大腸桿菌氮代謝調(diào)節(jié)蛋白GlnG與固氮施氏假單胞菌氮代謝調(diào)節(jié)蛋白NtrC的功能互補(bǔ)研究

柯琪陳清華戰(zhàn)崳華陸偉燕永亮

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

大腸桿菌氮代謝調(diào)節(jié)蛋白GlnG與固氮施氏假單胞菌氮代謝調(diào)節(jié)蛋白NtrC的功能互補(bǔ)研究

柯琪1，2陳清華2戰(zhàn)崳華2陸偉2燕永亮2

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

旨在圍繞大腸桿菌DH10B（Escherichia coli DH10B）中氮代謝調(diào)節(jié)蛋白GlnG與施氏假單胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）中氮代謝調(diào)節(jié)蛋白NtrC在一般氮代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是否存在功能互補(bǔ)展開(kāi)研究。利用DH10B菌的glnG基因回補(bǔ)A1501菌的ntrC突變株，以及A1501菌的ntrC基因回補(bǔ)DH10B菌的glnG突變株，對(duì)所獲得的功能互補(bǔ)株分別展開(kāi)生理生化表型測(cè)定。結(jié)果表明，在以硝酸鉀或尿素為唯一氮源的培養(yǎng)條件下，DH10B glnG基因可以回補(bǔ)A1501 ntrC突變株的氮源利用能力，并且部分恢復(fù)ntrC突變株的固氮酶活性（約為野生型A1501固氮酶活性的45%）；與DH10B glnG突變株相比，A1501菌的ntrC基因回補(bǔ)了DH10B glnG突變株以精氨酸為唯一氮源的生長(zhǎng)能力。以上結(jié)果說(shuō)明DH10B菌的GlnG蛋白與A1501菌的NtrC蛋白不僅在進(jìn)化關(guān)系上緊密聯(lián)系而且在所測(cè)試的氮代謝途徑中存在功能互補(bǔ)。

施氏假單胞菌A1501 NtrC；大腸桿菌DH10B GlnG；一般氮代謝；功能互補(bǔ)

生物固氮是微生物在某些特定的條件下將空氣中的氮?dú)膺€原為銨的過(guò)程［1］，是自然生態(tài)系統(tǒng)中氮的主要來(lái)源，在氮素的生態(tài)平衡和農(nóng)、林生產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮重要作用，而對(duì)于生物固氮調(diào)控過(guò)程的研究是目前微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

氮源是自然環(huán)境中影響生物固氮效率的一個(gè)重要的限制性因素，固氮微生物能否高效利用環(huán)境中的氮源，使生物固氮僅發(fā)生在有利和必要的條件下是關(guān)鍵性問(wèn)題。目前已有研究表明在大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）和肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）中氮素吸收和氮源代謝由NtrBC（Nitrogen regulation，ntr）雙組份系統(tǒng)全局調(diào)控［2］。NtrBC雙組份系統(tǒng)（亦稱GlnLG雙組份系統(tǒng)）在革蘭氏陰性菌中廣泛存在，由組氨酸激酶NtrB和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NtrC構(gòu)成。在細(xì)菌所處生長(zhǎng)環(huán)境缺乏氮源時(shí)，NtrB能夠自身磷酸化，并且發(fā)揮激酶作用將NtrC磷酸化，磷酸化以后的NtrC轉(zhuǎn)錄激活氮源轉(zhuǎn)運(yùn)吸收和代謝相關(guān)基因的表達(dá)［3］。其中NtrC 蛋白（在固氮施氏假單胞菌A1501中由ntrC基因編碼）是固氮施氏假單胞菌A1501中固氮島基因表達(dá)激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。在大腸桿菌中，GlnG蛋白（在DH10B菌中由glnG基因編碼）是氮限制條件下氮源選擇性同化途徑的全局激活子［4］。研究表明假單胞菌中的NtrC蛋白是激活一系列編碼參與氮源吸收和利用的蛋白基因表達(dá)所必需的因素［5］，包括自身操縱子glnA-ntrBC及atzDEF操縱子。同時(shí)NtrC在施氏假單胞菌中也參與固氮調(diào)控過(guò)程［6］，也有許多研究表明腸桿菌中的氮調(diào)節(jié)系統(tǒng)與假單胞菌很多相同之處［6，7］。大腸桿菌的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前研究較為透徹，具有可進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)、易于培養(yǎng)以及遺傳操作方便等顯著優(yōu)點(diǎn)。而作為第一株完成測(cè)序的聯(lián)合固氮菌，施氏假單胞菌A1501含有一全長(zhǎng)49 kb的固氮島，含有59個(gè)編碼基因，其中傳統(tǒng)的20多個(gè)固氮相關(guān)基因是其實(shí)現(xiàn)生物固氮的遺傳基礎(chǔ)［8］。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功將A1501的固氮島基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B獲得了具有固氮酶活性的重組大腸桿菌，使得聯(lián)合固氮菌擺脫了遺傳背景不清楚的局限。然而重組大腸桿菌的固氮酶活性只有野生型A1501的1/10，因此，研究固氮條件下大腸桿菌內(nèi)的氮代謝相關(guān)基因與施氏假單胞菌固氮島內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控是否具有相關(guān)性，是提高重組大腸桿菌固氮能力的關(guān)鍵。

