微流控芯片在植物細(xì)胞研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王偉軒孫靜弈劉偉娜厚凌宇玉王寧何湘?zhèn)ブx響明

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 華北理工大學(xué)理學(xué)院，唐山 063009）

微流控芯片在植物細(xì)胞研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王偉軒1，2孫靜弈1劉偉娜1厚凌宇1玉王寧1何湘?zhèn)?謝響明1

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 華北理工大學(xué)理學(xué)院，唐山 063009）

植物細(xì)胞的傳統(tǒng)分析方法是將植物細(xì)胞在土壤或者瓊脂平板上生長(zhǎng)，然后在溫室或植物生長(zhǎng)室內(nèi)觀察植物的表型。這種方法耗時(shí)耗力，且結(jié)果分辨率比較低。微流控芯片具有微型化、體積小和高通量等特點(diǎn)，且可在微米水平精確控制植物細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。因此，能夠降低實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且可以達(dá)到單細(xì)胞水平的分析和鑒定。首先介紹了微流控芯片的加工材料和制備方法，總結(jié)了用于植物細(xì)胞研究的微流控芯片，重點(diǎn)闡述了近年來微流控芯片在植物根、花粉管、原生質(zhì)體和細(xì)胞壁動(dòng)力學(xué)等植物細(xì)胞研究中的應(yīng)用進(jìn)展，并展望了微流控芯片在植物細(xì)胞研究的應(yīng)用前景。

微流控芯片；聚二甲基硅氧烷；植物細(xì)胞；應(yīng)用進(jìn)展

隨著生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展，人們對(duì)生命科學(xué)的研究已逐步從宏觀深入到微觀，從群體走向了個(gè)體，甚至單細(xì)胞水平。傳統(tǒng)植物細(xì)胞分析方法是將種子或者植物細(xì)胞培養(yǎng)在土壤或者瓊脂平板上，然后觀察植物的表型。這些方法簡(jiǎn)單、易于操作，但是也有一些弊端。首先，傳統(tǒng)方法成本高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)也很難定量化；其次，植物細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)行為具有無規(guī)律性，以致很難從一個(gè)特定的方向觀察植物；另外，傳統(tǒng)研究方法的時(shí)間和空間分辨率低，也可能會(huì)導(dǎo)致在觀察植物表型改變過程中的信息丟失；最后，植物在固體培養(yǎng)基上無序的生長(zhǎng)行為也很難詳細(xì)地分析植物的生長(zhǎng)情況［1，2］。

近年來，科學(xué)技術(shù)的發(fā)展給植物細(xì)胞的研究注入了新的動(dòng)力，膜片鉗［3］、激光輔助顯微切割［4］、三維共培養(yǎng)［5］等技術(shù)都已經(jīng)引入到植物細(xì)胞的研究中來。微流控芯片技術(shù)是一種能精確控制和操控微尺度流體的新穎微機(jī)電技術(shù)，具有體積?。{升、皮升和飛升級(jí)別）、消耗低、裝置小、高密度、大規(guī)模、高通量和多功能等特點(diǎn)［6，7］，與宏觀尺度的實(shí)驗(yàn)裝置相比，這一技術(shù)顯著降低了樣品的消耗量，增大了流體的比表面積，提高了反應(yīng)效率，也降低了實(shí)驗(yàn)成本；同時(shí)通過微閥微泵等微細(xì)結(jié)構(gòu)的精確控制，微流控芯片使生命科學(xué)研究在時(shí)間與空間分辨率上也有了很大提高［8］。盡管目前微流控芯片的研究大部分仍然集中在動(dòng)物細(xì)胞［9，10］，但是微流控芯片在植物細(xì)胞研究中的應(yīng)用也已日趨成熟，主要包括植物細(xì)胞的表現(xiàn)型研究和化學(xué)藥物的刺激性等［11-13］。由于微流控芯片技術(shù)具有微米甚至納米級(jí)的高分辨率，使得微流控芯片可以模仿植物細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境，這不僅為植物細(xì)胞學(xué)的研究提供了新的視角和方法，而且具有許多傳統(tǒng)植物細(xì)胞研究方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)。本文概括了用于微流控芯片加工的材料和方法，總結(jié)了用于植物細(xì)胞研究的微流控芯片，重點(diǎn)介紹了近年來微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用，并對(duì)微流控芯片在植物細(xì)胞研究的前景進(jìn)行了展望。

