陽離子鋁酞菁紅區(qū)熒光探針在納克級RNA定量分析中的應(yīng)用

郭夢林， 楊惠卿， 黃 萍， 陳 林， 李東輝

廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心， 福建 廈門 361102

陽離子鋁酞菁紅區(qū)熒光探針在納克級RNA定量分析中的應(yīng)用

郭夢林， 楊惠卿， 黃 萍， 陳 林， 李東輝*

廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心， 福建 廈門 361102

荷正電的四取代三甲基碘化銨鋁酞菁(Tetra(trimethylammionio) aluminum phthalocyanine， TTMAAlPc)是新近出現(xiàn)的、 很有應(yīng)用潛力的新型紅區(qū)熒光化合物。 研究表明， 弱堿性條件， RNA對TTMAAlPc的熒光具有高效猝滅作用， 且猝滅程度與RNA含量呈線性正相關(guān)。 據(jù)此發(fā)現(xiàn)建立了可測定納克級RNA的高靈敏定量分析新方法， 并對原理進(jìn)行了討論。 考察了pH、 緩沖體系、 反應(yīng)時間、 溫度、 TTMAAlPc濃度的影響， 確定了最佳反應(yīng)條件(pH 8.0的廣泛緩沖液、 反應(yīng)5 min、 室溫、 濃度為2×10-6mol·L-1的TTMAAlPc)。 在最佳條件下， 方法的線性回歸方程為y=-15.0+0.51x， 相關(guān)系數(shù)r=0.998 6， 線性范圍7.71～1 705.57 ng·mL-1， 檢測限為1.55 ng·mL-1。 本法靈敏度高、 線性范圍寬、 對RNA測定常見干擾物質(zhì)包括陰、 陽離子、 表面活性劑和維生素等的抗干擾能力強(qiáng)， 且操作簡便。 該法應(yīng)用于實(shí)際樣品RNA含量的測定， 取得了滿意的結(jié)果。 還以參比法首次測定了不同pH下TTMAAlPc的熒光量子產(chǎn)率， 結(jié)果顯示TTMAAlPc具有較高的熒光量子產(chǎn)率， 且對大范圍的酸度穩(wěn)定， 表明TTMAAlPc是極具應(yīng)用潛力的新型紅色熒光探針， 值得深入研究， 開拓其應(yīng)用。

酞菁； 熒光； RNA； 測定

引 言

隨著生命科學(xué)、 環(huán)境科學(xué)的快速發(fā)展， 傳統(tǒng)的熒光探針越來越顯示出其局限性。 因?yàn)樯铩?醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品通常組成復(fù)雜， 在進(jìn)行熒光分析時常受到背景熒光和散射光的顯著干擾， 客觀上要求發(fā)展新一代熒光探針以解決這一問題。 因此， 長波熒光檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[1-2]。

金屬酞菁化合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、 較易合成、 結(jié)構(gòu)可修飾性強(qiáng)， 易于引入各類活性基團(tuán)而獲得具有各種功能的衍生物。 尤為難得的是， 中心配位原子為反磁性的金屬酞菁化合物大多具有熒光量子產(chǎn)率高、 熒光發(fā)射在紅色區(qū)域且可進(jìn)行長波激發(fā)(因而可有效避開背景熒光和散射光的干擾)等優(yōu)良熒光特性。 因此， 自20世紀(jì)90年代起， 金屬酞菁化合物作為新型熒光探針的研究即在國際上開始引起關(guān)注[3-5]， 但迄今所涉及的酞菁熒光化合物多為陰離子和非離子型金屬酞菁[6-8]， 對陽離子酞菁熒光化合物在分析科學(xué)的應(yīng)用研究則鮮見涉及。