本研究通過(guò)構(gòu)建DH10B glnG回補(bǔ)A1501 ntrC突變株的功能互補(bǔ)株和A1501 ntrC回補(bǔ)DH10B glnG突變株的功能互補(bǔ)株，對(duì)突變株和功能互補(bǔ)株在唯一氮源條件下生長(zhǎng)能力進(jìn)行分析，旨在為揭示DH10B GlnG與A1501 NtrC兩蛋白在細(xì)菌一般氮代謝過(guò)程中是否具有調(diào)控功能的相關(guān)性奠定理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步提高重組菌固氮酶活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株

1.1 材料

1.1.1 本研究中所涉及的細(xì)菌菌株主要是固氮施氏假單胞菌野生型及相關(guān)突變株和互補(bǔ)株（表1）。

1.1.2 培養(yǎng)基及生化試劑 LB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂粉）：0.5%酵母提取物，1.0%胰蛋白胨，1.0%氯化鈉，pH7.0。改良K培養(yǎng)基（固體培養(yǎng) 基 含1.5%瓊 脂 粉 ）：0.04% KH2PO4，0.01%K2HPO4，0.01% NaCl，0.02% MgSO4·7H2O，0.001% MnSO4·H2O，0.001% Fe2（SO4）3·H2O，0.001% Na2MoO4·H2O，0.6% C3H5NaO3，0.04%（NH4）2SO4，pH6.8 。M9培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂粉）：20% 5×M9鹽溶液，0.2% 1 mol/L MgSO4，20%葡萄糖，0.01% 1 mol/L CaCl2。5×M9鹽溶液：6.4% Na2HPO4，1.5% KH2PO4，0.25% NaCl，0.5% NH4Cl。1.1.3 引物合成和測(cè)序 由北京擎科生物技術(shù)有限公司及六合華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 三親結(jié)合實(shí)驗(yàn) 活化供體菌（大腸桿菌JM109）、受體菌（A1501）以及含有助質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌，轉(zhuǎn)接至相應(yīng)液體培養(yǎng)基中。過(guò)夜培養(yǎng)后接至新鮮的液體培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8。吸取1.5 mL液離心收集菌體沉淀。用0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次，并將3管相同的菌液合為一管，離心收集菌體沉淀后加入100 μL 0.85%的生理鹽水將3種菌液稀釋成同一濃度，按供體菌∶受體菌∶助質(zhì)粒為2∶2∶1的比例將3種混合均勻離心收集菌體沉淀。用50-100 μL 0.85%的生理鹽水重懸菌體并點(diǎn)于LB（無(wú)任何抗性）平板中央，風(fēng)干后放于30℃培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24-48 h后將所有菌苔刮下，用0.85%的生理鹽水倍比稀釋各取100 μL涂在加相應(yīng)抗生素的K培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)至單菌落長(zhǎng)到合適大小。

