合成多肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)抑制作用

陳吉 殷玉和 李玲玲 金浩 唐銘一 吳叢梅

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院，長春 130012）

合成多肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)抑制作用

陳吉 殷玉和 李玲玲 金浩 唐銘一 吳叢梅

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院，長春 130012）

評(píng)價(jià)合成多肽對(duì)人白血病單核巨噬細(xì)胞THP-1的毒性和對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的胞內(nèi)抑菌作用。 通過多肽的不同給藥濃度，確定多肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌的最小抑菌濃度（MIC），利用流式細(xì)胞術(shù)方法和MTT法檢測2號(hào)肽對(duì)細(xì)胞THP-1的毒性作用，同時(shí)采用CFU方法檢測其對(duì)H37Rv菌株的胞內(nèi)抑菌作用。篩選的4條多肽均有抑菌作用，其中2號(hào)肽的最小抑菌濃度（MIC）最小，為200 μg/mL。2號(hào)肽與細(xì)胞THP-1作用時(shí)，濃度為1 200 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，與 INH細(xì)胞毒性無顯著差別。對(duì)于胞內(nèi)H37Rv，2號(hào)肽抗結(jié)核作用具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)，隨給藥時(shí)間和劑量的增加H37Rv菌落數(shù)明顯下降。2號(hào)肽不僅對(duì)巨噬細(xì)胞THP-1的毒性小，而且具有較好的抗胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌活性，是一種潛在的抗結(jié)核新型藥物。

合成多肽；結(jié)核桿菌；巨噬細(xì)胞；胞內(nèi)抑菌

多肽通常認(rèn)為是所含氨基酸數(shù)量在50-100的小分子蛋白，因?yàn)橐子诤铣膳c優(yōu)化組合，使其在藥物研發(fā)中表現(xiàn)出特定的優(yōu)勢和臨床價(jià)值［1］。結(jié)核桿菌的持留性和耐藥性使抗結(jié)核病成為近年來中國所面臨的重要問題之一［2］，結(jié)核桿菌基因組測序完成后，針對(duì)結(jié)核桿菌的多肽抑制劑研究成為新的藥物研發(fā)方向［3，4］。

異檸檬酸裂解酶（ICL）是結(jié)核桿菌在人體內(nèi)處于持續(xù)感染狀態(tài)時(shí)乙醛酸支路代謝中的關(guān)鍵酶，是其潛伏狀態(tài)下利用碳源所必需的［5］。本課題組前期工作即以結(jié)核桿菌ICL作為靶點(diǎn)篩選可以抑制細(xì)菌生長的多肽，且利用噬菌體肽庫篩選技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)，優(yōu)化篩選出4種異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑［6］。本研究進(jìn)一步檢測這4種多肽的細(xì)胞毒性和胞內(nèi)抑菌作用，以期獲得潛在的抗結(jié)核新型藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及菌種 結(jié)核分枝桿菌人型無毒株H37Rv（利福平、異煙肼敏感菌種）由中國藥品生物制品檢定所饋贈(zèng)。人白血病單核巨噬細(xì)胞THP-1由吉林大學(xué)疫苗研究實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。菌株和細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代保存。

