海島棉GbHCT基因克隆及生物信息學(xué)分析

崔雪加得拉·吐留汗于月華陳全家申麗婕葉佳麗楊颶立陶順倪志勇，2

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng) 455000）

海島棉GbHCT基因克隆及生物信息學(xué)分析

崔雪1加得拉·吐留汗1于月華1陳全家1申麗婕1葉佳麗1楊颶立1陶順1倪志勇1，2

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng) 455000）

克隆海島棉木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因GbHCT全長(zhǎng)cDNA序列，分析其在纖維不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。根據(jù)海島棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的HCT序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆基因，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析GbHCT的cDNA序列和氨基酸序列。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究GbHCT在纖維不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。從海島棉中克隆了1個(gè)編碼HCT的基因GbHCT，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 311 bp，編碼436個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為48.58 kD，等電點(diǎn)為6.03。GbHCT氨基酸序列中含有HTLGD和DFGWG 2個(gè)保守基序。GbHCT氨基酸與陸地棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉HCT一致性較高，與其他植物中的HCT氨基酸的一致性為55.7%-60.7%。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)GbHCT在纖維不同發(fā)育階段都有表達(dá)，在5 DPA的纖維中表達(dá)量最高，表明該基因可能參與棉花纖維的發(fā)育。

海島棉；HCT；基因克??；生物信息學(xué)

棉花是世界上最重要的纖維作物之一，棉纖維品質(zhì)優(yōu)劣直接影響紡織品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力［1，2］。棉花為錦葵科棉屬，棉屬有52個(gè)種，包括4個(gè)栽培棉種、47個(gè)野生棉種?，F(xiàn)廣泛種植的陸地棉和海島棉為異源四倍體栽培種［3］。 陸地棉適應(yīng)性廣且產(chǎn)量高，占我國(guó)所產(chǎn)原棉的99%。海島棉在我國(guó)目前只有新疆生產(chǎn)，海島棉纖維的長(zhǎng)度、細(xì)度和強(qiáng)力等方面優(yōu)于陸地棉［4，5］。棉花育種家一直致力于培育具有產(chǎn)量和品質(zhì)兼?zhèn)涞拿藁ㄆ贩N，利用基因工程技術(shù)將海島棉中纖維品質(zhì)形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)入陸地棉中來(lái)改良其纖維品質(zhì)是一種有效的方法。從分子水平上研究海島棉優(yōu)質(zhì)纖維形成的機(jī)理，克隆纖維發(fā)育相關(guān)基因尤為重要。最近研究表明苯丙烷代謝途徑及其產(chǎn)物在棉花纖維品質(zhì)形成過(guò)程中具有重要的作用［6-9］，對(duì)參與苯丙烷代謝途徑的基因功能及作用機(jī)理開(kāi)展研究，有望為改良纖維品質(zhì)提供新的候選基因。莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（shikimate /quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）在苯丙烷C3羥基化的上、下游起著雙重調(diào)節(jié)作用，是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一［10］。在本生煙［11］（Nicotiana benthamiana）和紫花苜蓿［12］（Medicago sativa）中，沉默HCT基因?qū)е聹p少轉(zhuǎn)基因 植株愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（guaiacyl lignin，G-lignin）和紫丁香基木質(zhì)素（syringyl lignin，S-lignin）的含量，增加對(duì)-羥苯基木質(zhì)素（phydroxyphenyl lignin，H-lignin）的含量。在輻射松［13］（Pinus radiata）中，沉默HCT基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量減少42%，這些研究表明通過(guò)改變HCT的活性能夠調(diào)控木質(zhì)素代謝。迄今，已經(jīng)從本生煙［11］、紫花苜蓿［12］、棕色棉（Gossypium hirsutum L.）［14］、茶樹(shù)（Camellia sinensis L.）［15-19］等植物中克隆了HCT基因并鑒定了基因的功能，但海島棉中HCT基因的克隆研究尚未報(bào)道。本研究前期采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法對(duì)海島棉品種新海21胚珠，以及不同發(fā)育時(shí)期的纖維的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得HCT的序列，根據(jù)HCT序列設(shè)計(jì)引物，從海島棉品種新海21中克隆了1個(gè)GbHCT基因，分析了其序列和蛋白質(zhì)的親疏水性，二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位、跨膜域和信號(hào)肽，并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析該基因的表達(dá)模式，旨為進(jìn)一步研究海島棉GbHCT基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

