復(fù)合酶法提取五味子果肉中總酚的工藝研究

張悅怡，趙　巖，蔡恩博，楊　鶴，劉雙利，張連學(xué)

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 吉林人參研究院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

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復(fù)合酶法提取五味子果肉中總酚的工藝研究

張悅怡1,2，趙巖1，蔡恩博1，楊鶴1，劉雙利1，張連學(xué)1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 吉林人參研究院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

[摘要]【目的】 采用復(fù)合酶輔助法提取五味子果肉中的總酚類物質(zhì)，為五味子的綜合利用提供參考?！痉椒ā?以五味子果肉為原料，從9種生物酶中優(yōu)選出果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶4種酶，在單因素(酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH、酶添加量)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)及方差分析確定復(fù)合酶法提取五味子果肉總酚的最佳條件?！窘Y(jié)果】 單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著酶解時(shí)間和pH的增加，4種酶處理五味子果肉總酚提取率總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。隨著酶解溫度和酶添加量的增加，果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶處理五味子果肉總酚提取率呈先上升后下降趨勢(shì)，而漆酶處理總酚提取率與以上三者不同。通過(guò)正交試驗(yàn)，得到五味子果肉總酚提取的最佳條件為添加 1.0% 果膠酶、3.0%纖維素酶、3.0%中性蛋白酶、5.0%漆酶(以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，pH 5.0，酶解時(shí)間20 min，溫度30 ℃，在此條件下五味子果肉總酚的提取率為2.83%，高于單酶處理總酚提取率，是無(wú)酶工藝(1.19%)的2.38倍?！窘Y(jié)論】 得到的復(fù)合酶輔助提取法能夠明顯提高五味子果肉總酚提取率，且工藝簡(jiǎn)單，可用于規(guī)?；a(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]五味子果肉；復(fù)合酶；總酚；提取

五味子為木蘭科植物五味子(Schisandrachinenise(Turcz.) Baill)的干燥成熟果實(shí)，俗稱北五味子，其味酸甘、性溫，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子有保肝益腎、保護(hù)心腦血管、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和增強(qiáng)免疫等作用[2-3]。五味子作為一種新型的“藥食同源”功能性保健食品，其果實(shí)已成為新興食品工業(yè)的一種重要原料。近年來(lái)，市場(chǎng)上有多種五味子產(chǎn)品問(wèn)世，如五味子保健飲料、果醋、果酒等[4-6]。這些產(chǎn)品的生產(chǎn)均以五味子鮮果為原料，隨著人們對(duì)保健食品的認(rèn)可度不斷提高，市場(chǎng)上對(duì)五味子的需求量逐年劇增，使得加工過(guò)程中產(chǎn)生了大量五味子果渣，這些果渣均被遺棄而未能充分利用，對(duì)環(huán)境也造成了嚴(yán)重影響[7]。

大量研究證明，五味子中含有多種生物活性成分，如木脂素、酚類成分、氨基酸、維生素等[8]，而多酚物質(zhì)具有廣泛的生物活性， 包括抗氧化、抗輻射、清除自由基、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、舒張血管、抗菌等作用[9-11]。因此，充分利用五味子加工果渣具有廣闊的發(fā)展前景。

生物酶作為一種特殊的以蛋白質(zhì)形式存在的生物催化劑，在啤酒、果汁果酒、紡織、飼料、皮革、酒精生產(chǎn)等行業(yè)均得到了廣泛應(yīng)用，更以其特異、高效、綠色環(huán)保等特點(diǎn)而備受青睞。目前，對(duì)五味子多糖的提取研究主要是用單酶方法[12]，其原理是利用酶對(duì)細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中大分子的降解，促使植物有效成分釋放；該方法反應(yīng)條件溫和，是一種高效、環(huán)保的植物有效成分提取技術(shù)[13-15]，提取條件溫和、能耗低、無(wú)污染[16]。因此，本研究將果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶按科學(xué)的配比制成復(fù)合酶，對(duì)原料五味子果肉進(jìn)行預(yù)處理，將五味子種子與果肉分離，分析復(fù)合酶提取條件下五味子果肉酚類成分的提取率，以期為五味子的綜合應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

五味子購(gòu)于當(dāng)?shù)厮幉氖袌?chǎng)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)張連學(xué)教授鑒定為木蘭科植物五味子(Schisandrachinenise(Turcz.) Baill)的成熟果實(shí)，將果肉和種子分離，陰干，分別粉碎，備用。

1.2試劑與儀器

主要試劑有：沒(méi)食子酸，北京百靈威科技有限公司生產(chǎn)；福林酚試劑，合肥博美生物生產(chǎn)；中溫淀粉酶(3 000 U/g)、中性蛋白酶(20 萬(wàn)U/g)、α-淀粉酶(1 萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(200 萬(wàn)U/g)、纖維素酶(26 萬(wàn)U/g)、甘露聚糖酶(20 萬(wàn)U/g)、果膠酶(4 萬(wàn)U/g)、木聚糖酶(30 萬(wàn)U/g)、漆酶(2 萬(wàn)U/g)，由蘇州昆藍(lán)生物科技有限公司提供。其他試劑均為分析純。

