高選擇性和高靈敏度的microRNA檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

陳珍珠 李蕊 田飛 沈彥婷 葛芹玉

（東南大學(xué)學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心，南京 210096）

高選擇性和高靈敏度的microRNA檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

陳珍珠 李蕊 田飛 沈彥婷 葛芹玉

（東南大學(xué)學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心，南京 210096）

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在多種細(xì)胞過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，如細(xì)胞發(fā)育、脂肪代謝、器官生成、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等。研究表明，miRNA的表達(dá)水平變化與腫瘤、糖尿病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此對于miRNA表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確快速的檢測是對其進(jìn)行深入研究的前提。目前miRNA的檢測分析技術(shù)眾多，但是對于miRNA多態(tài)性和突變的檢測技術(shù)還不甚成熟，而且生物樣本中微量miRNA檢測技術(shù)的靈敏度亦需要進(jìn)一步的發(fā)展與突破。就近年來miRNA的高選擇性和高靈敏度的檢測方法進(jìn)行了綜述，旨為相關(guān)的檢測技術(shù)進(jìn)一步研究提供重要幫助。

miRNA；檢測方法；高選擇性；高靈敏度；基因調(diào)控

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，具有調(diào)控功能，廣泛存在于真核生物中，其大小長約20-25個核苷酸。多數(shù)miRNA 還具有高度保守性、時序性和組織特異性［1-3］。到目前為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)超過1 000種miRNAs［4］，因其具有抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯或者能夠剪切靶mRNA并促進(jìn)其降解的功能，所以在人類多種生物過程中起著至關(guān)重要的作用，如細(xì)胞生長、分化、凋亡和增殖等過程［5］?，F(xiàn)在許多研究表明，miRNAs的異常表達(dá)與許多癌癥相關(guān)，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等［6］。這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能［7］，因此有研究人員將miRNA命名為“oncomirs”。miRNAs被用于有 價值的標(biāo)志物在早期的癌癥診斷和預(yù)后中，研究miRNA的表達(dá)水平及其生物學(xué)功能，對探索生物進(jìn)化及防治人類疾病具有重要意義［8］。

在過去的一段時間，由于其特殊的生物學(xué)功能，miRNAs檢測技術(shù)的研究受到了廣泛關(guān)注，同時亦有大量相關(guān)文章發(fā)表，從印跡雜交、微陣列芯片檢測到最近發(fā)展起來的一些基于信號擴(kuò)增技術(shù)在內(nèi)的等一系列miRNA檢測方法被大量報道。印跡雜交技術(shù)（northern blotting）是用于miRNAs檢測分析的最為經(jīng)典的方法之一［9-12］。很多專家學(xué)者對其進(jìn)行了發(fā)展優(yōu)化，在一定程度上解決了miRNA在傳統(tǒng)northern blotting 時因其序列短，所引起雜交效率與檢測靈敏度的問題［13-15］。但是該方法存在一些缺點，如靈敏度較低、操作過程繁瑣、檢測時間長、檢測范圍窄、容易污染等。微陣列基因芯片技術(shù)［16，17］是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的高通量檢測技術(shù)，雖然具有高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，但檢測所用試劑和設(shè)備費(fèi)用高，且該方法對多個miRNAs的量化存在困難。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)［18］是體外快速擴(kuò)增特定基因最經(jīng)典和最廣泛應(yīng)用的方法，其中反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）在miRNA的檢測中亦被廣泛的研究及應(yīng)用。目前主要采用引物延伸RT-PCR、莖環(huán)引物RT-PCR［19，20］和miRNA加尾RT-PCR［21，22］等方法進(jìn)行miRNA的定性和定量檢測。盡管這些傳統(tǒng)的檢測技術(shù)基本能夠進(jìn)行miRNA的檢測，而且許多研究者從不同角度進(jìn)行了這樣那樣的優(yōu)化研究，以此彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測技術(shù)帶來的缺陷。但是考慮到miRNA檢測的特異性和靈敏度的問題，這些已有的方法仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化。