1.1.2 肽類化合物及試劑 4種肽類化合物由本實(shí)驗(yàn)組合成（表1）。

表14 種肽類化合物

二甲基亞砜（DMSO）；DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma 公司）；胎牛血清（FBS美國Gibco公司）；PI 染料（Sigma 公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，購自北京化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 多肽MIC檢測 將篩選出的4 條多肽用DMSO稀釋，使其終濃度為100、200、500、800、1 000和1 500 μg/mL，分別加到含正常培養(yǎng)基的H37Rv菌株培養(yǎng)液的24孔板中，37℃培養(yǎng)2-3周觀察結(jié)果。同時(shí)以利福平（RMP，濃度為0.5 μg/mL）和異煙肼（INH，濃度為0.2 μg/mL）作為陽性對(duì)照。以正常H37Rv培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。觀察長菌情況，并記錄各種多肽的MIC。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測定2號(hào)肽對(duì)THP-1細(xì)胞的毒性 收集THP-1細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液后，加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)液，按4.0×105個(gè)細(xì)胞每孔接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，加入2號(hào)肽，藥物濃度分別為0、200、400、800、1 000和1 200 μg/mL，各種用藥濃度分別作用1、3、5和7 d，并分別設(shè)置加 PBS、1% DMSO、含400 μg/mL的INH為陽性對(duì)照。取出與藥物作用后的細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，再用預(yù)先冰浴的PBS緩沖溶液洗兩次，每次1.0 mL。75%冰乙醇固定過夜，離心收集細(xì)胞，用300目篩過濾一次，加碘化丙錠PI反應(yīng)15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.3 MTT法測定2號(hào)肽對(duì)細(xì)胞THP-1的毒性 將穩(wěn)定感染的細(xì)胞接種于96孔板，每孔4×104個(gè)細(xì)胞。向孔內(nèi)加入RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）100 μL，其中分別含有2號(hào)肽濃度為0、500、800、1 000、1 200、1 500、1 800和2 000 μg/mL設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)用不含藥物的RPMI1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照，含400 μg/mL的INH為陽性對(duì)照。分別于0、4及7 d向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加入10 μL濃度為 5 mg/mL的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，離心棄上清，每孔加100 μL DMSO，混勻后室溫放置20 min，于570 nm檢測吸光值。按下述公式計(jì)算巨噬細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=（感染細(xì)菌孔A均值-培養(yǎng)液對(duì)照孔A均值）/（未感染細(xì)菌孔A均值-培養(yǎng)液對(duì)照孔A均值）×100%

1.2.4 多肽對(duì)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)H37Rv株抑制作用檢測 細(xì)菌與巨噬細(xì)胞的比例為10∶1（H37Rv濃度1×107/mL，THP-1細(xì)胞密度1×106/mL）混合，在終濃度為100 mmol/L的丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）中誘導(dǎo)細(xì)胞分化。96孔板每孔加100 μL菌懸液，感染4 h后，每孔加含不同濃度目的肽100 μL繼續(xù)培養(yǎng)，目的肽給藥濃度為0、500、800、1 000、1 200、1 500、1 800和2 000 μg/mL。同時(shí)用RPMI-1640完全培養(yǎng)液作空白對(duì)照，4 mg/mL的INH作陽性對(duì)照。以此時(shí)作為細(xì)菌感染零時(shí)，分別于感染后0、4及7 d去除板上培養(yǎng)液，每孔加入50 μL 1% Triton X-100裂解細(xì)胞。待其全部裂解后，每孔加50 μL RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液終止裂解?；靹蚝竺靠追謩e作1∶10和1∶100稀釋，接種于正常培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 d后計(jì)CFU。

2 結(jié)果

2.1 多肽最小抑菌濃度（MIC）檢測

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，合成4條多肽，檢測其對(duì)H37Ra菌株的MIC，同時(shí)設(shè)INH和RIFD對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。1，3和4號(hào)合成多肽的MIC均為500 μg/mL，而2號(hào)多肽的MIC為200 μg/mL。而對(duì)照組中，INH組MIC為0.2 μg/mL，RIF組MIC為0.5 μg/mL。

表2 各種化合物對(duì)H37Ra的最小抑菌濃度

2.2 多肽對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)以上研究結(jié)果，進(jìn)一步檢測2號(hào)多肽對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響。以終濃度分別為200、400、800、1 000和1 200 μg/mL五個(gè)梯度給藥，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。同時(shí)設(shè)PBS空白對(duì)照組，DMSO（1%）和INH對(duì)照組。結(jié)果（表3，圖1）表明，2號(hào)肽給藥組和INH對(duì)細(xì)胞的毒性沒有明顯差別，但這兩組細(xì)胞毒性均明顯大于PBS、DMSO（1%）對(duì)照組，且各組細(xì)胞毒性呈現(xiàn)一定的時(shí)相性，總體趨勢隨時(shí)間和濃度增加而增大。

