三疣梭子蟹nm23基因克隆及在卵巢發(fā)育中的表達分析

徐晴 朱冬發(fā) 謝熙 邱錫爾 沈錫權(quán)

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

三疣梭子蟹nm23基因克隆及在卵巢發(fā)育中的表達分析

徐晴 朱冬發(fā) 謝熙 邱錫爾 沈錫權(quán)

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

Nm23基因編碼的核苷二磷酸激酶（NDPK）參與調(diào)控生物體的多項生理功能，包括生長、發(fā)育、分化和腫瘤轉(zhuǎn)移等。根據(jù)三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的nm23同源序列，利用cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）首次克隆獲得了三疣梭子蟹nm23基因的全長cDNA序列（GenBank登錄號：KP027331）。該序列全長777 bp，編碼一個151個氨基酸的蛋白，該蛋白包含一個典型的核苷二磷酸激酶（NDPK）區(qū)域，具有NDPK活性位點和多肽結(jié)合位點。推導(dǎo)的氨基酸序列與已知甲殼動物的nm23一致性達到90%以上，與脊椎動物第一類nm23的一致性也達到70%以上。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)第一類nm23與第二類nm23分別聚為一支，甲殼動物nm23屬于第一類，且與nm23-1和nm23-2親緣關(guān)系較近。采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)分析了三疣梭子蟹nm23的組織差異表達及其在卵巢發(fā)育過程中的表達水平變化，結(jié)果表明nm23在三疣梭子蟹各組織內(nèi)均有表達，其表達水平在眼柄、肌肉和Y器中最高，卵巢和肝胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中，卵巢中nm23的表達水平在Ⅰ期最高，之后隨著卵巢發(fā)育的進行，其表達水平逐漸下降，并在成熟期降至最低，這表明nm23可能參與調(diào)控三疣梭子蟹的卵巢發(fā)育。

三疣梭子蟹；nm23；基因克??；卵巢發(fā)育；基因表達

Nm23基因編碼的核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDPK，EC 2.7.4.6）可以催化核苷三磷酸發(fā)生磷基轉(zhuǎn)移從而生成相應(yīng)的核苷二磷酸（NDP）［1］。研究表明，NDPK不僅可以作為看家基因維持生物體內(nèi)核苷酸平衡，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信息傳遞等多種生物學(xué)功能［2-4］。Nm23基因最早于1988年由美國國立癌癥研究所的Steeg等［5］應(yīng)用差示雜交（differential hybridization）等技術(shù)從小鼠黑色毒瘤K-1735細(xì)胞株中分離獲得，并證實其與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制有關(guān)。與此同時，果蠅（Drosophila melanogaste）中也發(fā)現(xiàn)其同源基因awd（abnormal wing discs）參與調(diào)控昆蟲的正常發(fā)育［6，7］。之后，nm23被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于從單細(xì)胞生物到哺乳動物的多個物種中［1，8-13］，是一個具有高度同源性的保守基因家族。

大多數(shù)多細(xì)胞生物中都發(fā)現(xiàn)了nm23亞型的存在，其亞型的數(shù)量和多樣性似乎與生物體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性正相關(guān)［14］。例如，單細(xì)胞生物大腸桿菌（Escherichia coli）［15］和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［16］分別只有一個nm23亞型，而最原始的多細(xì)胞生物盤基網(wǎng)柄菌（Dictyostelium discoideum）中則存在兩種nm23亞型［17］。人類的nm23有10種亞型，根據(jù)蛋白序列結(jié)構(gòu)組成和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性又將其分為兩大類［18，19］。第一類包括nm23-H1至H4，它們的序列組成較為相似，均包含一個高度保守的NDPK活性位點結(jié)構(gòu)域，具有傳統(tǒng)的NDPK活性。第一類基因廣泛表達于人體的各個組織，其中nm23-H1和nm23-H2一致性最高（88%），且能形成同源或異源六聚體［1］。第二類nm23包括H5至H10，與第一類基因相比，它們序列的差異較大，且擁有延伸的N末端和C末端。NDPK活性位點結(jié)構(gòu)域在第二類基因中并不保守，僅在nm23-H6中發(fā)現(xiàn)了NDPK活性［20］。第二類基因一般具有組織表達的特異性，nm23-H5、H6和H8均主要在人類精巢中表達［20-22］。

