慢性砷暴露對大鼠組織與免疫細(xì)胞功能的影響

許智鴻， 王冰焱， 王雅華， 王亞琦， 吳秋妹， 章　濤

福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，福州　350108

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慢性砷暴露對大鼠組織與免疫細(xì)胞功能的影響

許智鴻， 王冰焱， 王雅華， 王亞琦， 吳秋妹， 章濤

福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，福州350108

摘要:目的觀察慢性砷暴露對大鼠肝、脾、腦及巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞的影響。方法20只大鼠隨機分為對照組和低、中、高濃度染砷組。灌胃給藥喂養(yǎng)大鼠12周，觀察大鼠的一般情況和體質(zhì)量變化；取肝、脾等組織行H-E染色制備切片，觀察組織形態(tài)學(xué)變化；中性紅法測定光密度值(OD)檢測腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能；流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)果慢性高濃度砷暴露大鼠個別出現(xiàn)姿勢和行為異常；染砷組和對照組大鼠體質(zhì)量比較，有不同程度的下降(P<0.05)；染砷組各組織切片可見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤；高濃度染砷組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實驗OD值明顯低于對照組(P<0.05)；中、高濃度染砷組外周血CD3+T細(xì)胞比例均低于對照組(P<0.05)，低濃度染砷組大鼠外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值高于對照組(P<0.05)，高濃度染砷組CD4+/CD8+比值低于對照組(P<0.05)。結(jié)論慢性砷暴露對大鼠組織具有損害作用，并可能是通過影響巨噬細(xì)胞功能和T淋巴細(xì)胞亞群比例影響大鼠免疫功能。

關(guān)鍵詞:慢性??； 砷； 亞砷酸鹽類； 病理學(xué)； 巨噬細(xì)胞； T淋巴細(xì)胞

砷作為食物、土壤和水中自然存在的元素，其復(fù)合物或化合物是毒物和致癌物。人們主要通過環(huán)境污染或職業(yè)暴露接觸該致癌物，當(dāng)攝入超過排泄時，攝入體內(nèi)的砷可經(jīng)血液迅速分布至全身，引起慢性砷中毒[1]。砷暴露的機制尚未完全明確，同時有很多研究是立足于實驗動物自由飲用的給藥方式，對砷中毒患者免疫球蛋白水平的報道也并不一致[2]。本研究采用對實驗動物灌胃的給藥方式，觀察砷暴露對機體免疫系統(tǒng)的影響和表現(xiàn)，并通過分析免疫細(xì)胞中巨噬細(xì)胞吞噬功能的改變和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化，初步探討慢性砷暴露對大鼠組織和免疫功能的影響。

1材料與方法

1.1儀器與試劑紫外分光光度計(Thermo Drop2000，美國Thermo Fisher公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3111型，美國Thermo Fisher公司)；流式細(xì)胞儀(FACSVerse，美國BD公司)；亞砷酸鈉(成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)；大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液(美國Biolegend公司)；大鼠抗體(FITC/CD3及APC/CD4，美國Biolegend公司)。

1.2分組與染砷方式選用20只健康雄性昆明種大鼠，體質(zhì)量115～140 g[吳氏實驗動物貿(mào)易有限公司，許可證：SCXK(滬)2002-0003，合格證：2007000551273]；大鼠經(jīng)口半數(shù)致死量(median lethal dose,LD50)的結(jié)果為46.4 mg/kg(霍恩式法)，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按每組3只隨機分成對照組和低、中、高濃度染砷組(低、中、高濃度組)[3]，各染砷組濃度分別為LD50的1/40(0.125 mg/mL)，1/20(0.25 mg/mL)和1/10(0.5 mg/mL)[4]，均采用灌胃給藥，其中對照組給予雙蒸水灌胃，按照毒理學(xué)試驗基礎(chǔ)設(shè)計[5]，灌胃前隔夜禁食，每天固定時間喂養(yǎng)12周。

1.3觀察與檢測指標(biāo)