收集海島棉品種新海21（Gossypium barbadense L cv. Xinhai 21）生長(zhǎng)至三葉期的葉片，液氮迅速冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 按Trizol試劑盒（Invitrogen）使用說(shuō)明，提取葉片總RNA。利用first strand cDNA Synthesis試劑盒（Thermo Fisher）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。按說(shuō)明書配制反轉(zhuǎn)錄第一鏈合成 反應(yīng)體系。

1.2.2 GbHCT基因的克隆 根據(jù)海島棉胚珠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的HCT基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，nHCT-F：5'-ATGGAGATTACTATAAAGGAGTCTGC-3'和 n H C T-R：5'-T T A A A A C T C A T A A A TAAGTTTTTCAAAAA-3'，以合成海島棉品種新海2 1葉片的cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）。按TransStart Taq DNA酶說(shuō)明書體系進(jìn)行PCR反應(yīng)液的配制。PCR 程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃復(fù)性45 s，72℃延伸 1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T（TaKaRa）載 體，菌液PCR檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆送上海美季公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件和Blast檢 索GenBank進(jìn)行多重序列比較和同源性分析。利用Clustalx 1.83軟件和MEGA 4.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。用Protparam（http://www.expas y. org/tools/protparam）在線預(yù)測(cè)蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及基本性質(zhì)；利用GOR IV 程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí) 結(jié) 構(gòu)（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl?page =npsa_gor4.html）。利用Swiss-Model（http:// swissmodel.expasy.org）程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的親水/疏水性。利用PSORT程序（http://www. psort.org/）對(duì)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRE D_ form.html）預(yù)測(cè)跨膜域。 利用SignalP程序（http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽。

1.2.4 GbHCT表達(dá)模式分析 查找本實(shí)驗(yàn)室海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得在0、5、10、15和25 DPA中GbHCT對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄組中unigene的reads數(shù)，用RPKM值表示GbHCT基因的相對(duì) 表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 GbHCT基因的克隆及序列分析

根據(jù)海島棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的HCT序列設(shè)計(jì)引物，從海島棉中克隆了一個(gè)編碼HCT的基因GbHCT（圖1）。GbHCT基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 311 bp，編碼436個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KT378286。使用Protparam在線預(yù)測(cè)GbHCT蛋白質(zhì)分子量為48.58 kD，等電點(diǎn)為6.03，分子式為C2206H3425N581O636S10。GbHCT與其他植物的HCT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中含有HTLGD和DFGWG 2個(gè)保守基序（圖2）。BLAST陸地棉基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)GbHCT對(duì)應(yīng)陸地棉CotAD-76176，定位于第11號(hào)染色體28871744-28873146（+），含有1個(gè)內(nèi)含子。

圖1 GbHCT基因的擴(kuò)增

同源性分析表明，GbHCT氨基酸與陸地棉CotAD-76176的氨基酸序列僅相差1個(gè)氨基酸，一致性達(dá)到99.77%。與亞洲棉GaHCT（KHG20214.1），雷蒙德氏棉GbHCT（XP_012455202.1）和棕色棉GhHCT（KF749428.1）的一致性分別為99.54%，97.02%和60.7%。與其他植物中的HCT氨基酸的一致性為55.7%-60%（圖2）。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖3）分析發(fā)現(xiàn)GbHCT和陸地棉CotAD-76176，亞洲棉和雷蒙德氏棉HCT成為一個(gè)分支，而棕色棉HCT（KF749428.1）和其他植物的HCT聚在一個(gè)分支，說(shuō)明GbHCT和其他植物的HCT蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 GbHCT蛋白的二級(jí)，三級(jí)結(jié)構(gòu)和親疏水性預(yù)測(cè)