1 微流控芯片簡(jiǎn)介

微流控芯片是一種以在微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)，具有將化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)室的基本功能微縮到一個(gè)幾平方厘米大小芯片上的能力，因此又稱為芯片實(shí)驗(yàn)室。由于它在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大潛力，已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料及機(jī)械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域［14-16］。1.1 微流控芯片的加工材料

微流控芯片經(jīng)過10多年的快速發(fā)展，用于微流控芯片的加工材料已經(jīng)從早期的硅和玻璃發(fā)展到今天的各種高分子聚合物，如聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚碳酸酯（polycarbonate，PC）、聚苯乙烯（polystyrene，PS）、聚苯乙烯二乙醚（polypheylene ether，PPE）等。表1列出了不同材料制備微流控芯片的一些優(yōu)缺點(diǎn)，從表中可以看出，聚合物材料的光學(xué)性質(zhì)好、易于加工且價(jià)格低廉，目前已經(jīng)成為微流控芯片制備的主要材料［17］。其中PDMS又是目前聚合物中用的最多的一種，其具有如下優(yōu)勢(shì)：（1）能夠透過250 nm以上的紫外與可見光，透氣，耐用又廉價(jià)；（2）有一定的化學(xué)惰性，芯片微通道的表面可以進(jìn)行多種修飾改造，能夠可逆和重復(fù)變形而不發(fā)生永久性破壞；（3）能用模塑法高保真的復(fù)制微流控芯片，不僅可與自身可逆結(jié)合，還能與玻璃、硅、二氧化硅和氧化型多聚物可逆結(jié)合。因而PDMS被廣泛應(yīng)用到了植物微流控芯片的制作中。

表1 三種材料制備微流控芯片的優(yōu)缺點(diǎn)

1.2 微流控芯片的制備

在微流控芯片研究早期，至少有20種不同的方法被用于微流控芯片的制備，主要包括光刻、化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕、離子束刻蝕、化學(xué)氣相沉積、物理氣相沉積和外延等。這些基于硅和玻璃類的微流控芯片制備工藝雖然相對(duì)成熟，但微流控芯片的成本卻相對(duì)昂貴。近年來PDMS芯片被廣泛應(yīng)用，其制備過程主要分為兩步：模具的制備和芯片的成型［17-19］。

1.2.1 模具的制備 （1）掩膜的設(shè)計(jì)與制作：掩膜的設(shè)計(jì)與制作是芯片制作過程中的關(guān)鍵工藝之一，其主要功能是實(shí)現(xiàn)對(duì)光的選擇性透過和圖形的精確復(fù)制。常規(guī)掩膜板的基材一般為熔融石英，這種材料對(duì)紫外光具有高的光學(xué)透射，而且具有較低的溫度膨脹和低的內(nèi)部缺陷，通常采用物理鍍膜方法在基材上濺射一層鉻，在鉻層上面需要涂布一層抗反射涂層。（2）曝光：曝光的主要目的是將掩膜上的微結(jié)構(gòu)圖形精確地轉(zhuǎn)移到光膠層上，使得光刻膠的感光部位發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。以負(fù)光刻膠SU-8為例，曝光時(shí)，因?yàn)楣饪棠z中的光引發(fā)劑——三苯基硫鹽吸收光子發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成一種強(qiáng)酸，在隨后中烘過程中作為催化劑促進(jìn)熱交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，形成致密的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而不溶于顯影液中。而未曝光的區(qū)域因?yàn)闆]有生成強(qiáng)酸，不發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而溶于顯影液中［20］。（3）芯片的刻蝕：刻蝕是利用光刻工藝處理后的光刻膠作為保護(hù)層，通過化學(xué)或者物理方法將被刻蝕物質(zhì)除去，從而得到所期望圖形的方法，根據(jù)刻蝕劑的狀態(tài)不同，可以將刻蝕工藝分為濕法刻蝕與干法刻蝕。（4）模具的成型：模具成型還需要去膠、去鉻、清洗和干燥等步驟。