1.3.1體質(zhì)量及一般情況每天觀察記錄動物攝食、飲水、活動、精神狀態(tài)等一般情況；每周固定時間點記錄大鼠空腹體質(zhì)量，并根據(jù)大鼠每周的平均體質(zhì)量調(diào)整各組砷含量。

1.3.2組織病理學(xué)檢測取所需肝臟、脾臟、大腦、小腸、胸腺組織塊，經(jīng)甲醛固定后進行脫水與包埋，包埋完的組織塊放入-4 ℃冰箱保存，后行切片、染色、封片，于顯微鏡下觀察[6-8]。

1.3.3檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能實驗前1天注射6%淀粉生理鹽水，24 h后抽取腹腔滲出液，離心8 min，重懸，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞數(shù)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，去除培養(yǎng)液，每孔加中性紅溶液培養(yǎng)30 min，期間觀察細(xì)胞的形態(tài)；棄去中性紅，加細(xì)胞裂解液，室溫放置5 h，顯微鏡觀察見細(xì)胞溶解后于540 nm處測定OD值。

1.3.4檢測T淋巴細(xì)胞分群大鼠麻醉后斷尾，取新鮮外周血；稀釋后加到淋巴細(xì)胞分離液中，形成明顯的界面；離心15 min后吸取中層呈白絮狀的淋巴細(xì)胞，洗滌離心2次，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞量為1×107mL-1，取適量細(xì)胞至相應(yīng)管中加抗體染色，室溫避光，離心，去上清；用固定液(1%多聚甲醛)固定。流式細(xì)胞儀測定T淋巴細(xì)胞亞群。

2結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量變化及一般情況改變灌胃開始前，各組大鼠進食和飲水情況正常，毛發(fā)具有正常光澤度，精神狀態(tài)良好；灌胃3周后，中、高濃度組大鼠出現(xiàn)煩躁，互相抓咬，其中高濃度組1只大鼠體形異常，身體與頭部之間發(fā)生明顯扭曲，鼻孔有出血跡象，有進食糞便情況；灌胃4周后，高濃度組1只大鼠腹部毛發(fā)發(fā)黃，并開始脫落，表皮角化過度，發(fā)黃處皮膚逐漸發(fā)紅發(fā)黑并潰爛。實驗期間各組大鼠體質(zhì)量均有增長，自第6周開始增長均減慢，與對照組比較，低、中、高濃度組大鼠體質(zhì)量增長幅度有所下降，其中高濃度組尤為明顯，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1)。

表1　各組大鼠體質(zhì)量

與對照組比較，☆：P<0.05.

2.2組織切片病理學(xué)改變

2.2.1肝臟對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核膜清晰可見，胞質(zhì)染色均勻；低濃度組未見明顯的形態(tài)學(xué)改變，肝細(xì)胞無明顯異常，有輕微水腫，偶見雙核，肝細(xì)胞核周可見未知黑色小顆粒；中濃度組中央靜脈輕微擴張，細(xì)胞水腫明顯，匯管區(qū)可見小灶狀炎性細(xì)胞浸潤；高濃度組肝竇擴張，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，呈彌漫性，雙核，肝細(xì)胞脂肪變，嗜酸性變性(圖2)。

2.2.2脾臟對照組脾臟呈粉紅色，被膜下為實質(zhì)，生發(fā)中心、邊緣區(qū)、紅白髓交界未見異常。染砷組脾臟體積增大，呈暗紅色，淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)不清，體積變大，生發(fā)中心不清楚，脾索增厚，血竇增生擴張，且部分區(qū)域可見含鐵血黃素細(xì)胞(圖3)。

2.2.3大腦對照組細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞間質(zhì)均勻致密。染砷組神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮均質(zhì)化，胞質(zhì)空泡形成，間質(zhì)疏松，低、中濃度組可見一定數(shù)量的基本正常的腦細(xì)胞；高濃度組神經(jīng)元幾乎全部變性壞死溶解，間質(zhì)更加疏松，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，可見缺血壞死灶(圖4)。

2.2.4空腸對照組空腸絨毛完整，排列緊密；吸收細(xì)胞呈柱狀，排列齊整。染砷組空腸部分絨毛不整齊；吸收細(xì)胞變矮、不規(guī)則、核固縮、染色深；杯狀細(xì)胞增多；黏膜固有層內(nèi)炎性細(xì)胞增多，毛細(xì)血管擴張，充血；小腸腺部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡(圖5)。