主要儀器包括：港威超聲儀(江蘇省張家港市港威超聲電子有限公司)、流水式中藥粉碎機(jī)(中國(guó)浙江溫嶺市大海藥材器械廠)、百靈LA114型電子天平(常熟市百靈天平儀器有限公司)、UV-754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(山東高密彩虹分析儀器有限公司)、HH-W-600型數(shù)顯恒溫水箱(金壇市江南儀器廠)。

1.3方法

1.3.1單酶優(yōu)選試驗(yàn)精密稱取五味子果肉0.25 g，置于100 mL三角瓶中，分別加入中溫淀粉酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶、木聚糖酶、漆酶9種生物酶，在酶解溫度為50 ℃、pH 6.0條件下酶解30 min，以總酚提取率為指標(biāo)，以無(wú)酶樣品作為對(duì)照，優(yōu)選作用較強(qiáng)的4種單酶，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.2單因素試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH以及酶添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察以上4個(gè)因素對(duì)總酚提取率的影響。

(1)酶解時(shí)間對(duì)總酚提取率的影響。在酶解溫度50 ℃、pH=6.0、酶添加量均為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)條件下，考察果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶不同酶解時(shí)間(0，10，20，30，60 min)對(duì)總酚提取率的影響。

(2)酶解溫度對(duì)總酚提取率的影響。在酶解時(shí)間為20 min、pH=6.0，酶添加酶量均為1%條件下，考察果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶在不同酶解溫度(30，40，50，60 ℃)對(duì)總酚提取率的影響。

(3)酶解pH對(duì)總酚提取率的影響。在果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶酶解溫度分別為40，40，50，30 ℃，酶解時(shí)間為20 min，酶添加量均為1%的條件下，考察酶解pH(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0)對(duì)總酚提取率的影響。

(4)酶添加量對(duì)總酚提取率的影響。在果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶酶解溫度分別為40，40，50和30 ℃，pH分別為5.0，5.0，4.0，5.0，酶解時(shí)間均為20 min條件下，考察不同酶添加量(0，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))對(duì)總酚提取率的影響。

1.3.3多因素正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了優(yōu)化提取工藝，選取果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶、漆酶添加量以及pH、酶解時(shí)間、酶解溫度7個(gè)因素，設(shè)計(jì)L8(27)正交試驗(yàn)，確定復(fù)合酶法提取五味子果肉總酚的最佳條件，優(yōu)化提取工藝，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

表 1　五味子果肉總酚提取工藝的L8(27)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素與水平

1.3.4總酚提取率的測(cè)定采用比色法測(cè)定五味子果肉中的總酚含量：精密吸取樣品溶液0.5 mL，置于25 mL量瓶中，加入福林酚試劑2.5 mL、碳酸鈉溶液(75 g/L)2 mL，于50 ℃水浴加熱5 min，冷卻后用蒸餾水定容，然后在760 nm測(cè)定供試品質(zhì)量濃度。提取率采用外標(biāo)一點(diǎn)法[17]進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

式中：ρ供試品質(zhì)量濃度(mg/mL)，v為供試品體積(μL)，D為稀釋倍數(shù)，m為供試品的質(zhì)量(g)。

2結(jié)果與分析

2.1五味子果肉總酚提取生物酶的優(yōu)選

由圖1可知，與無(wú)酶處理(對(duì)照)相比，9種酶對(duì)五味子果肉總酚提取率均有不同程度的提升作用，并以果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶4種酶效果較好，故選擇該4種酶作為五味子果肉總酚提取用生物酶。

圖 1　9種酶對(duì)五味子果肉總酚提取率的影響

2.2五味子果肉總酚提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1酶解時(shí)間酶解時(shí)間對(duì)五味子果肉總酚提取率的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚提取率也不斷上升，至20 min時(shí)4種酶處理的五味子總酚提取率達(dá)到最大值；此后總酚提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。可知酶解時(shí)間以20 min為宜。

2.2.2酶解溫度酶解溫度對(duì)五味子果肉總酚得率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度的升高，果膠酶、纖維素酶和漆酶處理五味子果肉總酚提取率都逐漸增大，分別在40，40和50 ℃達(dá)到最高值，之后隨溫度的繼續(xù)升高總酚提取率均降低；在30～60 ℃時(shí)，漆酶處理五味子果肉總酚提取率隨著酶解溫度的升高而下降，因此在30 ℃時(shí)，其總酚提取率最高。

圖 2　酶解時(shí)間對(duì)五味子果肉總酚提取率的影響

2.2.3酶解pHpH值對(duì)五味子果肉總酚提取率的影響如圖4所示。由圖4可知，在pH為3.0～7.0 時(shí)，隨pH升高，4種酶處理五味子果肉總酚提取率均呈先升后降趨勢(shì)，其中中性蛋白酶在pH為4.0時(shí)，總酚提取率達(dá)到最高；果膠酶、纖維素酶、漆酶均在pH為5.0的弱酸性條件下有較好的酶解效果，此時(shí)總酚提取率均較高。