1.2.2 PDMS芯片的成型 首先是基片的制作，將PDMS基質(zhì)與固化物按照質(zhì)量1∶10的比例進(jìn)行混合，用一次性勺子順時(shí)針攪拌30 min，充分?jǐn)嚢杈鶆?，為了防止PDMS固化后氣泡進(jìn)入，通常對(duì)PDMS預(yù)聚合物脫氣處理15 min左右。將處理好的PDMS預(yù)聚物澆注于模具中，控制反應(yīng)溫度為60℃，固化時(shí)間2 h，用手術(shù)刀將固化后的混合物沿著模板切割，可得PDMS基片，再用打孔器在PDMS上打孔。其次是蓋片的制作，PDMS蓋片在一培養(yǎng)皿中澆注而成，蓋片按基片的尺寸剪裁、打孔，用作樣品引入口和儲(chǔ)液池。最后將基片和蓋片對(duì)合就制成了PDMS芯片。

圖1 PDMS微流控芯片制作示意圖

2 微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來，微流控芯片已經(jīng)逐漸引入到植物細(xì)胞的研究中，并發(fā)揮著獨(dú)特的作用。通過歸納總結(jié)，本文將微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用主要分為六類：植物根的研究、花粉管的研究、污染物對(duì)植物毒性的研究、植物原生質(zhì)體的研究、細(xì)胞壁的生物力學(xué)研究和其它研究。

2.1 用于植物細(xì)胞研究的微流控芯片

隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，越來越多的微流控芯片被應(yīng)用到植物細(xì)胞的研究中，表2展示了當(dāng)前應(yīng)用于植物細(xì)胞學(xué)研究中的主要微流控芯片，概括了其在植物細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用，并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行了比較。

2.2 植物根的研究

根是植物重要的組成部分，一方面，它的作用是從環(huán)境中吸收水和養(yǎng)分［32，33］，因此根對(duì)脫水環(huán)境和物理化學(xué)刺激非常敏感；另一方面，根也存在高度的可塑性，能夠采取一定的策略來應(yīng)對(duì)外部環(huán)境變化［34］。研究植物生長(zhǎng)的分子機(jī)制需要一個(gè)體外研究平臺(tái)，在研究過程中為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的高效性，獲取植物表型等相關(guān)信息，在這個(gè)過程中需要考慮一些重要的參數(shù)。例如，生長(zhǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性、改變環(huán)境條件后實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性和重復(fù)性等。研究根生長(zhǎng)的分子機(jī)制還需要提供一個(gè)細(xì)胞水平分辨率的微環(huán)境，并且能夠精確控制植物根生長(zhǎng)的環(huán)境條件。傳統(tǒng)的工具——灌流生物反應(yīng)器［35］和96孔板［36］不具備高通量的特性并且不能精準(zhǔn)控制環(huán)境變化?；瘜W(xué)探針方法可以精確控制環(huán)境條件，但局限在靜態(tài)的離子分析，并且由于限制了探針的位置，獲取的圖形分辨率低。植物根的微流控芯片（Rootchip）能夠提供一個(gè)可控的微環(huán)境來研究根的生理機(jī)能，并且具備高通量的特性［37，38］。Grossmann等和Okumoto［38，39］設(shè)計(jì)了如圖2所示的植物根芯片用來研究植物根的生長(zhǎng)情況，首先把擬南芥的種子生長(zhǎng)在充滿瓊脂的錐形圓筒內(nèi)，使根在重力作用下向下生長(zhǎng)并通過塑料圓筒，當(dāng)根生長(zhǎng)到接口處時(shí)其生長(zhǎng)方向從垂直轉(zhuǎn)變?yōu)樗綘顟B(tài)，然后通過鑲嵌的樹杈型分支結(jié)構(gòu)到達(dá)觀察室（觀察室中的根是獨(dú)立生長(zhǎng)的），最后在芯片內(nèi)實(shí)時(shí)觀測(cè)根的生長(zhǎng)情況。這個(gè)系統(tǒng)的獨(dú)特之處主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面，可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的瞬時(shí)灌注；另一方面，可以進(jìn)行無損的代謝物檢測(cè)。此芯片還可以用于研究根特定部位的吸收情況，如根毛細(xì)胞等。在設(shè)計(jì)上稍微改變后也可以應(yīng)用到其他的植物種類。