利用GOR IV 程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖4所示GbHCT蛋白由436個(gè)氨基酸殘基組成，其中27.52%（120個(gè)）氨基酸殘基可能形成α螺旋，21.10%（92個(gè)）氨基酸殘基可能形成延伸鏈，51.38%（224個(gè)）氨基酸殘基可能形成無(wú)規(guī)卷曲。

利用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GbHCT蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，采用同源建模的方法，選擇比對(duì)率最高的中?？Х菴offea canephora HCT蛋白（SMTL id 4g0b.1）作為參照，得到GbHCT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖（圖5）。

利用ProtScale對(duì)GbHCT蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析。結(jié)果如圖6所示，GbHCT蛋白436個(gè)氨基酸當(dāng)中疏水性氨基酸最大值為2.444，親水性氨基酸最小值為-2.744，親水性總平均值為-0.151，推測(cè)GbHCT蛋白是親水性蛋白。

2.3 GbHCT蛋白的亞細(xì)胞定位、跨膜域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用 Psport 在線預(yù)測(cè)GbHCT蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明定位于葉綠體基質(zhì)的可能性為47.9%，定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為45.0%，定位于微體（過(guò)氧物酶體）的可能性為44.3%，定位于葉綠體類囊體膜的可能性為13.1%。因此推測(cè)GbHCT蛋白可能定位于葉綠體基質(zhì)。TMpred在線預(yù)測(cè)表明GbHCT蛋白存在一個(gè)跨膜域，位于301-319個(gè)氨基酸。SignalP預(yù)測(cè)表明GbHCT蛋白沒(méi)有信號(hào)肽。

2.4 GbHCT基因的表達(dá)模式

檢索海島棉纖維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，GbHCT基因在5 DPA的纖維中表達(dá)量最高，RPKM值為145 4.89。在10，15 DPA的纖維中表達(dá)量逐漸降低，在25 DPA表達(dá)量最低，RPKM值為22（圖7）。根據(jù)Gb-HCT的表達(dá)量推測(cè)該基因可能參與棉纖維發(fā)育進(jìn)程。

3 討論

圖2 GbHCT與其他植物的HCT氨基酸序列比對(duì)分析

圖3 GbHCT蛋白與其他植物的HCT蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析

圖4 GbHCT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 GbHCT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模

圖6 GbHCT蛋白的親/疏水性分析

木質(zhì)素代謝是苯丙烷代謝途徑重要分支代謝途徑。最近一些研究表明，木質(zhì)素的生物合成及在成熟纖維中的含量與棉花纖維的品質(zhì)有一定的關(guān)系。Fan等［7］發(fā)現(xiàn)酚類化合物結(jié)合成熟棉花纖維的細(xì)胞壁，而且在棉花纖維次生壁形成階段編碼催化木質(zhì)素代謝途徑中最后一步反應(yīng)的酶基因GhCAD6為上調(diào)表達(dá)。Al-Ghazi等［6］發(fā)現(xiàn)在陸地棉和海島棉中編碼催化從苯丙烷到對(duì)香豆酸途徑的酶基因PAL，C4H和4CL具有相似的表達(dá)水平。而且在纖維發(fā)育早期這些基因是非常高的表達(dá)，C4H表達(dá)與纖維長(zhǎng)度性狀正相關(guān)。Wang等［9］發(fā)現(xiàn)GhmiR397可能在棉纖維起始階段起正調(diào)控子作用，在野生型棉花胚珠中，GhmiR397介導(dǎo)的基因沉默下調(diào)控漆酶基因的表達(dá)，漆酶的減少導(dǎo)致木質(zhì)素產(chǎn)物減少，結(jié)果細(xì)胞壁表皮細(xì)胞松弛，促進(jìn)纖維膨脹和起始。Han等［8］研究發(fā)現(xiàn)WLIM1a在棉花次生壁增厚期可以作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)結(jié)合4CL1，CCR1和CAD6啟動(dòng)子中PAL-box順式作用元件上調(diào)這些基因的表達(dá)，從而使得超表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花株系的木質(zhì)素含量相對(duì)于野生型含量增加，因而影響纖維次生壁成分，使得纖維變細(xì)。這表明木質(zhì)素或木質(zhì)素類似酚類化合物可能影響纖維發(fā)育質(zhì)量。對(duì)本課題組海島棉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)苯丙烷代謝途徑中包括HCT基因在內(nèi)的多個(gè)基因在纖維發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)，本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從海島棉中克隆了GbHCT基因，對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。肖向文等［15］從棕色棉中克隆了一個(gè)HCT基因發(fā)現(xiàn)，該基因在16 DPA的胚珠中表達(dá)最高，在花瓣、莖和纖維中表達(dá)量次之，在葉片中的表達(dá)量最低。本研究發(fā)現(xiàn)海島棉GbHCT基因在5 DPA的纖維中表達(dá)量最高，HCT基因在棕色棉和海島棉中表達(dá)時(shí)期的差異可能與兩者品質(zhì)的優(yōu)劣有一定的關(guān)系，下一步將通過(guò)轉(zhuǎn)化海島棉來(lái)分析GbHCT基因的生物學(xué)功能。

