純化PCR產(chǎn)物檢出微量生物檢材STR分型1例

劉亞舉，張俊濤

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純化PCR產(chǎn)物檢出微量生物檢材STR分型1例

STR Genotype of a Trace Biological Sample by Purified PCR Products

劉亞舉1，張俊濤2

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；微量DNA；純化PCR產(chǎn)物；競(jìng)爭(zhēng)性電泳

2.襄城縣公安局刑偵大隊(duì)，河南襄城 461700

隨著DNA檢驗(yàn)方法的成熟，大量的微量DNA被檢出，當(dāng)微量生物檢材得到的模板DNA量有限時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的再利用就顯得尤為重要，因?yàn)榱肀脔鑿侥軌蛲卣笵NA技術(shù)在法庭科學(xué)中的應(yīng)用領(lǐng)域，促進(jìn)DNA技術(shù)的深度應(yīng)用。

1案例資料

1.1簡(jiǎn)要案情某年12月，偵破系列搶劫殺人案，在團(tuán)伙人員居住地提取1.5 m光滑木棍1根，木棍上檢出死者李某(10月底被殺害)DNA，但團(tuán)伙成員拒不承認(rèn)使用過該兇器，將木棍進(jìn)行犯罪行為人的DNA檢驗(yàn)。

1.2檢驗(yàn)情況及結(jié)果

用移液器吸取20 μL淺黃色的納米銀溶液滴到4N6FLOQSwabsTM植絨拭子(AB公司，美國)頂端部，使之半濕潤(rùn)，擦拭木棍受力部位[1]，擦拭時(shí)來回拭抹、旋轉(zhuǎn)拭子表面，將檢材放入1.5 mL的離心管中，加入Prep-n-GoTM緩沖液(AB公司，美國)25 μL，以離心半徑9.5 cm、10 000 r·min-1、離心10 s，然后在室溫中靜置10 min，最后參照磁珠法[2]提取基因組DNA。按Identifiler Plus試劑盒(AB公司，美國)說明書配制PCR反應(yīng)液，采用12.5 μL擴(kuò)增體系，模板DNA為1、2、4 μL，在9700型擴(kuò)增儀上分28和30個(gè)循環(huán)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。

按照MinElute?PCR Purification kit(QIAGEN公司，德國)在QIAcube工作站上的操作手冊(cè)進(jìn)行。首先布置QIAcube工作界面，將PCR產(chǎn)物10 μL加入2 mL離心管中，放到QIAcube加熱震蕩模塊1～6處；在試劑槽A-C的位置旁邊依次放上1 000、200 μL 的Disposable Filter-Tips；將試劑盒中的MinElute硅膠膜離心柱和新的1.5 mL離心管分別放于Rotor Adaptor 1和3處；在緩沖液槽1、5、6處依照操作手冊(cè)放置Buffer PB、Buffer PE(每次使用時(shí)添加24 mL無水乙醇)和Buffer EB。然后啟動(dòng)Forensic post-PCR purification protocol程序，其中“Edit”狀態(tài)下“Fill-up volume”輸入90 μL即可，洗脫體積選擇15 μL。最后在Rotor Adaptor 3處的1.5 mL離心管中得到純化后的PCR產(chǎn)物溶液15 μL。

取2 μL純化后的PCR產(chǎn)物與0.25 μL內(nèi)標(biāo)Liz-500和10 μL去離子甲酰胺混合，95 ℃變性3 min后，冰浴3 min，置3500XL型遺傳分析儀上按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣條件(24 s、1.2 kV進(jìn)樣、15 kV電泳)全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，用GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行STR分型。

本例檢材磁珠法DNA提取，采用2 μL模板DNA進(jìn)行28個(gè)循環(huán)數(shù)擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)電泳檢測(cè)與分型，檢出完整STR分型，結(jié)果見圖1-2。此DNA結(jié)果與4號(hào)犯罪行為人的DNA一致，從而認(rèn)定了行兇者。

2討論

在本案中，需要對(duì)兇器上的脫落細(xì)胞進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，微量生物檢材想要得到完整STR分型，應(yīng)從以下方面改善：DNA提取方法、PCR擴(kuò)增(增加循環(huán)數(shù))、毛細(xì)管電泳檢測(cè)(提高進(jìn)樣電壓和延長(zhǎng)進(jìn)樣時(shí)間、PCR產(chǎn)物脫鹽處理)。文獻(xiàn)[3]比較了28個(gè)循環(huán)數(shù)的PCR產(chǎn)物脫鹽處理、改善毛細(xì)管電泳檢測(cè)電壓和時(shí)間、34個(gè)循環(huán)數(shù)的PCR擴(kuò)增在痕量法醫(yī)檢材上的應(yīng)用，結(jié)論是28個(gè)循環(huán)數(shù)的PCR產(chǎn)物脫鹽處理優(yōu)于其他方法。由于微量生物檢材得到的模板DNA量有限，因此充分利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯得尤為重要，PCR產(chǎn)物脫鹽處理主要有凝膠、過濾、純化等。本文借鑒方法[4]純化PCR產(chǎn)物，按標(biāo)準(zhǔn)條件(24 s、1.2 kV進(jìn)樣、15 kV電泳)進(jìn)樣和毛細(xì)管電泳，得到了完整STR分型。