微流控芯片技術(shù)與先進(jìn)的生物感應(yīng)器結(jié)合后，可以用來實(shí)時(shí)檢測(cè)植物根內(nèi)自由金屬離子的濃度［40］。為了更好地闡述金屬離子在植物體內(nèi)的平衡信號(hào)，Clara等和Lanquar［41，42］將根微流控芯片和熒光能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）結(jié)合用于分析了植物細(xì)胞內(nèi)Zn2+的分布和動(dòng)力學(xué)，其方法是將一系列FRET感應(yīng)器放到生長(zhǎng)在可視根微流控芯片內(nèi)的植物細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Zn2+濃度受外界Zn2+的供應(yīng)影響且變化在pmol/L-nmol/L這樣很小的范圍內(nèi)，他們利用此方法也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)Zn2+吸收系統(tǒng)。繼根芯片之后，Busch等［22］又發(fā)明了根陣列芯片，根陣列芯片是一種更高效的高通量微流控芯片，在根陣列芯片中可以同時(shí)研究64個(gè)擬南芥根在時(shí)間和空間上的基因表達(dá)情況。

表2 微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用以及和相比于傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢(shì)

圖2 根微流控芯片示意圖［43］

植物的根與外部環(huán)境存在相互作用，要研究植物內(nèi)部細(xì)胞如何應(yīng)對(duì)外部的信號(hào)需要較高的時(shí)空分辨率，然而傳統(tǒng)分析方法的空間分辨率僅局限于毫米水平［44］。另外，在根生長(zhǎng)過程中根周圍的固體培養(yǎng)基化學(xué)成分不能維持穩(wěn)定且不能精確量化。微流控技術(shù)可以通過對(duì)正在延長(zhǎng)根的特定位點(diǎn)給予不同化學(xué)處理，如氮、磷、鹽和其他植物激素等，從而幫助我們更好地理解根的發(fā)育機(jī)制。此后，Meier等［45］又設(shè)計(jì)了用于特定位點(diǎn)處理的微流控芯片，如圖3所示，中間刺激物的流體直徑在5-90 μm范圍內(nèi)可變。把生長(zhǎng)中的擬南芥根放在微流控芯片內(nèi)，只有特定的部位暴露于化學(xué)刺激中。通過改變3個(gè)層流溶液的組成和流速，能夠運(yùn)輸不同的化學(xué)刺激并且準(zhǔn)確控制根刺激部位的大小，從而提供高的空間分辨率。并且與傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基方法相比，隨著根的生長(zhǎng)，根的刺激物濃度不會(huì)隨著時(shí)間而發(fā)生改變。為了檢驗(yàn)層流微流控芯片的效果，作者還將植物激素的衍生物2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和它的抑制物N-1-萘基酞氨酸（NPA）流經(jīng)設(shè)定的擬南芥根部位，然后檢測(cè)植物激素流經(jīng)部位的綠色熒光蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)證明2，4-D提高了根形態(tài)的改變，如根毛的生長(zhǎng)。這進(jìn)一步說明了微流控芯片能夠在植物的特點(diǎn)位點(diǎn)給予相應(yīng)的刺激，具有較高的時(shí)空分辨率。