由于miRNA具有序列短、低豐度及家族成員間的高度保守性等性質(zhì)，致使其檢測難度增加，同時也增加了人們對于其檢測方法進(jìn)行深入研究的興趣。由于miRNA的檢測對于醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)都有著非常重要的意義，在很多臨床研究中，需要針對一些與癌癥相關(guān)的基因進(jìn)行檢測。由于miRNA在臨床研究中獲取難度很大，而且miRNA的穩(wěn)定性較差，放置時間不宜過長，在一定程度上增加了其檢測難度，所以提高檢測特異性和靈敏度是miRNA檢測面臨的一大挑戰(zhàn)［23］。同時，miRNA的表達(dá)調(diào)控比較精細(xì)，同一基因可能受不同miRNA的調(diào)節(jié)，對應(yīng)的同一miRNA也可能控制著多種基因的表達(dá)，如若想更好的將miRNA應(yīng)用于臨床研究中，則需要精確地區(qū)分miRNA的結(jié)構(gòu)和長度等信息，這也成為了當(dāng)前miRNA檢測的另一大技術(shù)難題。

近年來已有大量的文章涉及了這方面的工作，也有學(xué)者對miRNA的檢測方法做了綜述，但是關(guān)于高選擇性和高靈敏度的miRNA檢測技術(shù)的概括還不甚全面。本文主要從基于信號放大的等溫擴(kuò)增技術(shù)和電化學(xué)檢測技術(shù)用于高選擇性和高靈敏度的miRNA的檢測著手進(jìn)行了系統(tǒng)性總結(jié)，以便于人們對于其檢測技術(shù)有更深層次的認(rèn)識和了解，從而明確miRNA的研究進(jìn)展及研究方向，為更加充分的研究和利用miRNA 奠定基礎(chǔ)。

1 高選擇性和高靈敏度的microRNA檢測技術(shù)

1.1 基于信號放大的等溫擴(kuò)增技術(shù)用于高選擇性和高靈敏度的microRNA的檢測

由于miRNA檢測的傳統(tǒng)技術(shù)在選擇性和靈敏度上需要進(jìn)一步提高，所以一些學(xué)者在提高miRNA的選擇性和靈敏度上做了大量的工作，也報道了一些相關(guān)文獻(xiàn)，如表1所示。這些新的檢測技術(shù)將miRNA的檢測提高到了一種新的層次，從而推動了miRNA在臨床中的應(yīng)用。

一些學(xué)者在已有的miRNA檢測技術(shù)上做了改進(jìn)，從而大大提高了miRNA檢測的特異性和靈敏度。Cui等［24］提出了在T7核酸外切酶協(xié)助下利用滾環(huán)-循環(huán)酶雙擴(kuò)增法（RCA-CEAM）檢測miRNAs，如圖1所示。RCA-CEAM法是將RCA（滾環(huán)擴(kuò)增）與CEAM（循環(huán)酶擴(kuò)增）結(jié)合起來的一種高選擇性和高靈敏度的miRNA檢測方法。該方法為了減少背景信號，在CEAM環(huán)節(jié)中采用特定設(shè)計的線性分子信標(biāo)（linear molecular beacon，LMB）作為報告探針。其檢測限低至12 fM，而傳統(tǒng)的RCA法的檢測限為10 pM。與此同時，這種方法成功的應(yīng)用于肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的let-7a的表達(dá)水平的檢測，很好地證明了其在早期癌癥診斷中的潛在應(yīng)用。Ge等［25］提出基于靶細(xì)胞引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增-熒光原位檢測法（TPRCA-FISH）。該方法采用circular DNA作為探針與miRNA靶細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，隨后miRNA游離的3'末端引發(fā)了原位RCA反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物可以與熒光探針進(jìn)行雜交，以此來高靈敏度的指征靶 miRNA的存在。該技術(shù)中RCA反應(yīng)只能由成熟miRNA的游離的3'末端引發(fā)，從而消除了miRNA前體或 mRNA的干擾作用。這種方法被用于在人類肝癌細(xì)胞SMMC-7721和肝細(xì)胞L02中的miR-222表達(dá)水平的檢測，顯示其高靈敏性和強(qiáng)選擇性的檢測。此外，該方法中RCA產(chǎn)物與熒光探針雜交，產(chǎn)生的信號很強(qiáng)，能夠很容易的從背景信號中區(qū)分出來，可利用普通的熒光顯微鏡檢測，能夠很好地檢測低豐度的miRNA。

