白鵑梅提取物的體外抗氧化活性及黃酮類化學(xué)成分的分離鑒定

朱玲玲，張廣文，鄭樹秀，邱瑞霞

(暨南大學(xué) 理工學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州,510632)

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白鵑梅提取物的體外抗氧化活性及黃酮類化學(xué)成分的分離鑒定

朱玲玲，張廣文*，鄭樹秀，邱瑞霞

(暨南大學(xué) 理工學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州,510632)

摘要文中對(duì)白鵑梅不同溶劑萃取物進(jìn)行體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)；在此基礎(chǔ)上利用薄層層析、柱層析、高效液相色譜儀進(jìn)行黃酮類物質(zhì)的分離、純化；質(zhì)譜儀、核磁共振對(duì)所分離的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：乙酸乙酯相萃取物的體外抗氧化活性相比其他相萃取物的活性大；從乙酸乙酯相萃取物中分離出3種黃酮類化合物，分別鑒定為——芹菜素(apigenin，化合物1)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside，化合物2)、蘆丁(rutin，化合物3)。

關(guān)鍵詞白鵑梅；體外抗氧化，黃酮，分離鑒定

白鵑梅(ExochordaserratifoliaS.Moore.)為薔薇科繡線菊亞科白鵑梅屬植物，全世界共4種，其中3種(白鵑梅、齒葉白鵑梅、紅柄白鵑梅)在我國(guó)有分布[1]。白鵑梅主要生長(zhǎng)在我國(guó)的江蘇、浙江、安徽一帶，又名繭子花、龍柏芽。該植物在《藥物植物詞典》以及《中華本草》等書籍均有記載，其根皮、樹皮入藥，用于腰骨酸痛的治療。

白鵑梅花蕾和嫩葉均可食用，在我國(guó)民間已有悠久歷史。據(jù)《中國(guó)野菜圖譜》等文獻(xiàn)報(bào)道，其所含多種維生素和Ca、Fe、Zn等營(yíng)養(yǎng)成分之高[2]，是許多常見(jiàn)蔬菜所不及的。研究表明，齒葉白鵑梅以及紅柄白鵑梅中含有豐富的黃酮類化學(xué)成分[3-4]，而黃酮類化合物是一種具有生物活性的天然有機(jī)化合物，隨著對(duì)黃酮類化合物研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有許多生理功能，如抗炎、抗病毒、抗氧化作用。

本文對(duì)白鵑梅中的黃酮類化合物進(jìn)行提取分離，并對(duì)不同條件下白鵑梅萃取物進(jìn)行體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明乙酸乙酯相提取物的體外抗氧化活性較高；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用柱層析、高效液相、質(zhì)譜、核磁共振等方法對(duì)白鵑梅中的黃酮類化合物進(jìn)行了分離純化和鑒定。

1材料和方法

1.1材料與試劑

白鵑梅幼葉及花蕾,采于河南平頂山舞鋼市。

無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯乙酸、濃H2SO4、H2O2；FeCl3、FeCl2、VC、EDTA、Na2HPO4、鉬酸銨、FeSO4、水楊酸,均為分析純，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

UV-9600紫外分光光度計(jì),北京瑞利儀器有限公司;EL104電子分析天平,METTLER TOLEDD有限公司;B-260水浴鍋,上海亞榮生化儀器;RE52C52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器;薄層色譜硅膠板(TLC),青島海洋化工集團(tuán)有限公司;高效液相色譜儀Shimadzu LC-20AT ,日本島津;質(zhì)譜儀,安捷倫儀器有限公司;AVANCEⅢ型超導(dǎo)核磁共振儀,德國(guó)Bruker公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1白鵑梅的分部萃取

稱取白鵑梅5 kg，用乙醇浸泡10 d，浸泡3次；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到乙醇浸膏。然后分別用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，水依次進(jìn)行萃取，每個(gè)過(guò)程重復(fù)3次；將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)分別得到不同萃取劑浸膏。

1.3.2白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的還原能力測(cè)定

分別配制質(zhì)量濃度 20、40、60、80、100、120 μg/mL 的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，分別加入2.5 mL，0.2 mol/L，pH 6.6的磷酸鹽緩沖液；2.5 mL ，1.0%的K3Fe(CN)6溶液；50 ℃ 水浴20 min 后；加入2.5 mL ，1.0%的三氯乙酸溶液；然后，分別加入2.5 mL水和0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液；充分反應(yīng)，在700 nm 下測(cè)吸光值；以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.3白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物總抗氧化活性測(cè)定