圖3 生長(zhǎng)中的擬南芥根周圍的層流［45］

2.3 花粉管的研究

植物的頂端生長(zhǎng)細(xì)胞能保持旺盛的分裂能力，是植物生長(zhǎng)的重要原因。花粉管是一個(gè)快速生長(zhǎng)的頂端生長(zhǎng)植物細(xì)胞［46］，它在開花植物的生命循環(huán)中起著重要的作用。它同時(shí)也是對(duì)化學(xué)信號(hào)非常敏感的植物細(xì)胞模型，可以通過改變生長(zhǎng)速度和延長(zhǎng)方向來應(yīng)對(duì)外界的刺激［47，48］?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為花粉管的生長(zhǎng)活動(dòng)由它的頂端控制，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和信號(hào)機(jī)制來維持它的極性生長(zhǎng)［49-52］。花粉管生長(zhǎng)在自然環(huán)境和類似的環(huán)境總呈現(xiàn)出對(duì)稱生長(zhǎng)（圖4-B），當(dāng)花粉管暴露在不對(duì)稱的刺激物時(shí)，刺激物可打破它的對(duì)稱生長(zhǎng)（圖4-C）。這些刺激可能是胚珠通過產(chǎn)生電信號(hào)或者化學(xué)信號(hào)用來吸引或者排斥花粉管［31，53］。人們一直對(duì)改變花粉管生長(zhǎng)方向的物質(zhì)以及外部化學(xué)信號(hào)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)機(jī)制很感興趣。Arata等［27］設(shè)計(jì)出了一個(gè)T型的微流控芯片（圖4-D），擬南芥的花粉管在中間約500 μm的微流控通道內(nèi)生長(zhǎng)，在通道左下角的小室內(nèi)放置未受精的胚珠，右下角的小室內(nèi)進(jìn)行空白對(duì)照，結(jié)果顯示由于胚珠分泌了某種化學(xué)物質(zhì)，擬南芥的花粉管向著未受精的胚珠方向不對(duì)稱生長(zhǎng)。同傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基上花粉管成輻射狀生長(zhǎng)相比，由于芯片通道的限制，花粉管只能向左或向右生長(zhǎng)，因此能更直觀地對(duì)花粉管的生長(zhǎng)方向進(jìn)行觀察和檢測(cè)。

雖然上面的實(shí)驗(yàn)?zāi)苤庇^地證明引起花粉管不對(duì)稱生長(zhǎng)的物質(zhì)是來自胚珠的，然而這種誘導(dǎo)物質(zhì)的精準(zhǔn)濃度是很難檢測(cè)的。為了進(jìn)一步研究花粉管生長(zhǎng)方向的機(jī)制，我們需要明確誘導(dǎo)物的組成以及精確控制它的濃度。由于微流控通道內(nèi)流體的雷諾數(shù)很?。≧e<1），微通道內(nèi)的流體僅能夠通過分子擴(kuò)散混合，因此微流控芯片可以提供穩(wěn)定的層流［54］。通過調(diào)節(jié)流速和擴(kuò)散系數(shù)，兩條液體流之間的界面能夠被調(diào)整到不同的細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域并提供準(zhǔn)確的濃度。Agudelo等［23］就用此微流控芯片定量研究了Ca2+對(duì)花粉管的影響。

圖4 花粉管在瓊脂和微流控芯片內(nèi)的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)［27］

2.4 污染物對(duì)植物毒性的研究

過去的幾十年中，人們已經(jīng)逐漸意識(shí)到研究環(huán)境污染物和有毒物質(zhì)對(duì)植物的影響意義重大，然而精準(zhǔn)判斷具體污染物種類卻依然是一個(gè)難題。一方面，不同種類的植物對(duì)同一污染物存在不同的半最大濃度效應(yīng)（EC50）；另一方面，植物通常生長(zhǎng)在不同的混合污染物中，鑒定出具體某一種污染物對(duì)植物的影響依然是一個(gè)挑戰(zhàn)。要解決這個(gè)難題在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上需要大量獨(dú)立實(shí)驗(yàn)和相當(dāng)大體積的毒性試劑，因此，建立以環(huán)境污染物對(duì)植物影響為基礎(chǔ)的高通量平臺(tái)具有很廣泛的前景。微流控芯片技術(shù)具備快速穩(wěn)定改變培養(yǎng)基成分的能力和高通量的潛能，并且已經(jīng)應(yīng)用到了藥物研發(fā)和細(xì)胞研究當(dāng)中。

通過在微流控芯片內(nèi)改變培養(yǎng)基成分，研究有毒物質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞和一些植物微小器官的影響已經(jīng)在微流控芯片中得到驗(yàn)證。小球藻是大氣中氧氣的主要生產(chǎn)者之一，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)非常重要。除藻劑和含重金屬的化學(xué)物質(zhì)等污染物能夠改變?cè)孱惖臄?shù)量，從而影響生態(tài)系統(tǒng)中氧氣的供應(yīng)量。為了檢測(cè)有毒成分對(duì)小球藻的影響，Küersten等［55］把小球藻培養(yǎng)在了微流控芯片中，并通過350個(gè)流體分段做了除藻劑中CuCl2對(duì)藻類影響的劑量依賴型分析，通過微流控系統(tǒng)中的光度計(jì)測(cè)出CuCl2對(duì)小球藻的半最大濃度效應(yīng)（EC50）。這種方法測(cè)得結(jié)果與通過微量滴定板獲得的數(shù)據(jù)是一致的。