甲殼動物中有關(guān)nm23的報道較少，在已知nm23物種中均只發(fā)現(xiàn)一個亞型。該亞型屬于第一類nm23，擁有NDPK結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為參與甲殼動物的應(yīng)激和免疫反應(yīng)［23，24］、配子發(fā)生［25］和性腺發(fā)育［26］。開展甲殼動物nm23及其功能的研究，將有助于加深人們對NDPK及其進化過程的理解。因此，本研究利用三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）轉(zhuǎn)錄組文庫，首次克隆獲得了三疣梭子蟹的nm23基因，并運用實時熒光定量PCR（qPCR）分析其組織分布特性以及在卵巢發(fā)育過程的表達水平變化，以探究nm23在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 2013年10月-2014年4月，分多次從寧波市鎮(zhèn)海區(qū)水產(chǎn)品市場購買處于第一次卵巢發(fā)育的三疣梭子蟹（體重90-335 g），根據(jù)卵巢外觀特征及性腺指數(shù)將三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育劃分為Ⅰ-Ⅵ等6個時期［27］，采集Ⅰ-Ⅴ期蟹（每期4只）的卵巢用于檢測nm23的相對表達水平。另采集蛻皮間期蟹（雌、雄各4只）的表皮、精巢、卵巢、肝胰腺、大顎器、肌肉、眼柄、Y器、心臟、腦和胸神經(jīng)節(jié)用于組織表達差異性分析；組織解剖于冰上進行，并將組織存放在RNA保存液中，-20℃保存待用。

1.1.2 主要試劑 RNA保存液、Trizol 試劑盒及DNA回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；DNase I、PrimeScript RT reagent Kit及 SYBR?Premix Ex TaqTMII kit等 試 劑 盒 購 自TaKaRa公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購 自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將上述組織樣品按照Trizol 試劑盒說明書進行總RNA提取?？俁NA經(jīng)DNase I去除基因組DNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用超微量分光光度計Nanodrop 2000（Thermo scientific，USA）進行純度分析。用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒將總RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.2 三疣梭子蟹nm23基因的克隆 從三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索獲得一段nm23基因的同源序列，設(shè)計引物NM23-F和NM23-R（表1），以卵巢組織的cDNA為模板，進行PCR驗證。根據(jù)該核心序列設(shè)計基因特異性引物（表1），利用RACE技術(shù)分別對三疣梭子蟹nm23基因的3'和5'端進行巢式PCR擴增。3' RACE-cDNA將接頭引物AP替換上述試劑盒中的Oligo dT primer和Random 6 mers后用相同的方法進行制備，5' RACE-cDNA按照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒（clontech）進行合成（表1）。以上PCR均在25 μL體系下進行，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 30 s，33個循環(huán)；72℃延伸10 min。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒（上海生工，上海）進行回收和連接，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進行培養(yǎng)，之后選取陽性克隆菌落交由上海生工生物工程有限公司進行測序。

表1 PCR引物序列

1.2.3 序列分析 利用Vector NTI 10.0測序軟件將核心序列和3' RACE、5' RACE的測序結(jié)果進行拼接，獲得三疣梭子蟹nm23基因的cDNA全長。利用NCBI ORF Finder在線工具確定nm23的ORF序列，并翻譯成氨基酸序列；利用ClustalX軟件將該氨基酸序列與已公布的nm23氨基酸序列進行同源性比對；用MEGA 4.0軟件的鄰位法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；用ExPASy Proteomics Server所提供的ProtParam tool蛋白質(zhì)分析軟件分析氨基酸序列；使用Signal 3.0 Server預(yù)測信號肽，TMHMM在線工具預(yù)測氨基酸跨膜區(qū)域。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qPCR）分析 利用qPCR分析nm23在三疣梭子蟹不同組織及卵巢發(fā)育過程中的表達水平變化。根據(jù)克隆得到nm23的cDNA全長設(shè)計一對熒光定量引物NM23YG-F、NM23YG-R檢測nm23基因表達水平，設(shè)計actin-F和antin-R（表1）用以擴增三疣梭子蟹β-actin基因（FJ641977）作為內(nèi)參。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用于驗證nm23基因和β-actin基因引物的擴增效率。按照SYBR?Premix Ex TaqTMII kit使用說明進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃ 2 min；95℃ 5 s，53.2℃ 20 s，68℃ 30 s，共40個循環(huán)。設(shè)定熔解曲線用于保證產(chǎn)物的特異性，條件如下：55-95℃，每秒上升0.2℃。每個cDNA重復(fù)3個平行。數(shù)據(jù)用方法表示。采用 2-△△Ct方法［28］計算目的基因相對表達量。選取實驗組中的一個重復(fù)為1，其他組的數(shù)值以該重復(fù)的倍數(shù)來表示。用SPSS Statistics軟件進行單因素方差（ANOVA，Duncan’ s test）分析，利用Excel對統(tǒng)計結(jié)果進行作圖，P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 三疣梭子蟹nm23基因的cDNA全長及序列分析