2.2.4酶添加量酶添加量對(duì)五味子果肉總酚提取率的影響如圖5所示。由圖5可知，添加酶后樣品總酚提取率比無(wú)酶樣品均有明顯增加，且隨著酶添加量的增加，果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶均在添加量為1.0%時(shí)總酚提取率達(dá)到最高；隨著添加量的增加，漆酶處理五味子果肉總酚提取率持續(xù)升高，在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)其添加量為5.0%時(shí)，總酚提取率達(dá)到最高。

圖 4　酶解pH值對(duì)五味子果肉總酚提取率的影響

2.3五味子果肉總酚提取多因素正交試驗(yàn)的結(jié)果

由表2和表3可以看出，各因素對(duì)五味子果肉總酚提取率影響的大小依次為果膠酶添加量、中性蛋白酶添加量、酶解時(shí)間、纖維素酶添加量、pH值、酶解溫度、漆酶。綜合考慮原輔料成本及能耗等因素，確定復(fù)合酶法提取五味子果肉的最佳工藝條件為，A1B2C2D2E2F1G1，即果膠酶添加量1.0%，纖維素酶添加量3.0%，中性蛋白酶添加量3.0%，漆酶添加量5.0%，pH 5.0，酶解時(shí)間20 min，溫度30 ℃。進(jìn)一步開(kāi)展驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下五味子果肉總酚提取率為2.83%，是無(wú)酶工藝(1.19%)的2.38倍。

表 2　五味子果肉總酚提取工藝優(yōu)化的L8(27)正交試驗(yàn)結(jié)果

表 3　五味子果肉總酚提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

3結(jié)論

本試驗(yàn)采用復(fù)合酶輔助提取法對(duì)五味子果肉中酚類成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，使五味子果肉中的總酚提取率得到了大幅度的提高。通過(guò)正交試驗(yàn)，得出復(fù)合酶輔助提取法的最佳工藝參數(shù)為：果膠酶添加量1.0%，纖維素酶添加量3.0%，中性蛋白酶添加量3.0%，漆酶添加量5.0%，pH 5.0，酶解時(shí)間20 min，溫度30 ℃。五味子果肉主要成分為多酚類，該工藝中的中性蛋白酶能夠高效水解蛋白質(zhì)，漆酶能夠催化木質(zhì)素類成分降解，纖維素酶能夠催化水解纖維素，而果膠酶具有針對(duì)果膠的解酯、水解、破裂作用，在本研究最佳提取條件下，五味子果肉總酚提取率為2.83%，是無(wú)酶工藝(1.19%)的2.38倍。因此4種酶相互作用，使五味子果肉總酚提取率高于單一酶作用效果，更高于無(wú)酶工藝，基于酚類的顯著作用，其大量、高效率生產(chǎn)為五味子新產(chǎn)品(食品、藥品、保健食品)的研究與開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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Extraction technology of total phenol from flesh ofSchisandrachinensisby compound enzymatic hydrolysis

ZHANG Yue-yi1,2,ZHAO Yan1,CAI En-bo1,YANG He1,LIU Shuang-li1,ZHANG Lian-xue1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2JilinGinsengInstitute,Changchun,Jilin130021,China)

Abstract:【Objective】 The total phenol was extracted of Schisandra chinenise (Turcz.) Baill flesh by compound enzyme hydrolysis method to improve the utilization of Schisandra.【Method】 Pectinase,cellulose,neutral protease and laccase were selected from 9 enzymes and orthogonal experiments and variance analyses were conducted to determine the optimum conditions for phenol extraction based on tests of single factor (hydrolysis time,hydrolysis temperature,pH,enzyme dosage).【Result】 With the increase of hydrolysis time and pH,treatment of Schisandra fruit with the selected 4 enzymes increased the total phenol extraction yield first but decreased subsquently.As the increase of hydrolysis temperature and enzyme dosage,treatment of Schisandra fruit by pectinase,cellulose,and neutral protease increased total phenol extraction yield first and decreased subsquently,while total phenol extraction yield after laccase treatment was different from the other three.The optimum conditions were:pectinase 1.0%,cellulose 3.0%,neutral protease 3.0%,laccase 5.0 %,pH 5.0,time 20 min,and temperature 30 ℃.Under the optimal conditions,the yield of total phenol was 2.83%,which was 2.38 timers of that of the traditional process (1.19%). 【Conclusion】 Enzyme-assisted method was efficient and time-saving with simple operation and good stability.It can be used for industrial production.

Key words:Schisandra chinensis fruits;compound enzymes;total phenol;extraction

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.026

[收稿日期]2014-07-09

[基金項(xiàng)目]國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303111)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20140204013YY,20150307012YY)

[作者簡(jiǎn)介]張悅怡(1990-)，女，吉林長(zhǎng)春人，碩士，主要從事天然藥物化學(xué)成分與生物活性研究。

[通信作者]趙巖(1979-)，男，吉林長(zhǎng)春人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學(xué)成分與生物活性研究。

[中圖分類號(hào)]Q949.95；S567

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)02-0187-06

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