A：D7S820等位基因丟失;B：D2S1338等位基因丟失;C：D18S51等位基因峰值低;D：D5S818和FGA等位基因未檢出

圖1PCR產(chǎn)物純化前的STR分型

A：D7S820等位基因未丟失;B：D2S1338等位基因未丟失;C：D18S51等位基因峰值均衡;D：D5S818和FGA等位基因檢出

圖2PCR產(chǎn)物純化后的STR分型

本例DNA檢驗(yàn)，MinElute?PCR Purification kit在QIAcube上進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化主要有“結(jié)合、洗滌、洗脫”3個(gè)步驟。適量的緩沖液PB攜帶的PCR產(chǎn)物溶液結(jié)合到MinElute硅膠膜時(shí)，是在高離液鹽和pH≤7.5環(huán)境中進(jìn)行，此時(shí)硅膠膜結(jié)合PCR產(chǎn)物才最大化，同時(shí)緩沖液PB又是經(jīng)特殊設(shè)計(jì)優(yōu)化，不

僅可以去除鹽離子，還能有效去除<40 bp的DNA及<40 nt的單鏈DNA，從而降低檢測(cè)中引物峰的干擾；當(dāng)PCR產(chǎn)物結(jié)合到硅膠膜上后，洗滌緩沖液PE可將鹽離子、dNTP、引物、殘留酶、降解產(chǎn)物等雜質(zhì)透膜，殘余的PE又會(huì)通過離心作用被除去；緩沖液EB將PCR產(chǎn)物從MinElute硅膠膜洗脫時(shí)，在低離液鹽環(huán)境中進(jìn)行，且pH在7.0～8.5之間才能最佳，一定量的緩沖液EB提供了合適的鹽離子濃度和最佳的pH值，并且對(duì)后續(xù)反應(yīng)無抑制效果。PCR產(chǎn)物純化之前，在恒定的電壓下和一定的進(jìn)樣時(shí)間內(nèi)，DNA同時(shí)要和內(nèi)標(biāo)及PCR產(chǎn)物的其他組分競(jìng)爭(zhēng)性進(jìn)入毛細(xì)管，如果DNA被電泳檢測(cè)的量少，就會(huì)影響到STR分型成功率；脫鹽純化后的PCR產(chǎn)物，純度更高，進(jìn)入毛細(xì)管的擴(kuò)增產(chǎn)物就增多，電泳檢測(cè)的STR峰型強(qiáng)度也高，大大地降低了背景干擾，使結(jié)果判讀清晰可見。另外，在不提高隨機(jī)閾值的情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳上樣量，本文分別采用1、2、4、5 μL進(jìn)行梯度檢測(cè)，最終2 μL的上樣量較為理想，隨著量的增加，會(huì)出現(xiàn)非特異性的峰增高。

本例DNA檢驗(yàn)，使用該工作站對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了自動(dòng)純化操作，其最主要的特點(diǎn)就是避免了手工操作影響干預(yù)pH值，因pH值是決定獲得成功STR分型的至關(guān)重要因素，所以能夠滿足日常工作需要。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉亞舉,孫現(xiàn)鋒,徐超,等.生物脫落細(xì)胞提取儀聯(lián)合EZ-tape膠帶偵破命案1例[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2012,28(3):235.

[2]劉亞舉,蘇偉民.食物殘?jiān)黃TR分型破案1例[J].中國司法鑒定,2013,(4):121-123.

[3]Luke Forster JT,Stefan Kutranov.Direct comparison of post-28-cycle PCR purification and modified capillary electrophoresis methods with the 34-cycle “l(fā)ow copy number” (LCN) method for analysis of trace forensic DNA samples[J].Forensic Sci Int(Genetics),2008,2(4):318-328.

[4]Smith PJ,Ballantyne J.Simplified low-copy-number DNA analysis by post-PCR purification[J].J Forensic Sci,2007,52(4): 820-829.

作者單位：1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南許昌 461000

文章編號(hào)：1672-688X(2016)02-0141-02

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.022

中圖分類號(hào)：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

收稿日期：2015-10-09

作者簡(jiǎn)介：劉亞舉(1978-)，男，河南襄城人，副主任法醫(yī)師，從事DNA檢驗(yàn)及法醫(yī)遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)工作。