2.3 MTT法測定2號(hào)肽的細(xì)胞毒性

細(xì)胞給予500-2 000 μg/mL不同劑量多肽，給藥后第4天和第7天采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和INH（終濃度為400 μg/mL）對(duì)照組。檢測結(jié)果（圖2）顯示，給藥后，2號(hào)多肽給藥組隨著給藥劑量的增加，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性降低，而且第7天細(xì)胞存活率明顯低于第4天細(xì)胞存活率。其中INH組細(xì)胞存活率低于2號(hào)肽給藥組。

2.4 篩選多肽對(duì)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)H37Rv株抑制作用的測定結(jié)果

進(jìn)一步檢測多肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)H37Rv菌的抑制作用。THP-1細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L PMA刺激48 h后細(xì)胞由分散、懸浮轉(zhuǎn)變?yōu)轲じ?、貼壁，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（圖3），細(xì)胞體積變大并生成偽足，表明細(xì)胞已經(jīng)有效貼壁。

以結(jié)核桿菌H37Rv感染THP-1細(xì)胞，吞噬對(duì)照菌落計(jì)數(shù)表明細(xì)菌已經(jīng)被細(xì)胞有效吞噬。當(dāng)2號(hào)肽終濃度為2 000 μg/mL時(shí)，與INH對(duì)照相比，胞內(nèi)細(xì)菌下降兩個(gè)數(shù)量級(jí)，細(xì)菌的生長被明顯抑制（圖4），這說明在較低的濃度下，2號(hào)肽表現(xiàn)出對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的抑制作用。通過t檢驗(yàn)分析，P＜0.05，即各實(shí)驗(yàn)組對(duì)胞內(nèi)菌均具有抑制作用，具有顯著性差異。

表3 不同時(shí)間、2號(hào)肽濃度下THP-1陽性細(xì)胞百分比/%

3 討論

目前多肽化學(xué)合成技術(shù)成熟，合成多肽容易與雜質(zhì)或副產(chǎn)品分離，純度高，部分多肽比小分子藥物用量少，選擇性更強(qiáng)，特異性更好，作用效果好同時(shí)副作用少，更加適合臨床應(yīng)用和市場開拓［7］。但是多肽也存在很多問題，例如，由于多肽分子大小，極性，親水性和帶電性等問題，使其缺乏細(xì)胞膜滲透力，影響細(xì)胞吸收［8，9］。

本課題組利用噬菌體肽庫篩選技術(shù)與計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接技術(shù)優(yōu)化異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑的篩選［10］。首先通過噬菌體肽庫篩選出與ICL具有高親和力的結(jié)合肽，然后利用Discovery Studio 2.1模擬分子對(duì)接，將成功對(duì)接的多肽采用Fmoc固相合成法，并對(duì)其生物活性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示所合成多肽均對(duì)ICL的活性有明顯的抑制作用（抑制率均超過50%）［11］。本研究中進(jìn)一步檢測所合成多肽的細(xì)胞毒性和胞內(nèi)抑菌效果。

圖1 各種試劑對(duì)THP-1細(xì)胞毒性測定結(jié)果

圖2 不同時(shí)間、藥物濃度對(duì)細(xì)胞存活率統(tǒng)計(jì)

首先檢測多肽的最小抑菌濃度MIC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，其中3條多肽的MIC較高（500 μg/mL），而2號(hào)多肽的MIC為200 μg/mL。本課題組設(shè)計(jì)并合成的4種肽類化合物作了多次實(shí)驗(yàn)，最終能達(dá)到的最好的純化度（表1），而且純度沒有明顯差別（其中2號(hào)和3號(hào)純度幾乎一致，分別為98.8%，98.5%）。但是最小的抑菌濃度相差較多，2號(hào)肽的MIC是200 μg/mL，而3號(hào)MIC為500 μg/mL。因此，下步實(shí)驗(yàn)選擇2號(hào)多肽作為研究目標(biāo)。

