RP-HPLC法同時(shí)檢測(cè)短梗五加果中4個(gè)有效成分的含量*

孟永海，王欣慰，吳高松，翟春梅，楊春娟，宋　洋，王知斌（教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

?

RP-HPLC法同時(shí)檢測(cè)短梗五加果中4個(gè)有效成分的含量*

孟永海，王欣慰，吳高松，翟春梅，楊春娟，宋洋，王知斌*
（教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

摘要：目的：建立反相高效液相色譜-紫外法測(cè)定短梗五加果中4個(gè)有效成分含量。方法：采用Diamasil C18色譜柱（200×4.6mm,5μm），以乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相，流速為1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為25℃。結(jié)果：短梗五加果中4個(gè)有效成分的分離度良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線在檢測(cè)范圍內(nèi)均呈良好線性，r=0.9997～0.9999，平均回收率95.6%～101.6%，RSD為2.4%～3.3%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便可靠，精密度高，重復(fù)性好，適用于短梗五加果有效成分含量測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：短梗五加果；有效成分；高效液相色譜法

短梗五加果（Acanthopanaxsessiliflorus fruits）為五加屬植物的成熟干燥果實(shí)，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎等功效?，F(xiàn)代中藥化學(xué)研究表明藥材中含有綠原酸、原兒茶酸等酚酸類化合物，槲皮素、金絲桃苷等黃酮類化合物和短梗五加苷B、D等木脂素類化合物［1-5］。藥理學(xué)研究中，表明酚酸類化合物成分有抗炎、抗焦慮、鎮(zhèn)靜等藥理作用［6］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)短梗五加果有效成分的測(cè)定方法進(jìn)行了研究，為短梗五加果的質(zhì)量控制和深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與儀器

安捷倫1110高效液相色譜儀、安捷倫1110紫外檢測(cè)器（Agilent公司），DL-180超聲儀（浙江省海天電子儀器廠）；SZ-93重蒸水儀、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；METTLER TOLEDO電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），醋酸、甲酸、甲醇、正丁醇（分析純），重蒸水（自制），原兒茶酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供），短梗五加苷D、東莨菪苷（自制，采用峰面積歸一化法，純度大于98%）、（-）-pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucopyranoside（PDG）。本實(shí)驗(yàn)分別收集了短梗五加果青果（采收時(shí)間: 9月）和成熟果實(shí)（采收時(shí)間: 10月），購(gòu)于五加高新農(nóng)業(yè)科技開發(fā)公司丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2色譜條件

色譜柱：Diamasil C18（迪馬公司，200× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脫程序：9/91（0～14min），14/86（14～22min），18/82 （22～30min），流速：1mL·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱定適量原兒茶酸、東莨菪苷、PDG、短梗五加苷D，置于10mL容量瓶中，用70%甲醇溶解，搖勻，定容至刻度，制得對(duì)照品儲(chǔ)備液濃度：1.04 mg·mL-1原兒茶酸、1.08mg·mL-1東莨菪苷、2.21mg· mL-1PDG、1.22mg·mL-1短梗五加苷D。分別精密量取原兒茶酸、東莨菪苷、PDG、短梗五加苷D對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL，置25mL量瓶中，加70%甲醇搖勻，定容，制成對(duì)照品的混合溶液。

1.4供試品溶液的制備

取短梗五加果藥材，粉碎后過篩，精密稱取粉末1.0g，置于100mL三角形錐形瓶中，加正丁醇40mL，超聲處理30min，抽濾，提取2次，合并濾液，制成浸膏，用70%甲醇定容至10mL量瓶中，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.5線性范圍考察

精密吸取對(duì)照品混合溶液0.5、2.0、4.0、6.0、8.0mL分別置于10mL容量瓶中，用70%甲醇搖勻，定容。精密吸取對(duì)照品溶液和對(duì)照品混合溶液各20μL，注入HPLC色譜儀中，以質(zhì)量濃度（μg· mL-1）為橫坐標(biāo)（x），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。原兒茶酸回歸方程為y=126.1x-79.87，r=0.9997，線性范圍為2.08～33.28g·mL-1，東莨菪苷回歸方程為y=50.90x-9.919，r=0.9998，線性范圍為2.16～34.56g·mL-1，PDG回歸方程為y=36.09x-6.289，r=0.9999，線性范圍為2.42～38.72g·mL-1，短梗五加苷D回歸方程為y=88.82x-49.77，r=0.9995，線性范圍為2.44～39.04g·mL-1。

1.6精密度試驗(yàn)

精密稱取短梗五加果藥材粉末4份，按“1.4”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“1.2”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分含量的RSD：原兒茶酸2.7%、東莨菪苷2.6%、PDG 2.0%、短梗五加苷D 2.7%、均小于3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，在室溫放置，分別于0, 2, 4, 8, 12, 24h進(jìn)樣分析，所測(cè)定的4個(gè)成分色譜峰峰面積的RSD在12h內(nèi)均小于3.0%，說明在12h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

1.8加樣回收率試驗(yàn)

稱取短梗五加果粉末4份各0.5g，分別加入相當(dāng)于所測(cè)成分含量100%的混合對(duì)照品溶液適量，按“1.4”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“1.2”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果原兒茶酸平均回收率95.6%，RSD=3.3%（n=6），東莨菪苷平均回收率99.0%，RSD=2.9%（n=6），PDG平均回收率99.4%，RSD=2.5%（n=6），短梗五加苷D平均回收率101.6%，RSD=2.4%（n=6）。

1.9樣品的含量測(cè)定

取三批供試品溶液和“1.5”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品混合溶液20μL，按“1.2”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見色譜圖1。