表1 基于信號放大的等溫擴(kuò)增技術(shù)用于miRNA的檢測

圖1 RCA-CEAM雙擴(kuò)增技術(shù)用于miRNA的高靈敏檢測的工作原理圖［24］

恒溫指數(shù)擴(kuò)增模式（IEXPAR）是利用線性擴(kuò)增的寡核苷酸產(chǎn)物來產(chǎn)生更多與引物序列相同的寡核苷酸序列，從而產(chǎn)生指數(shù)放大效果，該方法擴(kuò)增效率高。在此基礎(chǔ)上Yin等［26］提出了采用分子信標(biāo)的方法用于miRNA的檢測，這是一種新發(fā)展起來的簡單且可一步完成的反應(yīng)。這種方法是運(yùn)用熒光分子信標(biāo)（MB）固有的信號傳導(dǎo)機(jī)理，構(gòu)成一個“生物回路”，包含兩個反應(yīng)：由Nicking核酸內(nèi)切酶協(xié)助的等溫擴(kuò)增反應(yīng)和用于引發(fā)MB擴(kuò)增反應(yīng)及信號傳導(dǎo)的鏈置換聚合反應(yīng)。該反應(yīng)的檢測動態(tài)限為1 fM-100 nM，具有較高的靈敏性和特異性。Liu等［27］提出了基于鎖式探針的恒溫指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（P-ERCA）用于miRNA的檢測，其中該鎖式探針由與miRNA的雜交序列和Nicking核酸內(nèi)切酶的Nicking位點組成，大大提高了反應(yīng)的特異性和靈敏度，其檢測限降至0.24 zmol。

1.2 電化學(xué)檢測技術(shù)用于高選擇性和高靈敏度的microRNA的檢測

生物傳感器利用生物物質(zhì)作為識別元件，將特異性的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)換成可識別的信號，從而能夠進(jìn)行生命物質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)檢測和監(jiān)控的器件［37］。電化學(xué)生物傳感器具有高效、靈敏快速、簡便等特點，因此基于電化學(xué)技術(shù)的miRNA生物傳感器具有獨(dú)特的優(yōu)勢。電化學(xué)生物傳感器是將肽核酸固定在硅納米線（SiNWs）的表面上作為檢測miRNA的探針，當(dāng)與miRNA進(jìn)行雜交時，將會引起SiNWs界面電阻的變化，其變化值與miRNA濃度相關(guān)［38］。對于電化學(xué)生物傳感器，控制識別探針在表面的密度和位置是一大挑戰(zhàn)；信號擴(kuò)增的效率和靈敏度是電化學(xué)檢測技術(shù)的另一大挑戰(zhàn)。表2列出了近年來研究者提出并發(fā)展的一些基于電化學(xué)技術(shù)的miRNA檢測方法。

表2 電化學(xué)檢測技術(shù)用于miRNA的檢測

1.2.1 基于納米粒子放大的電化學(xué)檢測技術(shù) Cheng等［39］提出了一種基于CdTe納米晶體和Au納米簇（AuNCs）的電化學(xué)能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)，在連接酶的作用下進(jìn)行miRNA的檢測，如圖2所示。其中CdTe納米晶 體作為電化學(xué)發(fā)光的供體，而AuNCs作為電化學(xué)發(fā)光的受體。其基本原理為：首先合成AuNCs功能化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA，然后在玻璃碳電極上通過酰胺反應(yīng)結(jié)合到羧酸化的CdTe納米晶體上。當(dāng)只有miRNA存在時，雜交作用可直接將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA打開，這時由于CdTe納米晶體和A uNCs之間的距離很近，使得能量傳遞受 到影響，進(jìn)而致使電化學(xué)發(fā)光信號很弱。而當(dāng)miRNA和協(xié)助DNA同時存在時，連接酶能夠選擇性連接兩者到發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈上，以形成長的DNA-RNA異源雜交雙鏈。較長的鏈抑制了CdTe納米晶體和AuNCs之間的能量傳遞，從而大大增強(qiáng)了電化學(xué)發(fā)光信號，很好的提高了miRNA的檢測靈敏度。該檢測方法的線性范圍達(dá)到6個數(shù)量級，檢測限低至21.7 fM，而且具有很高的特異性。