選用人白血病單核巨噬細(xì)胞THP-1，檢測合成多肽細(xì)胞毒作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，2號(hào)多肽對(duì)細(xì)胞凋亡的作用與INH對(duì)照組沒有顯著的差異。而MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2號(hào)多肽組細(xì)胞存活率高于INH對(duì)照組。兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)，2號(hào)多肽的細(xì)胞毒性不高于INH，且細(xì)胞毒性有劑量和時(shí)間相關(guān)效應(yīng)，細(xì)胞毒性隨時(shí)間延長而增強(qiáng)，隨給藥劑量增大而增強(qiáng)。

進(jìn)一步檢測合成多肽的胞內(nèi)抑菌作用。THP-1細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L PMA刺激48 h后，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞明顯的形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞由分散、懸浮轉(zhuǎn)變?yōu)轲じ健①N壁，細(xì)胞體積變大并生成偽足，表明細(xì)胞已經(jīng)有效貼壁。以結(jié)核桿菌H37Rv感染THP-1細(xì)胞，計(jì)數(shù)吞噬對(duì)照菌落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染后細(xì)菌可在細(xì)胞內(nèi)繁殖，并隨著感染時(shí)間的延長數(shù)量增加。而給予藥物后，當(dāng)2號(hào)肽終濃度為800-2 000 μg/mL時(shí)，細(xì)菌的生長受到明顯的抑制，且明顯低于INH對(duì)照組（P<0.01）。這說明2號(hào)肽在較低的濃度下，就表現(xiàn)出對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的抑制作用。INH對(duì)靜止期的結(jié)核分枝桿菌具有抑制作用，但是沒有殺菌作用，而且長期使用可引起耐藥性。本研究中2號(hào)多肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺菌作用好于INH，是否是因?yàn)閮煞N藥物對(duì)靜止期細(xì)菌的不同影響，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

圖3 PMA誘導(dǎo)不同時(shí)間細(xì)胞分化結(jié)果

圖4 不同時(shí)間、濃度H37Rv菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)

4 結(jié)論

多肽類抑制劑具有很好的成藥物理參數(shù)，并且能在低濃度下有效抑制細(xì)菌生長，具有成藥潛力，是理想的抗結(jié)核藥物。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Intracellular Inhibitory Effect of Synthetic Peptide on Mycobacterium tuberculosis

CHEN Ji YIN Yu-he LI Ling-ling JIN Hao TONG Ming-yi WU Cong-mei
（School of Chemistry and Life Sciences，Changchun University of Technology，Changchun 130012）

This work is to evaluate the toxicity of the synthetic peptides on mononuclear macrophage THP-1 of human leukemia and the intracellular bacteriostatic effect on Mycobacterium tuberculosis H37Rv. The minimum inhibition concentration（MIC）of the synthetic polypeptide on H37Rv was determined through the different drug concentrations of poly-peptides. Then，the toxic effects of peptide-2 on THP-1 cells were detected using flow cytometry method and MTT method. The colony-forming unit（CFU）method was used for detecting intracellular bacteriostatic effect of peptide-2 on H37Rv. Results were as below：All 4 screened peptides had bacteriostatic effect，the MIC of peptide-2 was 200 mg/mL. When the peptides-2 interacted with THP-1 cells，the cytotoxicity emerged at the concentration of 1200 mg/mL，meaning that there was no significant difference from INH’s cytotoxicity. For intracellular H37Rv，the anti-tuberculosis effects of peptide-2 presented time- and dose- dependent effect，the H37Rv colony count was obviously decreased with the increase of the time and dose. In conclusion，not only has the peptide-2 small toxicity to the macrophage THP-1，but also solid intracellular anti-M. tuberculosis effect，and it can be a new and potential anti-tuberculosis drug.

synthetic peptide；Mycobacterium tuberculosis；macrophage；intracellular inhibitory

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.030

2015-07-06

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2008110）

陳吉，男，碩士，研究方向：生物工程學(xué)；E-mail：415786094@qq.com

吳叢梅，女，教授，研究方向：生物工程學(xué)；E-mail：wucmyue@sina.com