圖7 GbHCT基因的表達(dá)分析

4 結(jié)論

從海島棉中克隆了1個(gè)編碼HCT的基因GbHCT，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 311 bp，編碼436個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為48.58 kD，等電點(diǎn)為6.03。GbHCT氨基酸序列中含有HTLGD和DFGWG 2個(gè)保守基序。預(yù)測(cè)了GbHCT蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、跨膜域和信號(hào)肽。GbHCT氨基酸與陸地棉CotAD-76176僅相差1個(gè)氨基酸，與其他植物中的HCT氨基酸的一致性為55.7%-60.7%。GbHCT在纖維不同發(fā)育階段都有表達(dá)，在5 DPA的纖維中表達(dá)量最高，表明該基因可能參與棉花纖維的發(fā)育。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Bioinformatics Analysis of Gene GbHCT from Gossypium barbadense

CUI Xue1JIADELA·Tuliuhan1YU Yue-hua1CHEN Quan-jia1SHEN Li-jie1YE Jia-li1YANG Ju-li1TAO Shun1NI Zhi-yong1，2
（1. College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Key Laboratory of Agricultural Biological Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052；2. Institute of Cotton Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences，State Key Laboratory of Cotton Biology，Anyang 45500）

This study is to isolate full-length cDNA of a key enzyme gene GbHCT related to lignin metabolism in cotton（Gossypium barbadense L.），and analyze the expression of GbHCT in the different developing stages of cotton’s fiber. The primers were designed according to the HCT sequence in transcriptome data of sea island cotton，then the gene was cloned using RT-PCR，and the cDNA sequence and the amino acid sequence of GbHCT were analyzed by bioinformatics methods. The expressions of gene GbHCT in developing fibers of cotton were analyzed from the transcriptome data of sea island cotton. A gene encoding HCT，designated as GbHCT，was isolated from G. barbadense. The full-length of the GbHCT consisted of a 1，311 bp open reading frame（ORF）encoding 436 amino acids. The molecular weight of protein was 48.58 kD，with an isoelectric point（pI）of 6.03. The deduced amino acid sequence of the GbHCT had two conservative motifs HTLGD and DFGWG. The deduced amino acid sequence had a high homology with HCT from Gossypium hirsutum，Gossypium arboretum and Gossypium raimondii，however，it showed 55.7%-60.7% identities with HCTs of other plants. Analyzing the transcriptome data of sea island cotton revealed that gene GbHCT was expressed in all different development stages of fiber，and the peak of expression reached in 5 days post anthers（DPA）fiber cells，suggesting that this gene may be involved in fiber development.

Gossypium barbadense L.；HCT；gene cloning；bioinformatics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.010

2015-07-18

棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金資助項(xiàng)目（CB2015A26），國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31360264），國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510758001），新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014211A025；2013211B19），新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（201411103），中國(guó)博士后科學(xué)基金（2015M582741），新疆維吾爾自治區(qū)優(yōu)秀博士后普通資助

崔雪，女，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：1067526924@qq.com

倪志勇，男，博士，副教授，研究方向：棉花纖維品質(zhì)改良研究；E-mail：nizhiyong@126.com