LncRNA PCGEM1和雄激素受體在前列腺癌中的共定位表達及臨床意義

朱竹先，余 晨，邱忠民，呂寒靜，關廣聚，張子強.同濟大學附屬同濟醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 00065；.同濟大學附屬同濟醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 00065；.山東大學第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟南 5004

?

LncRNA PCGEM1和雄激素受體在前列腺癌中的共定位表達及臨床意義

朱竹先1，余 晨1，邱忠民2，呂寒靜2，關廣聚3，張子強2
1.同濟大學附屬同濟醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200065；2.同濟大學附屬同濟醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200065；3.山東大學第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟南 250014

［摘要］背景與目的：長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可參與腫瘤調(diào)控，有研究提示lncRNA PCGEM1可能影響雄激素受體（androgen receptor，AR）通路。本研究擬檢測前列腺癌lncRNA PCGEM1 和AR的表達情況，探討其在前列腺癌中的表達及意義。方法：構(gòu)建RNA核酸探針，應用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測前列腺癌lncRNA PCGEM1的表達情況，并使用熒光免疫組織化學技術(shù)檢測前列腺癌AR的表達；采用RNA-pull down技術(shù)檢測PCGEM1和AR的共同作用。結(jié)果：依賴AR的LNCaP細胞的PCGEM1表達水平顯著高于非AR依賴性的PC3和DU145細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。前列腺癌組織中PCGEM1的表達與AR表達程度顯著相關。與良性前列腺腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤中的PCGEM1細胞核內(nèi)定位顯著不同，雄激素去勢顯著影響PCGEM1的表達及細胞內(nèi)定位。而共定位檢測發(fā)現(xiàn)，PCGEM1與AR之間存在一定程度的共定位現(xiàn)象。結(jié)論：本研究通過FISH研究發(fā)現(xiàn)，PCGEM1表達在雄激素去勢條件下顯著上調(diào)，而在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，PCGEM1和AR的共定位表達表明，lncRNA PCGEM1和AR相互作用可能共同參與調(diào)控前列腺癌的惡性進展及轉(zhuǎn)移。

［關鍵詞］長鏈非編碼RNA；雄激素受體；前列腺癌

Correspondence to：ZHANG ZiqiangE-mail：zzq1419@126.com

在近幾十年里，腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是改善整體存活率的主要障礙，這可能主要因為人們對于癌癥生物學仍缺乏全面的了解。功能基因組學研究的最新進展表明，參與人類基因轉(zhuǎn)錄的絕大多數(shù)是非編碼RNA［1］。最近，更新的非編碼基因數(shù)據(jù)庫列出了超過56 000個人類長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）［2］，然而，這些lncRNA的功能仍有待確定。更多的證據(jù)表明，lncRNA可以在包括細胞生長、凋亡和腫瘤調(diào)控等方面發(fā)揮關鍵性作用，提示lncRNA在腫瘤生物學中潛在的重要作用如存在lncRNA Loc285194與mir-211之間，以及l(fā)ncRNA GAS5和miR-21之間的“競爭性內(nèi)源RNA”的調(diào)節(jié)機制［3-4］。然而，對于lncRNA在調(diào)控癌癥基因表達及機制等方面仍所知甚少。

雄激素受體（androgen receptor，AR）是前列腺癌等腫瘤的關鍵調(diào)節(jié)因子，也是這類腫瘤主要的治療靶點。然而，對于lncRNA是否及如何在這類腫瘤尤其是前列腺癌的侵襲及去勢抵抗中發(fā)揮作用，目前還了解甚少。最近，有研究表明，PCGEM1可能通過AR發(fā)揮作用［5］，但具體機制仍存在爭議。對此，本研究通過臨床標本研究，希望進一步明確PCGEM1的基因表達與前列腺癌惡性程度及轉(zhuǎn)移程度，通過熒光染色共定位的檢測，觀察PCGEM1可能通過與AR直接作用參與前列腺癌的進展及轉(zhuǎn)移。

1　材料和方法

1.1細胞及標本來源

前列腺癌LNCaP細胞株，采用含有5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。選擇前列腺癌LNCaP細胞進行細胞侵襲實驗研究。實驗細胞分為對照組及shRNA-PCGEM1組，具體操作方法參照參考文獻［4］。臨床男性患者前列腺腫瘤組織標本，包含前列腺良性腫瘤16例，平均年齡61.2歲，轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織樣本14例，GS評分均值7.2分（6～10分），平均年齡58.6歲。兩組之間患者年齡等一般特征差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有的病理學指標均由病理科資深醫(yī)師來確定。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

所采用PCGEM1的RTFQ-PCR引物序列為：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC，GGAGACTC CCAACCTGATGA。內(nèi)參照β-actin引物序列為：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'。