四取代三甲基碘化銨鋁酞菁(Tetra(trimethylammionio) aluminum phthalocyanine， TTMAAlPc)是一種新型的陽離子酞菁化合物， 具有典型的紅區(qū)發(fā)射熒光特性， 近年來， 我們以其為紅區(qū)熒光探針， 應(yīng)用于硫酸軟骨素[9]和溶菌酶[10]檢測， 結(jié)果顯示陽離子酞菁在生物大分子的定量分析中有著良好的靈敏度與抗干擾能力， 突顯了其作為一種新型的紅色熒光探針的優(yōu)勢。 本研究進(jìn)一步考察了TTMAAlPc的熒光性質(zhì)， 測定其熒光量子產(chǎn)率， 并將其作為熒光探針應(yīng)用于核酸檢測， 發(fā)現(xiàn)TTMAAlPc對RNA的響應(yīng)靈敏度明顯高于DNA， 據(jù)此建立了高靈敏測定RNA的新方法， 并對反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了探討。

RNA的定量對諸多基礎(chǔ)研究和臨床診斷具有重要的意義。 常見的RNA定量分析方法主要為紫外分光光度法和熒光分析法[11]。 由于RNA的內(nèi)源熒光極弱(其量子產(chǎn)率<10-5)， 無法用熒光法直接測定， 故RNA的熒光測定須采用外源探針。 本研究以新型陽離子鋁酞菁作為外源紅區(qū)熒光探針建立了RNA含量測定的新方法， 開拓了酞菁紅區(qū)熒光探針的新應(yīng)用。 方法靈敏度高、 線性范圍寬、 抗干擾能力強(qiáng)以及操作簡便， 用于實(shí)際樣品分析取得了滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LS-55型熒光分光光度計(jì)(PerkinElmer， 美國)， 帶恒溫附件； Lambda25分光光度計(jì)(PerkinElmer， 美國)； DC-3006低溫恒溫槽(寧波新芝生物科技股份有限公司)； Orion Star A211 pH Meter(Thermo scientific， 美國)； 精密天平(Sartorius公司， 德國)； 漩渦混勻器(常州國華電器有限公司)； 智能磁力攪拌器(予華ZNCC-T， 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)； OMNI實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)(銳思捷科學(xué)儀器有限公司)； 1 cm石英熒光比色皿； 1 cm石英吸收比色皿。

四磺基鋁酞菁(J&K百靈威科技有限公司)； 陽離子鋁酞菁按文獻(xiàn)[12]合成并純化。 酵母RNA(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，A260/A280=2.0。

Britton Robinson緩沖液： 用濃度均為0.04 mol·L-1的磷酸、 乙酸、 硼酸混合三酸與0.2 mol·L-1NaOH溶液按一定比例混合， 配成不同pH值的緩沖溶液。 廣范緩沖液： 由原液Ⅰ(0.1 mol·L-1鹽酸 )、 Ⅱ(1/15 mol·L-1磷酸二氫鉀)、 Ⅲ(1/15 mol·L-1磷酸氫二鈉)、 Ⅳ(1/15 mol·L-1磷酸鈉)配制而成。 pH 1.15～3.0含有原液Ⅰ和Ⅱ， pH 4.5～7.0含有原液Ⅱ和Ⅲ， pH 7.3～12.0含有原液Ⅲ和Ⅳ。 RNA儲備液濃度為1 mg·mL-1， 貯存于-20 ℃， 使用前稀釋100倍， 于4 ℃冰箱避光放置隔夜， 實(shí)驗(yàn)前放置室溫。 陽離子鋁酞菁和四磺基鋁酞菁儲備液濃度為10-3mol·L-1， 4 ℃避光保存， 使用前稀釋為10-4mol·L-1。