分別配制質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100、120μg/mL的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，取0.1 mL 樣品溶液于試管，分別加入0.6 mol/L 的濃硫酸，28 mmol/L 的Na3PO4溶液，4 mmol/L的鉬酸銨溶液各1 mL，試管密封，95 ℃ 水浴90 min ；然后室溫環(huán)境冷卻至25 ℃ ；695 nm 下測(cè)吸光值；以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

總抗氧化活性/%=[1-(Asample/Acontrol)]×100

1.3.4白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的DPPH自由基清除活性測(cè)定

分別配制質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100、120μg/mL的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，取2 mL樣品溶液于試管，依次加入2.0 mL 6 mmol/L 的FeSO4溶液，2.0 mL 6 mmol/L 的H2O2溶液，搖勻，反應(yīng)10 min ，加入2.0 mL 6 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液，搖勻，反應(yīng)30 min ，510 nm 下測(cè)吸光值，以 VC作為陽(yáng)性參照。

清除率/%=[1-(Asample/Acontrol)]×100

1.3.5白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的金屬離子螯合能力測(cè)定[5]

分別配制質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100、120μg/mL的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，取1.0 mL的樣品溶液于試管，分別加入20 mmol/L 的FeCl2100 μL，5 mmol/L 的ferrozine溶液0.2 mL，劇烈振蕩使其充分反應(yīng)，靜置10 min；在562 nm 下測(cè)其吸光值；以EDTA作為陽(yáng)性對(duì)照。

金屬離子螯合活性/%=[1-(Asample/Acontrol)]×100

1.3.6白鵑梅乙酸乙酯層萃取物的分離純化

根據(jù)不同提取溶劑的體外抗氧化活性結(jié)果，對(duì)乙酸乙酯相萃取物做進(jìn)一步的分離純化。首先將乙酸乙酯層浸膏(170.4 g)上硅膠(200～300目)層析柱(900 mm×45 mm)，用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶0～0∶100進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液每300 mL 為餾分；結(jié)合薄層色譜(TLC)檢測(cè)，合并，濃縮，得到22個(gè)餾分。

將餾分6上硅膠(200～300目)層析柱，用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=9∶1進(jìn)行洗脫；將洗脫液合并濃縮利用葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)進(jìn)一步分離純化，得到化合物1(23 mg )。

餾分8放置一段時(shí)間析出結(jié)晶，將晶體置出進(jìn)行重結(jié)晶，得到化合物2(15 mg)。

餾分20先經(jīng)V(三氯甲烷)∶V(甲醇)進(jìn)行洗脫；然后利用制備液相制備，條件為：流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)= 45∶55；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：40 μL ；波長(zhǎng)267 nm；將制備樣品于50 ℃ 旋蒸，得到化合物3(18 mg)。

1.3.7三種化合物的薄層色譜(TLC)測(cè)定

對(duì)上述實(shí)驗(yàn)所得的化合物1～化合物3分別進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)[6]，展開劑分別為：V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=6∶1、3∶1、2∶1；將硅膠板在碘缸中進(jìn)行顯色，計(jì)算其Rf值。

1.3.8白鵑梅黃酮類化合物HPLC測(cè)定

將化合物1,化合物2進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，HPLC實(shí)驗(yàn)條件為：DiamonsiLC18柱(5 μm , 25 mm×1.6 mm)進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；檢測(cè)器：SPD-M20A示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相：(化合物1)V(甲醇)∶V(水)=65∶35，(化合物2)乙腈-2%冰乙酸水溶液(體積比23∶77)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)；267nm。

1.3.9利用質(zhì)譜以及核磁鑒定白鵑梅黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)

根據(jù)薄層色譜(TLC)以及HPLC結(jié)果的初步推斷，化合物1～化合物3純度達(dá)到了95%以上；將化合物1,2分別利用質(zhì)譜以及核磁鑒定其分子質(zhì)量以及最終的結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與分析

2.1白鵑梅不同溶劑下萃取結(jié)果

根據(jù)不同溶劑萃取分別得到石油醚萃取物(PF)200.04g，乙酸乙酯萃取物(AF)170.4g，正丁醇萃取物(BF)42.49g，水層萃取物(WF) 306.98g。