1.2.2 以10 mmol/L硝酸鉀和10 mmol/L尿素為唯一氮源條件下的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 活化菌株A1501、ΔntrC、ntrC-comp、glnG-comp，接種至新鮮的K培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀。用0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次。用以10 mmol/L硝酸鉀和10 mmol/L尿素為唯一氮源的液體培養(yǎng)基重懸菌體，并調(diào)節(jié)菌液初始OD600為1.0。將2 mL菌液接種于18 mL以10 mmol/L硝酸鉀和10 mmol/L尿素為唯一氮源的液體培養(yǎng)基，30℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)，每個(gè)體系3個(gè)重復(fù)。分別于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24 h取樣，測(cè)定各菌液的OD600。

1.2.3 施氏假單胞菌固氮酶活測(cè)定 活化菌株A1501、ΔntrC、ntrC-comp、glnG-comp，接種至新鮮無(wú)氮培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀。用0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次。用液體無(wú)氮培養(yǎng)基K重懸菌體，并調(diào)節(jié)菌液初始OD600為1.0。將1 mL菌液接種于9 mL無(wú)氮K培養(yǎng)基中，封口后每瓶充5 min氬氣并注入0.5%的氧氣和10%的乙炔，30℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)，每個(gè)體系3個(gè)重復(fù)。分別于4、6、8、10 h取樣250 μL氣體進(jìn)行氣譜檢測(cè)，并記錄乙烯的峰面積。

利用公式 固氮酶活=乙烯峰面積×（搖瓶中氣相總體積/進(jìn)樣量）/（1 nmol標(biāo)準(zhǔn)乙烯峰面積×反應(yīng)時(shí)間×蛋白量）計(jì)算固氮酶活性。其中搖瓶中氣相總體積為70 mL，1 nmol標(biāo)準(zhǔn)乙烯峰面積為1 962.9，蛋白量為0.68 mg。

1.2.4 以精氨酸為唯一氮源條件下的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 活化菌株DH10B、ΔglnG、ntrC-comp-E，接種至液體培養(yǎng)基M9中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。離心收集菌體。用0.85% 的生理鹽水洗滌菌體2次。用以精氨酸為唯一氮源的液體培養(yǎng)基重懸菌體，并調(diào)節(jié)菌液初始OD600為1.0。接種200 μL菌液于19.8 mL以精氨酸為唯一氮源的液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)，每個(gè)體系3個(gè)重復(fù)。分別于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24 h取樣，測(cè)定各菌液的OD600。

1.2.5 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank中獲得大腸桿菌DH10B及施氏假單胞菌A1501的基因組序列后分別找到目標(biāo)基因glnG和ntrC，用Primer premier 5.0設(shè) 計(jì) 引 物glnG（F）/glnG（R）和 ntrC（F）/ntrC（R）。glnG（F）：5'-CAAAGCTT CCACTCGATACCAGATTA-3'和 glnG（R）5'-CGGGATCC AGGAAATAAAGGTGACG-3'，下劃線分別為Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)。ntrC（F）：5'-TTTAAGCTTTGTCGCAGGTCGGAT-3'，和ntrC（R）：5'-TTGGATCCAGAACATCATCAGTCAG-3'，下劃線分別為Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)。以基因組DNA為模板用引物glnG（F）/glnG（R）和ntrC（F）/ntrC（R）擴(kuò)增glnG和ntrC基因片段。PCR擴(kuò)增條件：95℃10 min；95℃ 30 s，54-62℃ 1.5 min，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