圖2 基于CdTe納米晶體和Au納米簇（AuNCs）的電化學(xué)能量共振轉(zhuǎn)移分布miRNA檢測分析原理圖［39］

Dong等［40］提出了采用耦合的Hg2+介導(dǎo)的構(gòu)象的分子信標(biāo)（MB），用Ag納米簇（AgNCs）作為熒光團(tuán)，在核酸內(nèi)切酶輔助下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)用于miRNA的檢測。其中Hg2+能夠有效地淬滅AgNCs的熒光信號，在特定的溫度下，Hg2+介導(dǎo)的特定構(gòu)象的MB不能與靶標(biāo)分子雜交。在協(xié)助探針分子存在的情況下，靶標(biāo) 分子和MB探針退火，形成Y型結(jié)構(gòu)，隨即通過釋放Hg2+對AgNCs產(chǎn)生高的熒光淬滅效率。該技術(shù)的檢測限低至1 fM，同時消除了復(fù)雜的溫度控制和復(fù)雜的標(biāo)記，在臨床診斷中具有重要的應(yīng)用前景。

Ge等［41］提出了運(yùn)用四面體Au納米結(jié)構(gòu)探針與雜交鏈反應(yīng)相結(jié)合的方法進(jìn)行miRNA的檢測，其中三維四面體DNA納米結(jié)構(gòu)作為支架用于固定DNA識別探針，檢測信號通過雜交鏈反應(yīng)進(jìn)行放大。因為超級三明治結(jié)構(gòu)的分子雖然被廣泛用于信號擴(kuò)增，但是在構(gòu)建該結(jié)構(gòu)的過程中，其表面修飾及目標(biāo)分子消耗難以精確控制，從而影響了擴(kuò)增效率。而該檢測方法通過特定的引發(fā)劑或目標(biāo)分子來引發(fā)DNA雜交鏈擴(kuò)增反應(yīng)，其產(chǎn) 物為雙螺旋結(jié)構(gòu)，能夠捕獲大量的信號分子，從而大大增加了擴(kuò)增效率，與傳統(tǒng)的超級三明治擴(kuò)增法相比，提高了3個數(shù)量級，使miRNA的檢測限降低至10 aM。

1.2.2 基于酶的電化學(xué)檢測技術(shù) 最近，基于酶的電化學(xué)檢測技術(shù) 用于miRNA的檢測研究越來越廣泛，由于在其催化作用下可將單個雜交分子轉(zhuǎn)化成大量的檢測分子，這也大大的提高了檢測的靈敏性和特異性，同時為電化學(xué)生物傳感器用于miRNA的檢測開辟了一條新的途徑。近年來，關(guān)于這方面的報道也日益增多。

基于此，Cai等［42］曾設(shè)計了非標(biāo)記的特殊結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)用于的miRNA檢測的電化學(xué)生物傳感器。該生物傳感器所采用的非標(biāo)記的功能化變構(gòu)分子信標(biāo)（aMBs）在目標(biāo)物存在的情況下，能夠高效的與鏈霉親和素過氧化物酶聚合物結(jié)合，進(jìn)而通過催化反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的電信號。該傳感器消除抗原抗體相互作用需要復(fù)雜的DNA修飾這一缺點。該aMB 電化學(xué)生物傳感器用于miRNA的檢測具有高選擇性和高特異性，其檢測限低至3.4 fM。另外該傳感器可成功用于10%的血清樣本的檢測。

Lin等［43］報道了第三代E-DNA傳感器用于miRNA的檢測，該設(shè)計主要采用DNA四面體來確保莖環(huán)結(jié)構(gòu)能夠被很好地控制。莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性降低了反應(yīng)的背景信號，增加了反應(yīng)的特異性。隨后用生化酶進(jìn)行電化學(xué)信號擴(kuò)增。該E-DNA傳感器對于miRNA的檢測低至1 fM，能夠很好地區(qū)分高相似的miRNA家族成員。