2.2.5胸腺對照組胸腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，髓質(zhì)與皮質(zhì)未見特殊變化。染砷組胸腺小體部分?jǐn)U大，細(xì)胞間隙增大，且充血嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞增多(圖6)。

2.3巨噬細(xì)胞吞噬功能改變對照組及低、中、高濃度組的OD值分別為(0.060±0.005)，(0.071±0.006)，(0.055±0.006)和(0.038±0.005)。低、中濃度組與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高濃度組與對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖7)。

2.4流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞分群中、低濃度組大鼠外周血CD3+細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例低于對照組，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；中、高濃度組大鼠外周血CD3+細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例低于對照組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；染砷組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；低濃度組大鼠外周血CD4+/CD8+比值高于對照組(P<0.05)，中濃度組大鼠外周血CD4+/CD8+比值低于對照組，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高濃度組大鼠外周血CD4+/CD8+比值低于對照組(P<0.05)；染砷組間比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(圖8，9，表2)。

3討論

本實驗中出現(xiàn)的一般情況、體質(zhì)量變化，與李艷紅等報道的砷中毒患者皮膚改變的癥狀相類似[7]，提示砷對大鼠機體的影響最初可表現(xiàn)在固有免疫系統(tǒng)的皮膚黏膜屏障；其次是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，特別是小腦平衡功能上，由于樣本量較少，其作用機

n=3.與對照組比較，☆：P<0.05；☆☆：P<0.05.

制還有待進一步的探索；從大鼠的體質(zhì)量增長來看，亞砷酸鈉可以抑制大鼠體質(zhì)量的正常增加，并呈濃度依賴反應(yīng)，可能與砷對機體內(nèi)分泌、消化及免疫系統(tǒng)的影響等密切相關(guān)[8-9]。

砷是一種胞質(zhì)毒物，可在體內(nèi)臟器組織中蓄積，使細(xì)胞代謝發(fā)生障礙，并對多種酶有抑制作用，引起免疫、消化、神經(jīng)系統(tǒng)等多個重要器官發(fā)生病變[10]。動物實驗表明，砷暴露可導(dǎo)致大鼠某些臟器發(fā)生病理學(xué)改變[11]。本實驗通過對各濃度大鼠主要的免疫器官組織及小腦、小腸進行病理學(xué)切片分析證實此觀點。

劉佳等的小鼠碳粒廓清實驗表明，隨砷濃度的增大，小鼠對碳粒的清除功能呈下降趨勢(P<0.05)，提示砷對巨噬細(xì)胞本身有損傷作用[12]。成靜等的碳粒廓清實驗表明，砷中毒可降低小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能[13]。本實驗可見，低濃度組大鼠與對照組比較，OD值雖有所升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，也有可能是濃度過低時巨噬細(xì)胞反而被激活，增強其吞噬功能；而高濃度組OD值明顯低于對照組，意味著染砷組的吞噬功能明顯降低，大鼠的固有免疫受到了明顯的抑制，但其具體機制還有待進一步探究。

本實驗采用的流式細(xì)胞技術(shù)分析為定量分析，相較于免疫組織化學(xué)等方法，能夠更精確、更全面反映目標(biāo)細(xì)胞的情況。但其缺點是必須采用新鮮標(biāo)本制取的單細(xì)胞懸液，組織標(biāo)本不能保存[14]。本實驗中，低濃度組與對照組比較，CD3+細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例上無顯著變化，中、高濃度組大鼠低于對照組；低濃度組CD8+T淋巴細(xì)胞比例降低、CD4+T淋巴細(xì)胞比例升高及其CD4+/CD8+比值升高，中、高濃度組則與低濃度組相反。染砷組CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的正常比例發(fā)生變化，提示細(xì)胞免疫受到了不同程度的免疫抑制[15]。