2 結(jié)果

2.1DH10B GlnG和A1501 NtrC的生物信息學(xué)及理化性質(zhì)分析

在 NCBI數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）分別檢索DH10B GlnG及A1501 NtrC兩蛋白質(zhì)的氨基酸序列，獲得序列后利用DNAMAN軟件對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果（圖1）顯示兩個(gè)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，氨基酸序列相似性為63.5%。

圖1 DH10B GlnG與A1501 NtrC蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)

利用 ExPASy（Expert Protein Analysis System）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行氨基酸理化參數(shù)計(jì)算的工具ProtParam（http://expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)兩個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較分析。結(jié)果（表2）顯示兩個(gè)蛋白的分子量、等電點(diǎn)等都非常接近。以上結(jié)果表明DH10B GlnG蛋白與A1501 NtrC蛋白在結(jié)構(gòu)上具有一定相似性，兩蛋白可能具有功能相關(guān)性。

表2 A1501 NtrC與DH10B GlnG理化性質(zhì)比較（預(yù)測(cè)）

2.2 glnG互補(bǔ)ΔntrC功能互補(bǔ)株的構(gòu)建及表型分析

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)采用廣宿質(zhì)粒pLAFR3通過(guò)雙酶切成功構(gòu)建了pLAFR3-glnG重組質(zhì)粒，本研究通過(guò)三親結(jié)合的方法將重組質(zhì)粒 pLAFR3-glnG導(dǎo)入ΔntrC中。在含有四環(huán)素（Tc）和氯霉素（Cm）雙抗性的固體限制性培養(yǎng)基K上進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，再利用引物glnG（F）/glnG（R）進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證（圖2），得到glnG互補(bǔ)ΔntrC的功能互補(bǔ)株（glnG-comp）。

圖2 菌落PCR驗(yàn)證glnG基因

為了研究GlnG能否替代NtrC在ΔntrC一般氮代謝過(guò)程中行使功能，我們構(gòu)建了glnG互補(bǔ)ΔntrC的功能互補(bǔ)株并進(jìn)行了相應(yīng)功能表型測(cè)定。因本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)ΔntrC不能在以硝酸鉀或尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所以本研究測(cè)定了A1501、A1501ΔntrC、ntrC-comp以及glnG-comp在培養(yǎng)基K中以硝酸鉀和尿素為唯一氮源的生長(zhǎng)曲線（圖3）。從圖中可以看到ΔntrC能夠利用硝酸鉀和尿素為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，野生型A1501在該條件下生長(zhǎng)良好。而不論是用ntrC還是用glnG回補(bǔ)ΔntrC都能使其恢復(fù)一定的生長(zhǎng)能力。結(jié)果表明，glnG已在ΔntrC中成功表達(dá)，并能夠替代ntrC實(shí)現(xiàn)對(duì)硝酸鉀和尿素功能的利用，這一結(jié)果表明GlnG蛋白與NtrC蛋白在氮代謝過(guò)程中具有功能相關(guān)性。

圖3 四種菌株在以10 mmol/L硝酸鉀（A）及10 mmol/L尿素（B）為唯一氮源條件下的生長(zhǎng)曲線

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 GlnG蛋白與NtrC蛋白在固氮調(diào)控過(guò)程中是否具有功能相關(guān)性，我們對(duì)A1501、ΔntrC、ntrC-comp及glnG-comp的固氮酶活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)ntrC突變以后使菌株的固氮酶活性基本喪失，而glnG-comp具有一定的固氮酶活性，約為野生型A1501的45%。說(shuō)明在固氮過(guò)程中，glnG能夠部分互補(bǔ)ntrC的調(diào)節(jié)功能，使菌株表現(xiàn)出固氮酶活性。結(jié)果表明，在重組大腸桿菌中GlnG參與了固氮表達(dá)調(diào)控，與NtrC蛋白具有功能相關(guān)性。