將測序結(jié)果進行拼接得到777 bp的三疣梭子蟹nm23 cDNA全長序列（GenBank登錄號：KP027331）。該序列包括145 bp的5' 端非編碼區(qū)、176 bp的3' 端非編碼區(qū)和456 bp的開放閱讀框（ORF），編碼151個氨基酸（圖1）。推導(dǎo)的氨基酸經(jīng)ExPASy（http://ca.expasy.org/）網(wǎng)站在線Prot Param預(yù)測其分子式為C761H1184N204O220S10，分子量大小約為17 031.6 Da，預(yù)測等電點為7.70，親水性總和（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.353，屬于親水性蛋白；利用Signal 3.0 Server和TMHMM在線分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列不含信號肽，且無跨膜結(jié)構(gòu)域。

Blast結(jié)果顯示，推導(dǎo)的氨基酸序列與擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的nm23一致性最高（99%）；其次為中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），達到98%；與凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）nm23的一致性均為90%。該氨基酸序列由一個NDPK結(jié)構(gòu)域組成，包含11個NDPK活性位點（Lys-11、Tyr-51、Phe-59、Arg-87、Thr-93、Arg-104、Asn-114、His-117、Ser-119、Asp-120和Glu-128）和9個多肽結(jié)合位點（Val-15、Ile-20、Gly-21、Glu-22、Lys-25、Glu-28、Met-37、Lys-38和Tyr-39），其活性位點結(jié)構(gòu)域為NXXH［G］SD（圖2）。根據(jù)三疣梭子蟹nm23及其他物種的nm23氨基酸序列，利用MEGA 4.0軟件的鄰接距離（Neighbor-joining）法構(gòu)建進化樹，結(jié)果（圖3）顯示，所有物種的第一類nm23和第二類nm23分別聚為一支；三疣梭子蟹nm23與其他甲殼動物nm23聚在一起，均屬于第一類nm23，且與脊椎動物的nm23的1和2亞型親緣關(guān)系較近。

圖1 三疣梭子蟹nm23全長cDNA核苷酸序列和編碼區(qū)氨基酸序列

圖2 三疣梭子蟹nm23與其他物種nm23-1/2同源序列的氨基酸序列比對

2.2 三疣梭子蟹nm2 3在不同組織中的表達差異

實時熒光定量PCR（qPCR）結(jié)果（圖4）顯示，nm23在三疣梭子蟹各組織中均有表達，其表達水平在眼柄（Es）、肌肉（Ms）和Y器（Yo）中最高，卵巢（Ov）和肝胰腺（Hp）次之，其他組織中nm23表達水平均較低。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于nm23氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 三疣梭子蟹nm23在卵巢發(fā)育中的表達水平變化

為了研究nm23在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中的作用，采集各發(fā)育期卵巢檢測其中nm23的相對表達水平。結(jié)果（圖5）顯示，在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中，nm23在I期表達水平最高，顯著高于其他各期（P<0.05）；隨后其表達量開始逐漸下降，至V期降至最低。

3 討論

本研究根據(jù)三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組文庫中的nm23同源序列，利用RACE技術(shù)，首次克隆獲得了三疣梭子蟹nm23的全長cDNA序列。推導(dǎo)的nm23氨基酸序列由一個典型的NDPK區(qū)域組成，該區(qū)域包含11個NDPK活性位點、9個多肽結(jié)合位點和1個保守的NDPK活性位點結(jié)構(gòu)域。三疣梭子蟹nm23與其他甲殼動物的nm23一致性較高，均在90%以上，與脊椎動物第一類nm23的一致性也達到70%以上。進一步構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)甲殼動物nm23與第一類nm23聚為一支，這表明目前甲殼動物克隆獲得的nm23均為第一類nm23，甲殼動物中是否存在第二類nm23還需進一步證實。值得注意的是，在已知甲殼動物的nm23中，羅氏沼蝦nm23擁有延伸的C末端和N末端，其可能是甲殼動物nm23的另一種亞型［25］，該亞型是否存在于三疣梭子蟹中還有待進一步研究。