針對低劑量砷導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的比值升高，Genevan等的文章表明，低濃度砷對淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)起到促進作用，這可能是低濃度長期接觸砷而導(dǎo)致皮膚癌前病變時核過度分裂的基礎(chǔ)，DNA復(fù)制因增殖過快發(fā)生錯誤[16]。對于中、高濃度組的實驗結(jié)果，有文獻(xiàn)報道，亞砷酸鈉染砷可導(dǎo)致被激活的T細(xì)胞細(xì)胞骨架發(fā)生變化，T細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)運功能受到影響[17]。Galicia等的動力學(xué)實驗顯示，亞砷酸鈉可能會抑制T細(xì)胞 IL-2功能表達(dá)，進而降低CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的比值[18]。這些因素的綜合作用，導(dǎo)致染砷組大鼠的免疫調(diào)節(jié)失衡，免疫系統(tǒng)免疫監(jiān)控作用減弱。已有研究表明，長期的免疫調(diào)節(jié)失衡和監(jiān)控作用減弱終將會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[19]。

綜上所述，從最初的固有免疫包括皮膚黏膜屏障觀察，3周時間即可出現(xiàn)較為特殊的病理性砷中毒表現(xiàn)；繼而從巨噬細(xì)胞吞噬功能、T淋巴細(xì)胞亞群比例分析，尤其是CD4+細(xì)胞的減少，不僅可導(dǎo)致機體細(xì)胞免疫能力下降，還可能使體液免疫功能受到影響。CD4+細(xì)胞可分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，其中Th1是細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效誘導(dǎo)者，能夠增強單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的殺菌毒性和溶解細(xì)胞內(nèi)微生物的效率；Th2細(xì)胞在輔助B淋巴細(xì)胞發(fā)展為抗體分泌細(xì)胞方面非常有效[20]。因此，砷中毒不僅可導(dǎo)致機體細(xì)胞免疫能力下降，還可能使體液免疫功能受到影響，所以T淋巴細(xì)胞亞群可能是砷暴露非常敏感的健康效應(yīng)指標(biāo)之一。組織學(xué)的觀察直觀證實了砷中毒對動物及人體的危害。

(致謝：感謝吳林青、韓艷非、郭瑋老師，陳杏婷、李曉童、耿海麗等學(xué)姐們的幫助。)

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(編輯:張慧茹)

The Effects of Chronic Arsenic Exposure on the Tissue and Immune Cells of Rats

XU Zhihong, WANG Bingyan, WANG Yahua, WANG Yaqi, WU Qiumei, ZHANG Tao

Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350108,China

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effects of chronic arsenic exposure on tissues (liver, spleen and other tissues) and immune cells (macrophage and T cells) of rats.Methods20 rats were randomly divided into control group and low, middle and high concentration of arsenic.The general conditions and changes in body weight of rats were observed during 12 weeks during which time the rats were fed with arsenic.The histological damage in liver, spleen and other tissues were examined with H-E staining.The phagocytosis of peritoneal macrophages was measured by neutral red method.The percentage of T lymphocytes were identified by flow cytometry.ResultsRats exposured to high concentrations of arsenic showed abnormal gestures and behaviors and weight loss compared with the control group (P<0.05).Histopathological data showed tissue inflammation with arsenic exposure.The phagocytosis of peritoneal macrophages was significantly decreased in rats with high concentrations of arsenic exposure (P<0.05) compared with the control group.The percentage of CD3+ T cells and the ratio of CD4+/CD8+ T cells were lower (P<0.05).ConclusionThe tissues are damaged with chronic arsenic exposure in rats while the immune function is impaired possibly by effects on the function of macrophages and T lymphocyte subsets in rats.

KEY WORDS:chronic disease； arsenic； arsenites； pathology； macrophages； T-lymphocytes

收稿日期:2015-09-24

基金項目:國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410392025)；福建省自然科學(xué)基金(2014J01334)

作者簡介:許智鴻(1994-)，男，福建醫(yī)科大學(xué)2012級五年制麻醉學(xué)專業(yè)通訊作者: 章濤. Email：zjdrzht@mail.fjmu.edu.cn

中圖分類號:R332； R361； R977； R995

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-4194(2016)01-0006-05