圖4 四種菌株固氮酶活性的測(cè)定

2.3 ntrC互補(bǔ)ΔglnG功能互補(bǔ)株的構(gòu)建及表型分析

本實(shí)驗(yàn)室已成功地將A1501ntrC片段克隆到廣宿主質(zhì)粒載體pLAFR3上，構(gòu)建了A1501 NtrC蛋白的表達(dá)載體 pLAFR3-ntrC。本研究首先提取了重組質(zhì)粒 pLAFR3-ntrC，然后通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pLAFR3-ntrC導(dǎo)入到ΔglnG中，再利用含有四環(huán)素（Tc）和卡那霉素（Km）雙抗性的固體LB平板進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。最后利用ntrC（F）/ntrC（R）引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證（圖5），得到ntrC回補(bǔ)ΔglnG的功能互補(bǔ)株（ntrC-comp-E）。

圖5 菌落PCR驗(yàn)證ntrC基因

為了研究NtrC蛋白能否在 E.coli DH10B中代替GlnG在一般氮代謝過(guò)程中行使功能，我們對(duì)ΔglnG和ntrC-comp-E進(jìn)行了相應(yīng)表型測(cè)定。因?yàn)橛醒芯勘砻鳓lnG不能在以精氨酸為唯一氮源的條件下進(jìn)行生長(zhǎng)［9］，所以本研究測(cè)定了E.coli DH10B、ΔglnG以及ntrC-comp-E在培養(yǎng)基M9中以精氨酸為唯一氮源條件下的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果（圖6）顯示 ΔglnG在M9培養(yǎng)基中不能夠以精氨酸為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，野生型E.coli DH10B在該條件下生長(zhǎng)良好。而當(dāng)用ntrC互補(bǔ)ΔglnG突變株時(shí)，功能互補(bǔ)菌株基本恢復(fù)了生長(zhǎng)能力。結(jié)果表明，ntrC已在ΔglnG中成功表達(dá)，并能夠替代glnG在E.coli DH10B菌的一般氮代謝過(guò)程中行使功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)精氨酸利用功能的互補(bǔ)。

圖6 三種菌株在以精氨酸為唯一氮源條件下的生長(zhǎng)曲線

3 討論

氮調(diào)節(jié)是涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和效應(yīng)蛋白的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該領(lǐng)域在腸道菌中已經(jīng)進(jìn)行了深層研究。假單胞菌的氮代謝系統(tǒng)與腸細(xì)菌相比有很多共同特點(diǎn)，均含有典型的氮代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)即NRII-NRI雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)［3］，該系統(tǒng)由尿苷轉(zhuǎn)移酶（GlnD）、PII（GlnB、GlnK）、NRII（GlnL/NtrB）和 NRI（GlnG/NtrC）等具有雙功能的蛋白組成。然而，施氏假單胞菌的氮調(diào)節(jié)與大腸桿菌也有很多不同之處。首先，施氏假單胞菌中Ntr系統(tǒng)的功能僅由glnK基因編碼的PII蛋白調(diào)控，其產(chǎn)物直接編碼高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的amtB基因相互作用。而在大腸桿菌中，glnB和glnK都編碼PII蛋白，其中組成型表達(dá)的GlnB蛋白由glnB編碼，由于GlnK的轉(zhuǎn)錄依賴于NRI，因此glnK編碼的GlnK蛋白只在低氮條件下表達(dá)，GlnB和 GlnK的功能也部分重疊［10］。

Schumacher等［5］研究表明，NRI（NtrC）的存在導(dǎo)致惡臭假單胞菌中g(shù)lnK和amtB的表達(dá)受氮源調(diào)控，其功能僅在氮限制的條件下由NtrC激活［5］。體外純化蛋白實(shí)驗(yàn)表明，glnK的轉(zhuǎn)錄直接被 NtrC激活［5］。通過(guò)對(duì)施氏假單胞菌A1501中g(shù)lnK基因的序列分析，發(fā)現(xiàn)在glnK基因的啟動(dòng)子上游-12/-24處具有與σ54結(jié)合位點(diǎn)相似的序列。在低氮的條件下，依賴于σ54的啟動(dòng)區(qū)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄后glnK 基因開(kāi)始表達(dá)，該表達(dá)受NtrC蛋白調(diào)控；在高氮條件下，glnK基因可能在一個(gè)不依賴于σ54和NtrC蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子區(qū)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行低水平表達(dá)［11］。