所用試劑均為分析純， 實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2 方法

在4 mL的塑料離心管中依次加入水、 30 μL TTMAAlPc(10-4mol·L-1)和300 μL pH 8.0的廣泛緩沖液， 混勻后加入標(biāo)準(zhǔn)RNA或待測樣品RNA溶液， 使終體積為3 mL， 最后在漩渦混勻器上混勻。 室溫放置5 min后在614 nm波長處測量反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。 激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫均為5.0 nm。 未加RNA的熒光強(qiáng)度記為If0， 加有RNA的熒光強(qiáng)度記為If， 猝滅前后熒光強(qiáng)度的變化量ΔIf以ΔIf=If0-If計(jì)算， 熒光猝滅倍數(shù)n=If0/If。

2 結(jié)果與討論

2.1 TTMAAlPc的分子結(jié)構(gòu)與熒光性質(zhì)

2.1.1 TTMAAlPc的分子結(jié)構(gòu)與熒光光譜性質(zhì)

四取代三甲基碘化銨金屬酞菁是一類新近出現(xiàn)的陽離子酞菁化合物， 本研究所用的陽離子酞菁(TTMAAlPc)中心配位金屬離子為Al3+(圖1)。 其母體結(jié)構(gòu)外周的四個苯環(huán)上各有一個強(qiáng)極性的陽離子基團(tuán)， 故易溶于水， 適于實(shí)際應(yīng)用。 TTMAAlPc的熒光激發(fā)與發(fā)射峰(分別約為610和673 nm)位于紅區(qū)波段， 是一種典型的紅區(qū)熒光化合物， 紅區(qū)發(fā)射的特性使其能有效避開背景熒光及散射光的干擾， 很有利于檢測靈敏度的提高。 TTMAAlPc的激發(fā)帶有兩個， 一個位于紫外區(qū)稱Soret帶(即B帶)， 峰位置約350 nm； 另一個位于長波區(qū)， 稱Q帶， 峰位置在610 nm左右。 如采用短波激發(fā)， 將在其倍頻處產(chǎn)生二級散射(散射峰在700 nm左右)， 對檢測產(chǎn)生明顯干擾。 本研究選擇長波激發(fā)帶進(jìn)行激發(fā)， 是基于以下考慮： (1)避開散射光的干擾(因?yàn)樯⑸涔馀c波長的四次方成反比)； (2)避免光化學(xué)反應(yīng)。 與長波長的光相比， 短波能量高， 極易誘發(fā)探針的光化學(xué)反應(yīng)而導(dǎo)致檢測體系難以穩(wěn)定。 選擇長波檢測充分利用了TTMAAlPc作為長波(紅色)熒光探針的優(yōu)勢。

Fig.1 Molecular structure of Tetra(trimethylammionio) aluminum phthalocynine (TTMAAlPc)

研究發(fā)現(xiàn)TTMAAlPc的激發(fā)與發(fā)射峰受體系酸度以及緩沖體系組成的影響， 波長變化在12 nm內(nèi)， 因此根據(jù)實(shí)際工作需要， 在不同條件下選擇不同的激發(fā)和發(fā)射波長。 具體而言， 在RNA測定時選定激發(fā)波長為603 nm， 而在研究、 測定TTMAAlPc的熒光量子產(chǎn)率時選定激發(fā)波長為614 nm。

2.1.2 TTMAAlPc的熒光量子產(chǎn)率

熒光量子產(chǎn)率是反映熒光化合物性質(zhì)的基本參數(shù)之一， 可用于判斷熒光物質(zhì)發(fā)光能力的強(qiáng)弱， 熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率達(dá)到10%以上即具有實(shí)際應(yīng)用的價值。 由于絕對測量需要特殊的設(shè)備， 故在實(shí)際工作中， 熒光量子產(chǎn)率常用參比法進(jìn)行測定。 參比物的選擇十分關(guān)鍵， 因?yàn)檫@直接關(guān)系到測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 對參比物的選擇應(yīng)遵循二條基本原則， 即分子結(jié)構(gòu)相似、 光譜性質(zhì)相近。 由于TTMAAlPc的分子結(jié)構(gòu)和光譜性質(zhì)與四磺基鋁酞菁(AlS4Pc)十分類似， 因此我們認(rèn)為AlS4Pc是TTMAAlPc的合適參比物。 已知四磺基鋁酞菁在0.1 mol·L-1pH 7.4的PBS介質(zhì)中的熒光量子產(chǎn)率為0.37[13]， 則根據(jù)式(1)可計(jì)算TTMAAlPc的熒光量子產(chǎn)率[13]