Yu等［44］提出了基于拱形探針（arched probe）所介導(dǎo)的等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的一種簡單且非標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器的miRNA檢測技術(shù)，如圖3所示。該探針是在電極表面的由兩條在兩端彼此部分互補(bǔ)的特殊的探針分子。目標(biāo)miRNA可以與拱形結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交，產(chǎn)生的不完整的雙鏈DNA分子可以與引物結(jié)合，通過置換反應(yīng)或切割來獲得更多的miRNA分子，以實現(xiàn)指數(shù)循環(huán)擴(kuò)增。反應(yīng)過程中產(chǎn)生的單鏈DNA分子在鉀離子存在的情況下與血紅素結(jié)合形成G-四聯(lián)體DNA，產(chǎn)生的電化學(xué)信號可被高效的檢測。釋放到溶液中的另一條鏈觸發(fā)EXPAR循環(huán)和再生目標(biāo)分子。該技術(shù)的檢測限低至5.36 fM，其檢測線性范圍為3個數(shù)量級。

Deng等［45］提出了一種新的miRNA檢測技術(shù)，該技術(shù)首先是靶標(biāo)分子miRNA分子與固定在磁珠上的特異性探針（DZ-CPs）進(jìn)行雜交，然后利用雙鏈特異性核酸酶對其進(jìn)行切割，通過磁鐵去除未反應(yīng)的DZ-CPs和磁珠，溶液中獲得的DNA分子能夠作為催化劑在過氧化氫存在的情況下催化3，3'，5，5'-聯(lián)苯胺發(fā)生反應(yīng)，可以通過比色法進(jìn)行高靈敏度檢測。這種方法的檢測限低至0.8 aM。

圖3 基于聚合酶和Nicking核酸內(nèi)切酶的由拱形探針?biāo)閷?dǎo)的EXPAR技術(shù)用于miRNA檢測的原理圖［44］

2 結(jié)語

miRNA 的檢測對疾病的分子診斷和新型生物醫(yī)藥制劑的研發(fā)具有重要意義，近年來，有研究表明miRNA可作為一些癌癥治療的潛在靶向藥物用于臨床治療［62］。盡管目前為止，只有一部分miRNA的生物學(xué)功能得到了解釋，但是人們對于miRNA的研究仍在不斷努力。 miRNA的研究方法正在不斷發(fā)展，越來越多的報道闡明了檢測miRNA 在不同組織、不同時期、不同疾病狀態(tài)下的表達(dá)水平。miRNA檢測技術(shù)也越來越受到人們的關(guān)注，與此同時各種各樣的新發(fā)展起來的檢測技術(shù)已被運(yùn)用到miRNA的檢測之中，基于以前一些傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，miRNA的檢測選擇性和靈敏度有了很大的提高。隨著新技術(shù)新方法的迅速發(fā)展，科研人員在定量檢測 miRNA 方面有了更多的選擇，但仍需要專家學(xué)者不斷努力，爭取提出更完善的技術(shù)方法。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on miRNA Detection Techniques with High Sensitivity and High Selectivity

CHEN Zhen-zhu LI Rui TIAN Fei SHEN Yan-ting GE Qin-yu
（Research Center for Learning Science，Southeast University，Nanjing 210096）

microRNAs（miRNAs），a class of small，endogenous and non-coding RNAs，play critical regulatory functions in many cell processes such as cell development，fat metabolism，organs generation，cell differentiation and apoptosis，etc. Researchers have discovered that the dysregulation of miRNA expression is closely associated with various diseases including human cancers and diabetes. Therefore，the prompt and accurate detection of miRNA expression is the prerequisite for the further researches on it. Many assays for miRNA detection have recently been developed，but the detection techniques for polymorphism and mutation of miRNA are not so mature. Furthermore，the sensitivity for detection technology of microscale miRNA in biological samples also needs further development and breakthroughs. The new developed miRNA detection techniques with high selectivity and high sensitivity are reviewed in this paper，and then this may provide important assistance for further study on the related detection technologies.

miRNA；detection method；high selectivity；high sensitivity；gene regulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.005

2015-07-08

陳珍珠，女，碩士，研究方向：生物醫(yī)學(xué)工程；E-mail：zzchen_seu@163.com