在大腸桿菌中，glnK基因上游區(qū)域也含有一個(gè) σ54結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè) NRI（GlnG）結(jié)合位點(diǎn)，操縱子表達(dá)也依賴GlnG同時(shí)也受到氮素調(diào)控［12，13］。另外，與大腸桿菌glnKp不同的是惡臭假單胞菌glnKp開(kāi)放復(fù)合物的形成強(qiáng)烈依賴于IHF，這在體內(nèi)才能觀察到。并且IHF的參與，加上其螺旋的同一側(cè)存在兩個(gè)連續(xù)的NtrC結(jié)合位點(diǎn)，表明惡臭假單胞菌glnKp的轉(zhuǎn)錄激活對(duì)低濃度的NtrC是敏感的。這兩個(gè)不同點(diǎn)可能與缺乏組成型GlnB蛋白進(jìn)行高效氮抑制有關(guān)［14］。其次，大腸桿菌氮調(diào)節(jié)的操縱子也包含能被 σ70RNA聚合酶全酶識(shí)別的啟動(dòng)子［15］，這些操縱子的轉(zhuǎn)錄受到氮同化控制蛋白（Nac）-LysR 型調(diào)節(jié)子的調(diào)控。在大腸桿菌中受Nac激活的基因和操縱子涉及氮化分子的轉(zhuǎn)運(yùn)［16］，這也可能作為氮的來(lái)源。然而施氏假單胞菌A1501全基因組數(shù)據(jù)表明其不含有nac基因［17］，并且已測(cè)序的假單胞菌基因組表明該屬菌中不含有Nac同源物［18］。有研究證實(shí)在惡臭假單胞菌中，由NtrC直接激活的基因同時(shí)含有σ54依賴型啟動(dòng)子和Nac激活基因同源物，這避免了需要一個(gè)適配器來(lái)共同調(diào)節(jié)σ54和σ70依賴型基因［19］。進(jìn)而推測(cè)通過(guò)Nac介導(dǎo)的依賴σ70的級(jí)聯(lián)氮調(diào)控不是腸桿菌所必須的，因?yàn)樵S多菌中不含有nac基因。在沙門(mén)氏菌中，最近發(fā)現(xiàn)似乎Nac也丟失了，因?yàn)樵陧憫?yīng)氮的情況下它不能控制依賴σ70基因的表達(dá)。然而沙門(mén)氏菌中hutC基因的啟動(dòng)子仍易受克雷伯氏菌Nac的激活［20，21］。相反在惡臭假單胞菌中，這些基因有的仍然響應(yīng)氮的調(diào)控，但是它們的啟動(dòng)子依賴σ54，直接受到NtrC的調(diào)控，從而避免了額外的調(diào)控［22］。由此可知施氏假單胞菌A1501中由氮介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也是大腸桿菌中氮調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的簡(jiǎn)化模式：只含有一個(gè)PII蛋白，沒(méi)有Nac參與的級(jí)聯(lián)調(diào)控［23］，這可能是造成DH10B GlnG和A1501 NtrC調(diào)控功能差異的因素。