(1)

式中Yu和Ys分別表示待測物(TTMAAlPc)和參比物(AlS4Pc)的熒光量子產(chǎn)率；Fu和Fs分別表示待測物和參比物的積分熒光強(qiáng)度。Au和As分別表示待測物和參比物對該激發(fā)波長入射光的吸光度。 AlS4Pc的激發(fā)波長為617 nm， TTMAAlPc的激發(fā)波長為614 nm。 圖2給出了TTMAAlPc在不同pH介質(zhì)中的的熒光量子產(chǎn)率， 可以看出， TTMAAlPc的量子產(chǎn)率在常用pH范圍內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定， 且保持在22%以上。 因此， 我們認(rèn)為TTMAAlPc是一種性質(zhì)穩(wěn)定、 具有實(shí)際應(yīng)用價值的紅色熒光探針。

Fig.2 Effect of pH on fluorescence quantum yield of TTMAAlPc

2.2 TTMAAlPc-RNA體系的分子光譜行為

考察了RNA存在下TTMAAlPc的吸收光譜(圖3)。 可以看出， 隨著RNA的加入， TTMAAlPc主吸收峰逐步降低而后又逐步升高， 其峰位置也由665 nm逐漸紅移至674 nm。 同時， 在590， 610， 630， 685和750 nm處出現(xiàn)了五個等吸收點(diǎn)， 這提示TTMAAlPc和RNA之間發(fā)生了締合作用， 形成了新的吸收型體。

Fig.3 Absorption spectra of TTMAAlPc with and without RNA (pH 8.0)

The concentrations of RNA for curvesa—gare 0, 228, 456, 684, 942, 1 340, and 1 668 ng·mL-1, respectively. [TTMAAlPc]=2×10-6mol·L-1

RNA的加入對TTMAAlPc激發(fā)和發(fā)射光譜的產(chǎn)生了規(guī)律性的影響(圖4)， 即隨著RNA濃度的增高， 體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低， 最終幾乎被完全猝滅， 即RNA對TTMAAlPc具有高效猝滅作用。 我們認(rèn)為， RNA對TTMAAlPc熒光的高效猝滅作用源于兩方面的因素： 一方面， 由于RNA的磷酸骨架帶有大量的負(fù)電荷， 故可吸引荷正電的陽離子鋁酞菁與之發(fā)生靜電作用而形成TTMAAlPc-RNA離子締合物， 導(dǎo)致減色效應(yīng)和熒光猝滅效應(yīng)， 這也是生物大分子與熒光染料發(fā)生相互作用時常見的現(xiàn)象； 另一方面， TTMAAlPc在RNA的誘導(dǎo)下發(fā)生自締合作用而聚集(也可以認(rèn)為TTMAAlPc沿著RNA的骨架進(jìn)行長程自組裝)， 而聚集體通常是無熒光或弱熒光的型體。 以上兩方面的原因?qū)е耇TMAAlPc的熒光隨著加入RNA濃度的增加而被逐步猝滅。 并且， 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熒光猝滅程度與RNA的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 這構(gòu)成了本方法的理論基礎(chǔ)。

Fig.4 The effect of the concentrations of RNA on the excitation (x) and emission (x′) spectra of TTMAAlPc (pH 8.0)

The concentrations of RNA are (a,a′), 0ng·mL-1; (b, b′), 228 ng·mL-1; (c,c′), 456 ng·mL-1; (d,d′), 684 ng·mL-1; (e,e′), 942 ng·mL-1; (f,f′), 1 340 ng·mL-1; and (g,g′), 1 668 ng·mL-1, respectively. Exmax=603 nm; Emmax=673 nm; Slit-width for both excitation and emission was set at 5.0 nm. [TTMAAlPc]=2.0×10-6mol·L-1