RTFQ-PCR檢測用Trozol（Gibco/BRL）一步法提取冰凍組織的總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，取0.5 μg總RNA用于反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系10 μL，包含1 μL MuLV反轉(zhuǎn)錄酶和相應的緩沖液。1 μL cDNA 用于PCR擴增，總體積25 μL，包含1 μL上下游引物、0.25 μL DNA聚合酶和相應的緩沖液，PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，β-actin的PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃45 s，共30個循環(huán)。

1.3熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）及熒光免疫組織化學檢測

通過LNCaP細胞進行FISH來確定PCGEM1的亞細胞定位。采用生物素標記的LNA反義PCGEM1探針（序列：T+T+T+TCCAAAGGG +T+CCGCTGTCCCTG+G+A+G），信號顯示采用TSATM試劑盒（#24）及Alexa Fluor 568（Life Technologies），石蠟切片厚度4 μm，常規(guī)脫蠟至水，采用高壓煮沸法行抗原修復后，操作參照試劑說明書，具體步驟參照參考文獻［5］進行。完成FISH顯色后，進一步應用AR抗體進行免疫熒光染色。免疫組織化學染色兔抗AR多克隆抗體。工作濃度1∶300，DAB顯色，蘇木精對比染色，采用山羊抗兔熒光二抗。每批切片免疫組化染色分析均以已知陽性組織切片做陽性對照，以PBS代替一抗做陰性對照。

1.4RNA pull-down檢測

為確定P C G E M 1與A R之間可能存在的相互作用，構(gòu)建T 7 - P C G E M 1核酸探針序列：TAATACGACTCACTATAG G G A G G C A C T C T G G C A C C C A G T T；GCGGCCGCGAAATCTTTAATATTTGTTA。通過上述T7-PCGEM1核酸探針進行RNA pulldown試驗，所得到pull-down產(chǎn)物進行蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）及相應特異性抗體檢測。具體步驟參照參考文獻［4-5］進行。

1.5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件包處理數(shù)據(jù)，不同組間表達的結(jié)果處理用t檢驗或X2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1PCGEM1在不同前列腺癌細胞株及前列腺組織中的表達

研究選擇不同類型的前列腺癌細胞株，包括LNCaP（AR依賴性）、PC3及DU145（非AR依賴性），通過RTFQ-PCR檢測PCGEM1在上述不同細胞株中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非AR依賴性細胞株PC3或DU145相比，LNCaP的PCGEM1表達水平顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1A）。與良性前列腺瘤比較，轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中的PCGEM1表達水平顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1B）。

2.2PCGEM1在LNCaP細胞中的表達定位及雄激素去勢的影響

通過前列腺癌細胞株LNCaP細胞，應用FISH技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，PCGEM1主要分布在細胞質(zhì)中，少量分布在核仁中。通過雄激素去勢處理后，發(fā)現(xiàn)細胞中PCGEM1表達水平顯著提高，并且可以發(fā)現(xiàn)顯著的PCGEM1異位，F(xiàn)ISH檢測顯示，細胞PCGEM1明顯的分布于細胞核，尤其是核小體中。而與AR的雙重染色共定位檢測發(fā)現(xiàn)，通過雄激素去勢處理后表現(xiàn)出顯著的PCGEM1和AR共定位現(xiàn)象（圖2），提示PCGEM1和AR共定位可能存在二者的共同作用而參與前列腺癌進展。

2.3PCGEM1在前列腺癌組織中的表達及與臨床特性的關系

應用FISH技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中PCGEM1的表達與腫瘤惡性程度顯著相關。與良性前列腺癌組織比較，轉(zhuǎn)移性腫瘤中的PCGEM1表達水平顯著提高，PCGEM1的表達與前列腺癌癌的分化程度、轉(zhuǎn)移顯著相關。同樣與細胞水平的研究相比發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞除了PCGEM1表達水平提高，還發(fā)現(xiàn)顯著的PCGEM1異位，F(xiàn)ISH檢測顯示，細胞中PCGEM1明顯的分布于細胞核。而與AR的雙重染色共定位檢測可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性前列腺癌表現(xiàn)出顯著的PCGEM1和AR共定位現(xiàn)象（圖3），進一步提示PCGEM1和AR可能存在二者的共同作用而參與前列腺癌進展。

圖1　LncRNA PCGEM1在不同類型前列腺癌細胞株中的表達Fig. 1　　Expression of lncRNA PCGEM1 in diferent prostate cell lines

圖2　FISH檢測PCGEM1和AR在前列腺癌LNCaP細胞中的表達及雄激素去勢干預后對其影響Fig. 2　　The expression of PCGEM1 and AR in LNCaP cell line，and the efect of androgen deprivation detected by FISH