與脊椎動物第一類nm23一樣，甲殼動物nm23也廣泛存在于各個組織中，但在不同物種中，其主要表達的組織并不一致。例如，在羅氏沼蝦中，nm23在肌肉中、肝胰腺、精巢和卵巢中均有較高的表達［25］；在中華絨螯蟹中，除肌肉和肝胰腺外，nm23在鰓和心臟中也有較高的表達［24］。本研究中，三疣梭子蟹nm23在肌肉、卵巢和肝胰腺中均有較高的表達，與之前報道相符；但不同的是，nm23在三疣梭子蟹的Y器和眼柄中也存在較高的表達，這可能與羅氏沼蝦和中華絨螯蟹中并未檢測nm23在Y器和眼柄中的表達情況有關(guān)。在斑節(jié)對蝦中，nm23雖然在雌蟹眼柄中表達水平最高，但在雄蟹眼柄中卻極低［26］；且其在卵巢和肝胰腺中表達水平較低，與本研究結(jié)果也不一致。因此，nm23在甲殼動物中的組織分布特性并不明確，可能因種而異。

三疣梭子蟹的卵巢發(fā)育過程主要經(jīng)歷了卵原細(xì)胞的增殖（I期）、內(nèi)源性卵黃合成期（II）、外源性卵黃合成期（III）、近成熟期（IV期）和成熟期（V期）等階段［27］。三疣梭子蟹nm23在卵巢發(fā)育的I期表達水平最高，之后隨著卵巢發(fā)育的進行，其表達水平逐漸下降，并在成熟期降至最低。該結(jié)果與羅氏沼蝦nm23的研究結(jié)果相一致［25］，這表明nm23可能抑制甲殼動物的卵巢發(fā)育過程。此外，Hsieh和Wu［29］認(rèn)為nm23可以通過抑制B型細(xì)胞周期蛋白（Cyclin B）從而阻止細(xì)胞從G2期向M期轉(zhuǎn)化。三疣梭子蟹nm23是否也是通過Cyclin B實現(xiàn)對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的負(fù)向調(diào)控還需進一步研究。

圖4 三疣梭子蟹nm23在不同組織里的表達水平

圖5 三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育過程中nm23在卵巢中的表達水平變化

4 結(jié)論

本研究首次克隆獲得了三疣梭子蟹nm23基因的全長cDNA序列，其氨基酸序列與已知甲殼動物的nm23一致性達到90%以上，且與哺乳動物第一類nm23親緣關(guān)系較近。組織差異表達分析顯示，三疣梭子蟹nm23在三疣梭子蟹各組織內(nèi)均有表達，其表達水平在眼柄、肌肉和Y器中最高，卵巢和肝胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中，卵巢中nm23的表達水平在Ⅰ期最高，之后逐漸下降，在成熟期降至最低，這表明nm23可能參與調(diào)控三疣梭子蟹的卵巢發(fā)育。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression Analysis of Gene nm23 during Ovarian Development of Portunus trituberculatus

XU Qing ZHU Dong-fa XIE Xi QIU Xi-er SHEN Xi-quan
（The School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）

Nm23 is a family of genes encoding the nucleoside diphosphate（NDP）kinase，which functions in a wide variety of biological processes，including growth，development，differentiation，and tumor metastasis. In this study，based on the nm23 homologous sequence in the transcriptome dataset of Portunus trituberculatus，the full-length cDNA of P. trituberculatus nm23 was obtained using the rapid amplification of cDNA ends（RACE）. The full-length cDNA（GenBank accession number KP027331）was 777 bp，encoding for a protein of 151 amino acids with one typical NDP kinase domain that harbored all the crucial residues for nucleotide binding and enzymatic activity. The deduced amino acid sequence of P. trituberculatus nm23 exhibited more than 90% identities with that of other crustaceans，and more than 70% identities with the nm23 of group I of vertebrates. The phylogenic tree constructed based on nm23’s amino acid sequences indicated that the crustacean nm23 belonged to the group I（nm23-1），which was separated from the nm23 of group II（nm23-2），moreover，the nm23-1 and nm23-2 were close. The expression levels of P. trituberculatus nm23 in different tissues and during the ovarian development were detected by quantitative real-time PCR（qPCR）. The results showed that nm23 was ubiquitously expressed in all tissues examined，its mRNA level was the most abundant in eyestalk，muscle and Y-organs，and second in ovary and hepatopancreas. During the ovarian development，the nm23 was mostly expressed at stage I，then declined along with the development of ovaries，and to the minimum at stage V，suggesting that the nm23 had the potential role in the ovarian development of P. trituberculatus.

Portunus trituberculatus；nm23；gene cloning；ovarian development；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.012

2015-07-10

國家自然科學(xué)基金項目（41376152，40976098），浙江省自然科學(xué)基金項目（LY13C190006）

徐晴，女，研究方向：甲殼動物內(nèi)分泌學(xué)；E-mail：634605585@qq.com

朱冬發(fā)，男，教授，研究方向：甲殼動物遺傳育種；E-mail：zhudongfa@nbu.edu.cn