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 緩沖體系的選擇

考察了Britton Robinson緩沖液、 廣范緩沖液、 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液、 Tris-HCl緩沖液、 KH2PO4-NaOH緩沖液等緩沖體系中RNA對TTMAAlPc熒光猝滅程度的影響(圖5)。 發(fā)現(xiàn)在pH 8.0的廣范緩沖液中， 體系的熒光猝滅幅度最大， 同時表現(xiàn)得最為穩(wěn)定， 因此最終選用此緩沖體系， 用量為300 μL。

Fig.5 The effect of RNA on the fluorescence quenching efficiency of TTMAAlPc under different pH

2.3.2 反應(yīng)時間的影響

體系反應(yīng)5 min后即可達(dá)到平衡， 并至少在2 h內(nèi)維持穩(wěn)定， 故實(shí)驗(yàn)選擇5 min后進(jìn)行測量。

2.3.3 溫度的影響

TTMAAlPc-RNA體系具有熱猝滅效應(yīng)， 即隨著反應(yīng)溫度的升高， 體系的熒光大幅度猝滅。 考察了5， 25和45 ℃下的線性區(qū)間及回歸曲線的斜率， 發(fā)現(xiàn)二者隨溫度變化不大， 故選擇在常溫下進(jìn)行檢測。 這也表明方法穩(wěn)定性較好、 操作簡便。

2.3.4 TTMAAlPc用量的影響

分別考察了TTMAAlPc濃度為5×10-7， 10-6mol·L-1及2×10-6mol·L-1下方法的工作曲線， 發(fā)現(xiàn)5×10-7mol·L-1時檢測限最小， 但線性不佳， 線性區(qū)間也窄， 10-6mol·L-1與2×10-6mol·L-1的檢測限相比， 檢測限略低， 但2×10-6mol·L-1時， 方法的靈敏度較好， 線性區(qū)間更寬， 故選用TTMAAlPc濃度為2×10-6mol·L-1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳條件下， 測定方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 結(jié)果表明， 反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度對RNA的濃度在較大范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。 線性回歸方程為y=-15.0+0.51x， 相關(guān)系數(shù)r=0.998 6， 線性范圍7.71～1 705.57 ng·mL-1， 檢測限為1.55 ng·mL-1。 表1將本法與文獻(xiàn)報道的幾種測定RNA的方法進(jìn)行了比較， 可見此方法不但線性范圍寬， 且檢測限低， 用于低濃度RNA的檢測具有優(yōu)勢。

2.5 共存物質(zhì)的干擾

對RNA測定常見的干擾物質(zhì)進(jìn)行了考察(表2)。 結(jié)果表明， 本法對常見的金屬離子、 無機(jī)酸根離子、 表面活性劑、 糖類、 維生素具有很強(qiáng)的抗干擾能力。 但DNA和某些蛋白質(zhì)的干擾較大， 因此對于含有這類生物大分子的樣品， 需進(jìn)行前處理(如使用DNA酶降解DNA、 采用酚抽提法去除蛋白質(zhì)等)， 或使用專門的RNA提取試劑進(jìn)行RNA的提取。

Table 1 Comparison of reported and present methods for the determination of RNA

Table 2 Influence of coexisting substances on determination of RNA(RNA=738 ng·mL-1)

2.6 實(shí)際樣品的測定

取市售高活性干酵母1.0 g， 溶于100 mL容量瓶中， 4 ℃靜置24 h， 取上層清液， 稀釋30倍， 采用加標(biāo)回收法測量。 結(jié)果見表3， 結(jié)果滿意。

Table 3 Analytical results of practical samples (n=6)