圖3　FISH檢測PCGEM1和AR在前列腺癌組織中的表達及共定位檢測Fig. 3　　The expression and co-localization of PCGEM1 and AR in prostate cancer tissues detected by FISH

2.4RNA-pull down檢測PCGEM1與AR的相互作用及PCGEM1對LNCaP細胞遷移的影響

為確定PCGEM1與AR之間可能存在的直接相互作用，本實驗設計和構(gòu)建了T7-PCGEM1核酸探針進行RNA pull-down試驗，對所得到的pull-down產(chǎn)物進行Western blot及相應特異性AR抗體檢測。通過檢測前列腺癌細胞株LNCaP細胞發(fā)現(xiàn)，PCGEM1可以顯著地pull-down AR，與空白對照組（單純Beads對照組）比較，可以發(fā)現(xiàn)PCGEM1組能夠檢測到顯著的AR條帶（圖4A），進一步提示PCGEM1和AR二者之間的相互作用。與對照組比較，PCGEM1下調(diào)（shRNAPCGEM1）組的細胞侵襲能力顯著下降（圖4B、C），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3　討論

LncRNA可作為致癌基因和腫瘤抑制基因影響1個及1個以上的癌癥特征［6］。LncRNA在一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、表達水平及其同源RNA結(jié)合蛋白中的改變導致從神經(jīng)退行性疾病到癌癥等廣泛疾病的發(fā)生。所以，lncRNA廣泛參與人類疾病可能比之前認為的更為普遍［7］。一方面，一些lncRNA已被證實可發(fā)揮致癌作用，如PCAT-1作為影響細胞增殖的前列腺特異性調(diào)節(jié)因子，已被證實在部分前列腺癌患者群體中具有臨床預測價值，PCGEM1在前列腺癌中上調(diào)［8］，可促進細胞增殖［9］，并減少抗癌藥物如阿霉素和依托泊苷介導的細胞凋亡［10］，其他與前列腺癌相關的潛在的致癌lncRNA包括ANRIL［11-12］和CTBP1-AS［13］；另一方面，lncRNA也能起到抑制腫瘤的作用，如lncRNA p21作為p53依賴性的轉(zhuǎn)錄反應抑制因子，通過募集hnRNP-K至其基因組靶目標發(fā)揮作用［14］。

AR是前列腺癌的關鍵調(diào)節(jié)因子，也是其主要的治療靶點。大量的研究表明，一些蛋白質(zhì)可以和AR相互作用，導致基因的激活和去勢抗性［15］。AR異構(gòu)體的產(chǎn)生對于前列腺癌侵襲進展及去勢抵抗有重要的作用，而對于lncRNA是否在前列腺癌復發(fā)侵襲中發(fā)揮作用，目前還所知甚少。本研究初步發(fā)現(xiàn)，LncRNA PCGEM1與AR的表達存在高度的調(diào)控關系，提示PCGEM1可能通過調(diào)控AR發(fā)揮重要作用。

本研究通過FISH技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中PCGEM1的表達與腫瘤惡性程度顯著相關。PCGEM1的表達與前列腺癌癌的分化程度、轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關。針對PCGEM1 和AR在前列腺癌中的表達的共定位檢測發(fā)現(xiàn)，PCGEM1與AR之間存在一定程度的共定位現(xiàn)象。所以，PCGEM1表達與前列腺癌的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移有關，而PCGEM1和AR在前列腺癌表達中的共定位表明，PCGEM1和AR相互作用共同參與前列腺癌的惡性進展及侵襲轉(zhuǎn)移。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測PCGEM1和AR表達及共定位情況可能成為前列腺癌患者預后判斷和指導臨床治療的重要指標。

本研究通過對PCGEM1與前列腺癌轉(zhuǎn)移影響等的研究，明確PCGEM1與AR的相互作用對前列腺癌的臨床意義。這為制定新的臨床應用策略，包括發(fā)現(xiàn)新型的腫瘤生物標志物及分子治療靶點提供了理論依據(jù)。

［參 考 文 獻］

［1］ HANAHAN D, WEINBERG R A. Hallmarks of cancer：the next generation［J］. Cell, 2011, 144（5）：646-674.

［2］ WAPINSKI O, CHANG H Y. Long noncoding RNAs and human disease［J］. Trends Cell Biol, 2011, 21（6）：354-361.

［3］ LIU Q, HUANG J, ZHOU N, et al. LncRNA loc285194 is a p53-regulated tumor suppressor［J］. Nucleic Acids Res, 2013, 41（9）：4976-4987.