取三批短梗五加青果和成熟期果實(shí)約1.0g，各3份，按“1.4”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“1.2”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。

圖1　色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of reference compounds （a）and samples（b）

表1　短梗五加果中4個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.1 The mean contents of four analytes in the A. sessiliflorus fruits（n=3）

2　結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)建立了RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定短梗五加果中4個(gè)活性成分的含量，檢測(cè)結(jié)果表明：青果中不含有原兒茶酸和東莨菪苷，而成熟果實(shí)果實(shí)和青果中均含有PDG和短梗五加苷D。

3　討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

由紫外掃描知木脂素類化合物的最大吸收波長(zhǎng)為210nm，原兒茶酸等在210nm處有末端吸收，為了兼顧所有化合物同時(shí)測(cè)定，增加檢測(cè)靈敏度，故選擇210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相選擇：由于水相中加入H3PO4基線平緩，待測(cè)樣品的理論踏板數(shù)較高，所以選擇加入H3PO4，且加入0.05%的H3PO4，相鄰色譜峰均達(dá)到基線分離。同時(shí)，選擇乙腈為有機(jī)相可有效減少噪音干擾。提取溶劑選擇：不同濃度的甲醇、乙醇可將藥材中大量的色素提取出來，而正丁醇萃取后干擾峰較少，所以提取溶劑選擇水飽和正丁醇。提取方法的選擇：實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)多次考察表明，提取時(shí)間對(duì)結(jié)果無顯著影響，為了節(jié)約時(shí)間和溶劑的用量，檢測(cè)方法使用的提取時(shí)間選擇30min，用量選擇40mL，而提取2次雜質(zhì)峰較少，且提取率沒有顯著性差異。最終確定提取方法為水飽和正丁醇40mL，超聲處理30min，提取2次。本文建立的方法簡(jiǎn)便可靠，重復(fù)性好，為短梗五加果有效成分的含量測(cè)定提供了有利的依據(jù)。

3.2流動(dòng)相選擇

為了提高靈敏度，減少噪音干擾，有機(jī)相選擇本底較低的乙腈。由于水相中加入磷酸基線平緩，所以選擇加入H3PO4，且加入0.05%的H3PO4，相鄰色譜峰均達(dá)到基線分離。

3.3提取溶劑選擇

不同濃度的甲醇、乙醇可將藥材中大量的色素提取出來，而水飽和正丁醇干擾峰少，所以提取溶劑選擇水飽和正丁醇。

3.4提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)多次考察表明，提取時(shí)間對(duì)結(jié)果沒有顯著影響，為了升高提取率，節(jié)約時(shí)間和用量，提取時(shí)間選擇30min，提取用量選擇40mL，而提取2次雜質(zhì)峰較少，且提取率沒有顯著性差異。最終確定提取方法為水飽和正丁醇40mL，超聲處理30min，提取2次。

4　結(jié)論

本文建立的方法簡(jiǎn)便可靠，重復(fù)性好，為短梗五加果有效成分的含量測(cè)定提供了有利的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］安琪,楊春娟,宋洋,等.無梗五加果化學(xué)成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20: 765-769.

［2］郭曉璐,師子明,齊文,等.刺五加果TLC鑒別及原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷的含量測(cè)定［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 32 （8）: 618-622.

［3］韓瑩.無梗五加果化學(xué)成分的分離分析及大鼠體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究［D］.沈陽(yáng):沈陽(yáng)藥科大學(xué), 2006: 1.

［4］史偉國(guó),崔立勇,佟慶,等.響應(yīng)面法優(yōu)化短梗五加中刺五加苷B和E的超聲提取工藝［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42（18）: 5747-5748.

［5］王祝偉.紅毛五加化學(xué)成分及其多維指紋圖譜研究［D］.沈陽(yáng):沈陽(yáng)藥科大學(xué), 2005: 42-44.

［6］Bouayed J, Rammal H, Dicko A, et al. Chlorogenic acid, a polyphenol from Prunus domestica（Mirabelle）, with coupled anxiolytic and antioxidant effects［J］. Journal of the Neurological Sciences, 2007, 262（1-2）: 77-84.

Simultaneous determination of four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus fruits by RP-HPLC*

MENG Yong-hai，WANG Xin-wei，WU Gao-song，ZHAI Chun-mei，YANG Chun-juan，SONG Yang，WANG Zhi-bin*
（Key Laboratory of Chinese Materia Medica（Ministry of Education）, Heilongjiang Key Laboratory of TCM Pharmacidynamic Material Bases, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China）

Abstract：Objective: To establish a RP-HPLC-UV method for the determination of four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus. Methods: Chromatographic conditions were gave on an C18column（200×4.6mm, 5μm）at 25℃, an isocratic mobile phase consisting of acetonitrile-0.05%phosphoric acid solution at a flow rate of 1mL·min-1and 210 nm detection wavelength. Results: four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus had good separating and linearity. The linear range of four effective compounds was wide（r=0.9997～0.9999）, the average recovery was 95.6～101.6%and RSD was 2.4～3.3%. Conclusion: The method is simple and reliable, high precision, good reproducibility, and accurate for the quantitative analysis of four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus.

Key words：the Acanthopanax sessiliflorus fruits；active compounds；HPLC

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160527

收稿日期：2015-12-01

基金項(xiàng)目：黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2012C064）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81303195）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）2013CB531801

作者簡(jiǎn)介：孟永海（1978-），男，博士，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究。

通訊作者：王知斌（1976-），男，副教授，研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和新藥臨床前藥學(xué)研究。