植物的根和花粉管是植物最敏感的部分，通常用于檢測(cè)環(huán)境中污染物和不同污染物對(duì)植物的發(fā)育能力。微流控芯片能成功檢測(cè)出在改變根生長(zhǎng)微環(huán)境情況下根的生長(zhǎng)情況［22，37］。同時(shí)，花粉管實(shí)驗(yàn)也證明對(duì)花粉管有毒性的材料對(duì)動(dòng)物也存在毒性。這暗示研究有毒物質(zhì)對(duì)花粉管的影響在研究有毒物質(zhì)對(duì)人類影響的過程中具有潛在意義［56］。

2.5 植物原生質(zhì)體的研究

原生質(zhì)體由于去除了細(xì)胞壁，可以攝入細(xì)胞器、微粒體、病毒及一些大分子物質(zhì)（如DNA等），這種攝入能力，有助于我們廣泛研究遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入和表達(dá)，而且也易于轉(zhuǎn)化體和重組體在可控制的條件下的準(zhǔn)確的操作及分析。因此，原生質(zhì)體已經(jīng)作為進(jìn)行植物基因重組、離體基因遺傳轉(zhuǎn)化等操作較為理想的實(shí)驗(yàn)體系，成為分子水平和細(xì)胞水平上研究遺傳信息動(dòng)態(tài)的結(jié)合點(diǎn)，同時(shí)是研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、代謝及其它植物生理過程的有力材料。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)是指將分離純化干凈的植物原生質(zhì)體接種于培養(yǎng)基中，在一定溫度及光照等條件下，使原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁，并不斷進(jìn)行分裂生長(zhǎng)，形成肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)或再生出植株的培養(yǎng)過程。原生質(zhì)體再生不但是細(xì)胞融合的基本條件，也是基因?qū)搿⑼蛔凅w篩選的前提。

微流控芯片也逐漸應(yīng)用到植物細(xì)胞原生質(zhì)體的培養(yǎng)和細(xì)胞融合等細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)相比，微流控芯片內(nèi)培養(yǎng)植物原生質(zhì)體具有很多優(yōu)勢(shì)。首先，傳統(tǒng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)需要消耗大量的培養(yǎng)基和較大的細(xì)胞儲(chǔ)存空間，而微流控芯片技術(shù)能夠精準(zhǔn)控制培養(yǎng)基的流動(dòng)且需要較少的細(xì)胞數(shù)量，使細(xì)胞和細(xì)胞因子維持在一個(gè)可控的水平［57，58］；其次，微流控芯片與分析裝置結(jié)合后能夠更好地觀察和闡釋某些細(xì)胞生物學(xué)過程［59，60］。Ju等［61］利用微流控芯片成功地培養(yǎng)了煙草的原生質(zhì)體。武恒（Wu）等［29］設(shè)計(jì)了如圖5所示的一個(gè)由5個(gè)五邊形微室結(jié)構(gòu)組成的微流控芯片，在這個(gè)芯片上進(jìn)行煙草葉肉原生質(zhì)體及小白菜無菌苗原生質(zhì)體的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)顯示，在芯片內(nèi)培養(yǎng)的煙草葉肉原生質(zhì)體，無論在啟動(dòng)分裂還是形成細(xì)胞團(tuán)，都要比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法下生長(zhǎng)的速度要快近一天左右。同時(shí)在這個(gè)芯片上也實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)基的最優(yōu)化和原生質(zhì)體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)觀測(cè)，而且化學(xué)介導(dǎo)的煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體融合也得到實(shí)現(xiàn)。