本研究證實(shí)了DH10B GlnG和A1501 NtrC蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及功能上都具有很大的相似性。這些數(shù)據(jù)表明，在大腸桿菌和施氏假單孢菌中的NRI蛋白的功能是高度保守的，兩個(gè)蛋白可以進(jìn)行相互替換。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，DH10B glnG互補(bǔ)A150 ntrC突變株時(shí)，在一般氮代謝方面的功能互補(bǔ)性高于調(diào)控固氮過(guò)程的功能互補(bǔ)性，推測(cè)這可能與大腸桿菌和施氏假單胞菌中氮介導(dǎo)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的不同有關(guān)，也可能是在進(jìn)化過(guò)程中，由于大腸桿菌所處的環(huán)境營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)越，造成其一般氮代謝調(diào)節(jié)蛋白GlnG在功能上產(chǎn)生了分化。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了DH10B glnG回補(bǔ)A1501 ΔntrC的功能互補(bǔ)株和A1501ntrC回補(bǔ)DH10B ΔglnG的功能互補(bǔ)株，并對(duì)互補(bǔ)株和突變株與野生型的氮源利用和生物固氮能力等方面進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示DH10B glnG能夠互補(bǔ)A1501 ntrC在氮源利用和氮限制條件下的調(diào)節(jié)功能，而A1501 ntrC能夠互補(bǔ)DH10B glnG在氮源條件下的生長(zhǎng)能力，這一結(jié)果表明DH10B菌中的GlnG可能通過(guò)互補(bǔ)A1501菌中 NtrC蛋白在氮限制條件下的調(diào)節(jié)功能進(jìn)而參與到一般氮代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)過(guò)程中。

［1］ Halbleib CM, Ludden PW. Regulation of biological nitrogen fixation［J］. J Nutr, 2000, 130（5）：1081-1084.

［2］Li W, Lu CD. Regulation of carbon and nitrogen utilization by CbrAB and NtrBC two-component systems in Pseudomonas aeruginosa［J］. J Bacteriol, 2014, 59（4）：524-592.

［3］ Arcondeguy T, Jack R, Merrick M. P（II）signal transduction proteins, pivotal players in microbial nitrogen control［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 2001, 65（1）：80-105.

［4］Vidangos NK, Heideker J. DNA recognition by a σ（54）transcriptional activator from Aquifex aeolicus［J］. J Mol Biol, 2014, 175（19）：667-684.

［5］ Schumacher J, Behrends V, Pan ZS, et al. Nitrogen and carbon status are integrated at the transciptional level by the nitogen regulator BtrC in vivo［J］. Microbiology, 2013, 149（Pt 8）：251-262.

［6］ Hervas AB, Canosa I, Santero E. Transcriptome analysis of Pseudomonas putida in response to nitrogen availability［J］. J Bacteriol, 2008, 190（1）：416-420.

［7］Desnoues N, Lin M, Guo X, et al. Nitrogen fixation genetics and regulation in a Pseudomonas stutzeri strain associated with rice［J］. Microbiology, 2003, 149（Pt 8）：2251-2262.

［8］Yan Y, Yang J, Dou Y, et al. Nitrogen fixation island and rhizophere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105（21）：7564-7569.

［9］ Mcfarland N, Mccarter L, Artz S, et al. Nitrogen regulatory locus "glnR" of enteric bacteria is composed of cistrons ntrB and ntrC：identification of their protein products［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78（4）：2135-2139.

［10］ Williams KJ, Bennett MH, Barton GR, et al. Adenylylation of mycobacterial GlnK（PII）protein is induced by nitrogen limitation［J］. Tuberculosis（Edinb）, 2013, 49（Pt 8）：1251-1262.

［11］Chen B, Doucleff M, Wemmer DE, et al. ATP ground- and transition states of bacterial enhancer binding AAA+ ATPases support complex formation with their target protein, sigma54［J］. Structure, 2007, 15（4）：429-440.

［12］ Benkert P, Biasini M, Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models［J］. Bioinformatics, 2010, 27（3）：343-350.

［13］ Jiang H, Shang L, Yoon SH, et al. Optima production of polygamma-glutamic acid by metabolically engineered Escherichia coli［J］. Biotechnol Lett, 2006, 29（2）：631-647.

