Rab11 siRNA inhibited expression of Rab11 gene (P<0.01). The invasion and migration capacities of HeLa/SiHa cells were markedly inhibited in Rab11siRNA group (P＜0.05）. The expression of Rac1 significantly decreased （P<0.01). The expression of MMP2 and MMP9 decreased (P＜0.05） as well. The recruitment of Rac1 to protruding edge significantly decreased following down-regulation of Rab11. Conclusion: Down-regulated Rab11 expression could inhibit the expression of Rac1, MMP2 and MMP9, and alter the location of Rac1, leading to suppression of HeLa/SiHa cells migration and invasion.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.03.006

中圖分類號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639(2016)03-0238-07

基金項(xiàng)目：江蘇省徐州市科技發(fā)展基金（KC14SH111）。

通信作者：王 俠 E-mail: wangxia_66@163.com

收稿日期：（2015-06-08 修回日期：2015-08-30）