圖5 原生質(zhì)體微流控芯片的結(jié)構(gòu)與功能［29］

在植物中，不同物種之間的原生質(zhì)體融合能夠更好地研究基因修飾和植物育種。融合首先是在兩個(gè)植物細(xì)胞的原生質(zhì)體上產(chǎn)生兩個(gè)小孔，然后在表面張力的作用下融合成一個(gè)細(xì)胞。在體外眾多的細(xì)胞融合技術(shù)當(dāng)中，因?yàn)殡娙诤嫌幸粋€(gè)安全的融合過程，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種類型的細(xì)胞融合中［62］。傳統(tǒng)的電融合由于缺少操縱單個(gè)細(xì)胞的控制系統(tǒng)，所以需要大量的細(xì)胞。而集成的微流控芯片能夠可控的在單細(xì)胞水平進(jìn)行電融合操作，因此需要的細(xì)胞大大減少，已經(jīng)成功應(yīng)用到5種不同的植物物種的細(xì)胞電融合中，包括擬南芥、煙草、濱海前胡、珊瑚菜和油菜［30］。

2.6 細(xì)胞壁的生物力學(xué)研究

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞外一層主要由多糖組成的結(jié)構(gòu)，對(duì)植物的發(fā)育和生長(zhǎng)非常重要。研究模式植物細(xì)胞的生長(zhǎng)需要定量研究細(xì)胞壁的機(jī)械性質(zhì)。由于單個(gè)細(xì)胞尺寸微小，直接測(cè)量細(xì)胞壁的機(jī)械學(xué)特性目前仍然是一種挑戰(zhàn)［45］。傳統(tǒng)的方法是通過拉力實(shí)驗(yàn)和壓力探針法進(jìn)行檢測(cè)［63-65］，這些方法對(duì)細(xì)胞具有侵襲性并且是在假定細(xì)胞壁機(jī)械性能分布一致下測(cè)得的。然而細(xì)胞膜最脆弱的部分可能會(huì)控制整體的細(xì)胞行為，所以這些方法是間接且不穩(wěn)定的測(cè)量方法。隨著顯微壓痕和電子力學(xué)顯微鏡在植物細(xì)胞研究領(lǐng)域的應(yīng)用，使得在亞細(xì)胞分辨率水平鑒定細(xì)胞壁的機(jī)械性質(zhì)取得成功［66］。然而，這種方法是基于測(cè)量材料的等向性和均勻性的假設(shè)，采用的是特定位點(diǎn)的壓縮和滲透，繼而測(cè)得楊氏橫量。因此這些方法也不能很好說明整個(gè)細(xì)胞壁的拉伸性能等重要特性。在測(cè)量細(xì)胞壁拉伸強(qiáng)度過程中，個(gè)體微小的細(xì)胞需要承受拉伸和彎曲這樣技術(shù)上的挑戰(zhàn)［67］。

圖6 Bending-Lab-On-a-chip［68］

最近，Nezhad等［68］設(shè)計(jì)了一個(gè)叫做Bending-Lab-On-a-chip（BLOC）（圖6）的微流控芯片并且應(yīng)用到植物細(xì)胞的彎曲實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量了細(xì)胞壁的楊氏橫量。他們首先將花粉粒的懸浮液放入芯片中，使花粉管沿著微小的生長(zhǎng)通道延長(zhǎng)，當(dāng)花粉管長(zhǎng)到底部的時(shí)候就暴露在彎曲的負(fù)載中，然后通過測(cè)量花粉管的偏離情況，再利用一個(gè)數(shù)學(xué)模型就可以進(jìn)行計(jì)算，從而獲得細(xì)胞壁的楊氏橫量。通過這種方法測(cè)量的結(jié)果和通過壓力探針等方法測(cè)得是一致的，但是這個(gè)技術(shù)直接地測(cè)量了細(xì)胞壁的彈性系數(shù)，能夠更全方位地測(cè)量細(xì)胞壁機(jī)械性能且特定位點(diǎn)細(xì)胞壁的機(jī)械性能是各向異性的，因此在測(cè)量細(xì)胞壁整體的機(jī)械性能上具有優(yōu)勢(shì)。