［14］Hervas AB, Canosa I, Little R, et al. NtrC-dependent regulatory network for nitrogen assimilation in Pseudomonas putida［J］. J Bacteriol, 2009, 181（4）：1056-1062.

［15］ Abbas MM, Mohie-Eldin MM, EI-Manzalawy Y. Assessing the effects of data selection and representation on the development of reliable E. coli sigma 70 promoter region predictors［J］. PLoS One, 2015, 162（19）：3028-3039.

［16］ Zeng J, Spiro S. Finely tuned regulation of the aromatic amine degradation pathway in Escherichia coli［J］. J Bacteriol, 2013, 195（22）：5141-5150.

［17］ Babaer P, Marashi SA, Asad S. Genome-scale reconstruction of the metabolic network in Pseudomonas stutzeri A1501［J］. RSC Publishing, 2015, 41（13）：3082-3088.

［18］Yan Y, Ping S, Peng J, et al. Global transcriptional analysis of nitrogen fixation and ammonium repression in root-associated Pseudomonas stutzeri A1501［J］. BioMed Central, 2010, 115（21）：7543-7565.

［19］ Melchiorsen CR, Jokumsen KV, Villadsen J, et al. The level of pyruvate-formate lyase controls the shift from homolactic to mixedacid product formation in Lactococcus lactis［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58（3）：338-344.

［20］Utrilla J, Gosset G, Martinez A. ATP limitation in a pyruvate formate lyase mutant of Escherichia coli MG1655 increases glycolytic flux to D-lactate［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36（8）：1057-1062.

［21］ Sieira R, Arocena GM, Zorreguieta A, et al. A MarR-Type regulator directly activates transcription from the Brucella abortus virB promoter by sharing a redundant role with HutC［J］. J Bacteriol, 2012, 73（13）：6143-6158.

［22］ Vidangos NK, Heidiker J, Lyubimov A, et al. DNA recognition by a σ（54）transcriptional activator from Aquifex aeolicus［J］. J Mol Biol, 2014, 114（3）：1162-1169.

［23］Hasona A, Kim Y, Healy FG, et al. Pyruvate formate lyase and acetate kinase are essential for anaerobic growth of Escherichia coli on xylose［J］. J Bacteriol, 2004, 186（22）：7593-7600.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Functional Complement Between General Nitrogen Regulator GlnG in Escherichia coli and General Nitrogen Regulator NtrC in Pseudomonas

KE Qi1，2CHEN Qing-hua2ZHAN Yu-hua2LU Wei2YAN Yong-liang2
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

This study aims to investigate whether or not there is functional complement in general nitrogen-regulation network between nitrogen metabolism regulator GlnG from Escherichia coli DH10B and NtrC from Pseudomonas stutzeri A1501. Using gene glnG of DH10B to complement gene ntrC of A1501 or vice versa，the physiological and biochemical phenotypes of the obtained functionally complementary strains were measured. The results showed that while nitrate or urea as the sole nitrogen source，DH10B’s glnG complemented the nitrogenutilizing ability and partially restored the nitrogenase activity（about 45% of wild type）of mutant A1501’s ntrC. Comparing with DH10B’s glnG，A1501’s ntrC only complemented mutant DH10B glnG while arginine as sole nitrogen source. Above results revealed that not only was there close phylogenetical relationship，but also the functional complement in the tested nitrogen metabolism between DH10B’s GlnG and A1501’s NtrC.

Pseudomonas stutzeri A1501 NtrC；Escherichia coli DH10B GlnG；general nitrogen metabolism；functional complement

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.025

2015-12-17

國(guó)家“973”項(xiàng)目（2015CB755700），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470174），廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（2013S033）

柯琪，女，碩士，研究方向：固氮微生物與基因工程，E-mail：543274382@qq.com；陳清華為本文并列第一作者

燕永亮，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：固氮微生物分子生物學(xué)及基因工程；E-mail：yanyongliang@caas.cn