2.1.1白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的還原性

實(shí)驗(yàn)分別對(duì)不同濃度的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物進(jìn)行了還原性測(cè)定；還原力強(qiáng)的樣品可以使Fe3+轉(zhuǎn)化成Fe2+；也可以和自由基互相作用從而阻斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；可以通過(guò)測(cè)定700nm波長(zhǎng)下生成的普魯士藍(lán)的吸光值進(jìn)行檢測(cè)；吸光值越大，樣品還原力越強(qiáng)[7]。由圖1可以看出，不同溶液的提取物的還原力的大小為：VC>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>水層萃取物>乙醇粗提物>石油醚萃取物；由此可以看出，乙酸乙酯層萃取物的還原能力最強(qiáng)，說(shuō)明其中還原劑含較多良好的電子供體；石油醚層萃取物的還原力相對(duì)最差。

圖1　白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的還原力Fig. 1　Reducing power of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.1.2白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的總抗氧化活性

實(shí)驗(yàn)方法的原理是樣品中的還原劑能將六價(jià)鉬還原為五價(jià)鉬，而五價(jià)鉬與磷酸鹽反應(yīng)生成綠色的磷酸鉬，該化合物在695 nm 下有最大吸收峰[8]。由圖2可以看出，白鵑梅各層萃取物都有一定的抗氧化活性，并且隨著濃度增加各層總抗氧化活性遞增；各層萃取物總抗氧化活性的大小順序?yàn)椋篤C>乙酸乙酯萃取物>乙醇粗提物>正丁醇萃取物>水層萃取物>石油醚層萃取物。各層萃取物中，乙酸乙酯萃取物的吸光值相應(yīng)最大，其總抗氧化能力最強(qiáng)，乙醇粗提物層總抗氧活性高于正丁醇層，石油醚層萃取物的吸光值相應(yīng)最小，總抗氧化能力最弱。

圖2　白鵑梅乙醇粗提物及其分步萃取物的總抗氧化活性Fig. 2　Total antioxidant activity of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.1.3白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的DPPH自由基清除活性

當(dāng)DPPH遇到自由基清除劑時(shí)，其結(jié)構(gòu)中的孤對(duì)電子被配對(duì)而退色，在510 nm 處的吸光值變小，且變小程度與樣品中自由基清除劑成正比[9]，可以由此作為判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。由圖3可以看出，白鵑梅各層萃取物對(duì)DPPH都有一定的清除能力，并且隨著濃度的增加，清除能力也相應(yīng)的增大；白鵑梅各層萃取物DPPH自由基清除活性的大小順序?yàn)椋篤C>乙酸乙酯層萃取物>正丁醇層萃取物>水層萃取物>乙醇粗提物>石油醚層萃取物；乙酸乙酯層清除能力最強(qiáng)，石油醚層相應(yīng)的最弱。

圖3　白鵑梅乙醇粗提物及其分步萃取物的DPPH自由基清除活性Fig. 3　DPPH free radical scavenging effect of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.1.4白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的金屬離子螯合活性

由圖4可以看出，白鵑梅各層萃取物都有一定的螯合能力，并且與濃度的大小呈正相關(guān)關(guān)系；各層萃取物金屬離子螯合能力大小順序：EDTA>乙酸乙酯層萃取物>正丁醇層萃取物>水層萃取物>乙醇粗提物>石油醚層萃取物。即乙酸乙酯層最大，正丁醇層次之，石油醚層最小。

圖4　白鵑梅乙醇粗提取以及分步萃取物的金屬離子螯合活性Fig. 4　Ferrous ion chelating capacity of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.2三種化合物的薄層層析結(jié)果

圖5是對(duì)應(yīng)化合物1～化合物3的薄層層析板在碘缸中顯色的結(jié)果。圖1硅膠板在紫外下觀察有黃色熒光；Rf1=0.46。圖2硅膠板在紫外下棕黃色熒光Rf2=0.56。圖3是蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與化合物3的對(duì)照，TLC檢測(cè)結(jié)果與蘆丁對(duì)照品Rf值以及斑點(diǎn)顏色一致；Rf3=0.35。

圖5　三種化合物的薄層色譜圖Fig.5　P-silica gel TLC of compounds 1 , 2 , 3

2.3化合物1,化合物2的HPLC結(jié)果

從圖6-A可以看出化合物1在流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=65∶35條件下，在HPLC色譜圖上保留時(shí)間為5.403 min。圖6-B可以看出化合物2在流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(2%冰乙酸)=23∶77條件下在HPLC色譜圖保留時(shí)間為8.887 min。