3 結(jié) 論

以新近出現(xiàn)的陽離子鋁酞菁作為熒光探針， 建立了測定RNA的新方法， 結(jié)果表明該法靈敏度高(可達(dá)納克級)、 線性響應(yīng)范圍寬、 對常見陰陽離子、 表面活性劑和維生素的抗干擾能力強(qiáng)， 且操作簡便快速。 所采用的熒光化合物TTMAAlPc是一種陽離子酞菁化合物， 水溶性好， 量子產(chǎn)率高， 其熒光激發(fā)和發(fā)射位于長波波段， 由于在此區(qū)域能被激發(fā)并發(fā)熒光的物質(zhì)極少， 故可有效避免背景熒光和散射光的干擾、 顯著降低光化學(xué)反應(yīng)， 提高了測定的靈敏度、 準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。 將此法應(yīng)用于實(shí)際樣品RNA含量的測定， 取得了滿意的結(jié)果， 顯示本法具有較好的實(shí)際應(yīng)用價值。 還以參比法首次測定了不同pH下TTMAAlPc的熒光量子產(chǎn)率， 發(fā)現(xiàn)TTMAAlPc的熒光量子產(chǎn)率較高， 且對大范圍的酸度保持較好的穩(wěn)定性， 表明TTMAAlPc是極具應(yīng)用潛力的新型紅色熒光探針， 值得進(jìn)一步深入開拓其應(yīng)用。

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*Corresponding author

Application of Cationic Aluminum Phthalocyanine, a Red-Emitting Fluorescent Probe, for Sensitive Quantitative Analysis of RNA at Nanogram Level

GUO Meng-lin， YANG Hui-qing， HUANG Ping， CHEN Lin， LI Dong-hui*

Cancer Research Center, Medical College, Xiamen University, Xiamen 361102, China

Tetrasubstituted trimethyl ammonium iodide aluminum phthalocyanine (TTMAAlPc), a positively charged phthalocyanine compound, is an emerging and potentially useful red-emitting fluorescence probe. The study showed that the fluorescence of TTMAAlPc could be quenched by RNA with high efficiency in weak alkaline media, and the degree of quenching has a linear relationship with RNA in a wide concentration range. The mechanism of quenching behavior of RNA on TTMAAlPc was discussed. It was attributed by the static interaction between RNA and TTMAAlPc, and the assembly of TTMAAlPc induced by RNA. Based on this new discovery, a novel method for quantitative determination of RNA at nanogram level has been established. The factors, including the pH of medium, buffer system, reaction time, reaction temperature, the usage of TTMAAlPc as well as the interferences, which affected the determination, were investigated and discussed. Under optimum conditions, the linear range of the calibration curve was 7.71～1 705.57 ng·mL-1. The detection limit for RNA was 1.55 ng·mL-1. This method has been applied to the analysis of practical samples with satisfied results. The constructed method is of high sensitivity and has a wide linear range, it also showed strong ability in the tolerance of foreign substances from anions, cations, surfactants and vitamins, all of which are common interferences encountered in the determination of RNA. Besides, it is the first report that the fluorescence quantum yield of TTMAAlPc has been measured at different pH by reference method in this work. The achieved data indicated that the fluorescence quantum yield of TTMAAlPc is larger than 20% and it keeps constant in a wide range of acidity, implying that TTMAAlPc is a high-quality red-emitting fluorescence probe, it has great potential for practical applications, thus is worthy of further study. This work expands the application of phthalocyanine compound in analytical sciences.

Phthalocyanine; Fluorescence; RNA; Determination

Jan. 15, 2015; accepted Apr. 16, 2015)

2015-01-15，

2015-04-16

國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃項(xiàng)目(90206016)， 福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Y0081)， 省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1102， 2015R1101031-2)和廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20143015)資助

郭夢林， 女， 1990年生， 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心碩士研究生 e-mail: 2452013115357@stu.xmu.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: Lidh@xmu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)03-0749-06