［4］ ZHANG Z, ZHU Z, WATABE K, et al. Negative regulation of lncRNA GAS5 by miR-21 ［J］. Cell Death Differ, 2013, 20（11）：1558-1568.

［5］ YANG L, LIN C, JIN C, et al. lncRNA-dependent mechanisms of androgen-receptor-regulated gene activation programs ［J］. Nature, 2013, 29（7464）：598-602.

［6］ HANAHAN D, WEINBERG R A. Hallmarks of cancer：the next generation ［J］. Cell, 2011, 144（5）：646-674.

［7］ WAPINSKI O, CHANG H Y. Long noncoding RNAs and human disease ［J］. Trends Cell Biol, 2011, 21（6）：354-361.

［8］ SRIKANTAN V, ZOU Z, PETROVICS G, et al. PCGEM1, a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97（22）：12216-12221.

［9］ PETROVICS G, ZHANG W, MAKAREM M, et al. Elevated expression of PCGEM1, a prostate-specific gene with cell growth-promoting function, is associated with high-risk prostate cancer patients ［J］. Oncogene, 2004, 23（2）：605-611.

［10］ FU X, RAVINDRANATH L, TRAN N, et al. Regulation of apoptosis by a prostate-specific and prostate cancerassociated noncoding gene, PCGEM1 ［J］. DNA Cell Biol, 2006, 25（3）：135-141.

［11］ KOTAKE Y, NAKAGAWA T, KITAGAWA K, et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15 （INK4B） tumor suppressor gene ［J］. Oncogene, 2011, 30（16）：1956-1962.

［12］ YAP K L, LI S, MUNOZ-CABELLO A M, et al. Molecular interplay of the noncoding RNA ANRIL and methylated histone H3 lysine 27 by polycomb CBX7 in transcriptional silencing of INK4a ［J］. Mol Cell, 2010, 38（5）：662-674.

［13］ TAKAYAMA K, HORIE-INOUE K, KATAYAMA S, et al. Androgen-responsive long noncoding RNA CTBP1-AS promotes prostate cancer ［J］. EMBO J, 2013, 32（12）：1665-1680.

［14］ HUARTE M, GUTTMAN M, FELDSER D, et al. A large intergenic noncoding RNA induced by p53 mediates global gene repression in the p53 response ［J］. Cell, 2010, 142（3）：409-419.

［15］ LIU L L, XIE N, SUN S, et al. Mechanisms of the androgen receptor splicing in prostate cancer cells ［J］. Oncogene, 2014, 33（24）：3140-3150..

Expression of lncRNA PCGEM1 and AR co-localization in prostate cancer and tis signifcance

ZHUZhu xian1，YU Chen1，QIU Zhongmin2，LV Hanjing2，GUAN Guangjv3，ZHANG Ziqiang2（1.Department of Nephrology，Tongji Hospital，Tongji University，Shanghai 200065，China；2.Department of Respiratory Medicine，Tongji Hospital，Tongji University，Shanghai 200065，China；3. Department of Nephrology，the Second Afliated Hospital of Shandong University，Jinan 250014，Shandong Province，China）

［Key words］Long non-coding RNA；Androgen receptor；Prostate cancer

［Abstract］Background and purpose：Long non-coding RNA （lncRNA） could be an important player in cancer biology. Recent studies showed that lncRNA PCGEM1 might be important in the regulation of androgen receptor （AR） signaling pathway. We tried to observe the expressions of lncRNA PCGEM1 and AR in prostate cancer，and investigate their role and significance in prostate cancer genesis and progress. Methods：The expression of lncRNA PCGEM1 was observed in prostate cancer by fluorescence in situ hybridization （FISH） technique. Then detection of AR was performed by immunofluorescence histochemistry methods. Their co-effective role was checked by RNA pull-down technique. Results：Compared with the AR-independent cell line such as PC3 or DU145，AR-dependent cell line such as LNCaP showed much higher expression of lncRNA PCGEM1 （P＜0.01）. PCGEM1 and AR could be co-localized in most of these prostate cancer samples，especially in the metastasis samples. Moreover，androgen deprivation promoted the translocation of PCGEM1 into nucleus. RNA pull-down results also proved the co-effective role of PCGEM1 and AR. Conclusion：This study showed that lncRNA PCGEM1 was highly expressed in metastatic prostate cancer. It was related to the progress and malignant behavior of the prostate cancer. Its co-localization with AR may play an importantrole in prostate cancer genesis and progress.

DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.04.006

中圖分類號：R737.25

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）04-0320-06

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81372513）；上海市浦江人才項目（15PJ1407500）。

通信作者：張子強 E-mail：zzq1419@126.com

收稿日期：（2014-12-15修回日期：2015-02-12）