2.7 植物細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的其他應(yīng)用

微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用是廣泛的，除了上述的應(yīng)用外，也應(yīng)用到了其他的植物細(xì)胞生物學(xué)的研究當(dāng)中。例如，用微流控芯片研究植物細(xì)胞是否存在方向記憶性［28］，其方法是將花粉管培育在一個(gè)螺旋狀的微流控通道內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)花粉管觸碰到微流控通道內(nèi)壁時(shí)才會(huì)改變其生長(zhǎng)方向，這意味著如果沒有微通道內(nèi)壁花粉管會(huì)沿著原來的方向持續(xù)生長(zhǎng)。當(dāng)花粉管生長(zhǎng)到螺旋外暴漏在一個(gè)寬敞空間的時(shí)候，花粉管將保持它原來的生長(zhǎng)方向不變并且和最初花粉粒萌發(fā)的方向無關(guān)，此“方向記憶”芯片能夠提供亞細(xì)胞水平的微環(huán)境，而傳統(tǒng)的方法不具備這樣的能力。微流控芯片也應(yīng)用到了植物根和芽的表型［69］、檢測(cè)植物細(xì)胞缺陷的研究［70］、植物和細(xì)菌的相互作用［71］等研究中。但是微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用遠(yuǎn)不止于此，隨著研究的深入和科學(xué)的發(fā)展，微流控芯片技術(shù)一定能發(fā)揮更大的作用。

3 展望

微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)的研究中顯著地提高了實(shí)驗(yàn)的效率和結(jié)果分辨率，在特定位點(diǎn)處理植物細(xì)胞、植物細(xì)胞壁動(dòng)力學(xué)研究、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)和融合讓我們更深一步地理解了一些生物學(xué)問題。雖然相對(duì)于傳統(tǒng)的研究手段已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，但是在植物細(xì)胞學(xué)的研究當(dāng)中依然存在著許多問題亟待我們?nèi)ソ鉀Q。例如：（1）根的共區(qū)域化研究、突變體的篩選、自然環(huán)境下的變異和應(yīng)用不同的細(xì)胞壁染料高通量研究植物的生長(zhǎng)特點(diǎn)；（2）在藥物或者毒性的條件下定量研究植物細(xì)胞壁的機(jī)械性質(zhì)；（3）植物細(xì)胞的入侵生活方式等。這些挑戰(zhàn)還需要利用一些更有效的方法來研究。

盡管近幾年微流控芯片技術(shù)已經(jīng)越來越多地應(yīng)用到了植物細(xì)胞學(xué)的研究當(dāng)中，但與芯片在動(dòng)物細(xì)胞中的研究相比仍然具有很大的差距，因此微流控芯片在植物細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用還有很大的發(fā)展空間，這就需要我們研究出一些更新的微流控平臺(tái)?？傊鳛橐环N高度集成化、微型化以及智能化的生化分析平臺(tái)，微流控芯片將對(duì)人類的生活產(chǎn)生極其廣泛、深遠(yuǎn)的影響，甚至可能會(huì)給生命科學(xué)領(lǐng)域和生化分析領(lǐng)域帶來一場(chǎng)革命。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Application Progress of Microfluidic Chips in Studying Plant Cells

WANG Wei-xuan1，2SUN Jing-yi1LIU Wei-na1HOU Ling-yu1YU Wang-ning1HE Xiang-wei1XIE Xiang-ming1
（College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. College of Science，North China University of Science and Technology，Tangshan 063009）

Conventional methods of studying plant cells rely on growing plant cells in soil pots or agarose plates，followed by screening the plant phenotypes in traditional greenhouses and growth chambers. These methods usually need a large number of experiments，and suffer from low spatial resolution. While the microfluidic chips have many advantages，such as miniaturization，small volume consumption and high-throughput analysis，etc，moreover，it allows to precisely control the micro-environment of plant cells at micron-level. Therefore，it can reduce the cost and experimental time，and achieve in vitro single cell analysis and characterization. In this paper，the materials and manufacturing methods of the microfluidic chip were firstly introduced，then the recent microfluidic chips for studying plant cells were summarized，further mainly the application progress of microfluidic chips in plant root，pollen tube，protoplasts，and cell wall biomechanics were expounded，and finally the future research directions of microfluidic chips for plant cell were prospected.

microfluidic chips；polydimethylsiloxane（PDMS）；plant cell；application progress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.005

2015-08-24

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（BLX2013027），國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31400085），北京林業(yè)大學(xué)“北京市大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃”項(xiàng)目（201510022027）

王偉軒，男，碩士研究生，研究方向：微流控芯片；E-mail：18610524297@163.com

何湘?zhèn)ィ?，副教授，研究方向：微流控芯片；E-mail：hexiangwei@bjfu.edu.cn；謝響明，男，教授，研究方向：資源與環(huán)境微生物；E-mail：xxm1005@126.com