圖6　化合物1,2的高效液相色譜圖Fig.6　HPLC of compound 1, 2

2.4化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定

圖7　化合物1的氫譜、碳譜圖Fig.7　1H NMR , 13C NMR of compound 1

化合物1為淡黃色針狀晶體(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性。由MS結(jié)果可知，ESI-MS:m/z=269.2[M-H+]，271.0[M+H+]，分子式為C15H10O5。由圖7-A可以看出1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.66(1H,5-OH),7.92(2H,d ,J=9.0 Hz )，6.96( 2H,d,J=9.0 Hz )，6.68( 1H,s )，6.48(1H,d,J=2.0 Hz)，6.12(1H,d,J=2.0 Hz)，其中6.91 (2H,d,J=9.0 Hz)可以推出B環(huán)有對(duì)稱結(jié)構(gòu)；由圖7 B可以看出，13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:182.52(C-4)，164.91(C-2)，164.63(C-7)，161.84(C-4′)，161.36(C-5)，158.04(C-9)，128.06(C-2′,6′)，121.87( C-1′)，115.62(C-3′,5′)，103.92(C-10)，102.44(C-3)，98.72(C-6)，93.63(C-8)；由以上數(shù)據(jù)根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，可以推出該物質(zhì)為芹菜素(apigenin)，其結(jié)構(gòu)式為：

2.5化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定與分析

圖8　化合物2的氫譜、碳譜圖Fig.8　1H NMR , 13C NMR of compound 2

化合物2為黃色粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈藍(lán)色。由MS結(jié)果可以看出，ESI-MS:m/z=431.3[M-H+]，433.4[M+H+]。分子式為C21H20O10。由圖8-A可以看出，1HNMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:3.32-3.97 (6H, m)，5.08(1H, d,J=7.3 Hz)，6.51(1 H, d ,J=2.0 Hz)，6.67(1H ,d ,J=2.0 Hz)，6.82(1H ,s)，6.94(2H, d ,J=8.7 Hz)，8.07(2H ,d,J=8.7 Hz)；其中，5.08(1H, d,J=7.3 Hz)是糖的端基氫信號(hào)。由圖8-B可以看出，13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:61.07(C-6")，69.87 (C-4")，73.33 (C-2")，76.46 (C-3")，77.00 (C-5")，94.67 (C-8) 99.79 (C-1")，100.23 (C-6)，102.74 ( C-3)，105.69 (C-10)，115.64 (C-3′,5′)，121.69 (C-1′)，128.24 (C-2′,6′)，157.57 (C-9)，161.49 (C-5)，161.53 (C-4′)，163.42 (C-7)，165.37 (C-2)，182.69 (C-4)。由碳譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步推測(cè)出7號(hào)位有葡萄糖，氫譜及碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]數(shù)據(jù)相符，故推測(cè)該化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside)。結(jié)構(gòu)式為：

2.6化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定及分析

為黃色粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性。由質(zhì)譜結(jié)果可知，ESI-MS:m/z=609.5[M-H+]，633.4[M+,Na+]。通過(guò)UV紫外光譜掃描，在253,365 nm處有吸收，所以鑒定其為蘆丁(rutin)。結(jié)構(gòu)式為：

3結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，水5種溶劑對(duì)白鵑梅進(jìn)行提取得到的提取物中，均有一定的抗氧化活性，但經(jīng)過(guò)比較，乙酸乙酯相體外抗氧化活性相對(duì)最大。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)白鵑梅黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行分離、純化、鑒定初步得到了3種黃酮類化合物分別為芹菜素(apigenin)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside)、蘆丁(rutin)。

白鵑梅中含有多種具有活性的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)初步分離純化得到3種黃酮類化學(xué)成分；為以后提取分離純化得到更多的有效成分提供了基礎(chǔ)。

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Exochorda racemosa extract’s antioxidant evaluation and its flavonoids components analysis

ZHU Ling-ling,ZHANG Guang-wen*, ZHANG Shu-xiu, QIU Rui-xia

(Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

ABSTRACTThe antioxidant activity of exochorda racemosa extracts by different extracting solution was evaluated. Then, TLC , acolumn chromatography and HPLC were used to separate and purify the extracts. MS and NMR were used to identify the chemical components of the extracts. Results showed that: (1) the vitro antioxidant activity of extract in ethyl acetate was higher than in others ; (2) three compounds were isolated and identified as apigenin, apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside and rutin.

Key wordsExochorda racemosa; vitro antioxidant ; flavonoids ; isolation and identification

收稿日期：2015-06-24，改回日期：2015-09-06

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602039

第一作者：碩士研究生(張廣文副教授為通訊作者)。