核素锝[99mTc]對維甲酸誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干預(yù)研究

李　瑋

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核素锝[99mTc]對維甲酸誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干預(yù)研究

李瑋

摘要：目的研究核素锝[99mTc]對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響。方法采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以30 μmol·L-1維甲酸誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，并測定核素锝[99mTc]干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化后的生物學(xué)影響。結(jié)果活度為740、1 110 MBq·mL-1锝[99mTc]干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞6 h后，細(xì)胞存活率分別為(96.03±2.21)%、(94.47±2.12)%，锝[99mTc]干預(yù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在維甲酸誘導(dǎo)下可表達(dá)神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物Nestin和NSE。結(jié)論常規(guī)劑量下锝[99mTc]不影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活力和分化。

關(guān)鍵詞：99mTc；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)前體細(xì)胞；神經(jīng)元

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)的主要功能是參與構(gòu)成造血干細(xì)胞生存和分化的微環(huán)境。近年發(fā)現(xiàn)它還具有向多種細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的潛能[1]，可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞[2]、心肌樣細(xì)胞[3]及多種結(jié)締組織細(xì)胞(纖維、骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪細(xì)胞等)[4]，并且自體獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞回輸后不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，體外基因轉(zhuǎn)染率高，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已成為組織工程、細(xì)胞治療、基因治療等方面的研究熱點(diǎn)[5]。但骨髓中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的含量非常少，大約每10萬個單個核細(xì)胞中只含有1個骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[6]。因此，需在體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增后，才能滿足臨床服務(wù)要求。

核素锝[99mTc]具有適宜的半衰期，具有極佳的射線成像品質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于臨床核醫(yī)學(xué)顯像[7]，通過其所標(biāo)記的亞甲基二膦酸鹽(methylene diphosphonate,MDP)與骨骼吸附應(yīng)用于全身骨成像。但锝[99mTc]對其內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響目前還缺乏了解。本研究探討其對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性、分化等生物學(xué)特性的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及試劑6～8周齡的SD大鼠(雌雄不限)，體質(zhì)量120 g左右，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。高糖DMEM/F12(美國Gibco公司)，全反式維甲酸、胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品，多聚賴氨酸、GFPA、NSE、Nestin免疫組化試劑盒(streptavidin-perosidase，SP)為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，臺盼蘭為Chroma公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MSCs的分離純化取SD大鼠，引頸處死，75%乙醇浸泡5～10 min，無菌條件下將大鼠雙下肢剪下，轉(zhuǎn)移置于超凈工作臺上，分離股骨和脛骨。剪去股骨脛骨的兩端,充分暴露骨髓腔，注射器吸取5 mL10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，取沖洗液，梯度密度離心3次，棄上清，用培養(yǎng)基重懸。1×105·mL-1接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、pH 7.2條件下培養(yǎng)于5% CO2培養(yǎng)箱。48 h可見細(xì)胞黏附貼壁，每周換液兩次，待細(xì)胞貼壁率大于90%時，0.5 mL復(fù)合消化酶消化，于鏡下密切觀察細(xì)胞形態(tài)。按1∶2傳代，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代為P2～P6。

1.2.2誘導(dǎo)分化和免疫組化染色取P4～6代細(xì)胞，以(4～5)×106·mL-1密度接種于24孔板，待細(xì)胞80%融合，用含30 μmol·L-1維甲酸、20 μg·L-1bFGF、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組；對照組不加誘導(dǎo)劑。對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后8 d、13 d的神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。

1.2.3锝[99mTc]對MSCs的誘導(dǎo)①锝[99mTc]干預(yù)MSCs細(xì)胞活力的測定：選取P4～6代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，無锝[99mTc]培養(yǎng)基為對照組，實(shí)驗(yàn)組放入含锝[99mTc]配制培養(yǎng)基，按活度分為740、1 110、1 480、2 960 MBq·mL-14組，細(xì)胞密度(4～5)×106·mL-1。細(xì)胞培養(yǎng)12 h均更換為正常培養(yǎng)基，8 d及13 d時分別進(jìn)行MTT法檢測細(xì)胞活力。每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄上清，加入100 μL DMSO終止反應(yīng)。微震蕩，酶標(biāo)儀波長490 nm處測得吸光度值(A)?？瞻讓φ战M細(xì)胞存活率記為100%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/空白對照組A值)×100%。②锝[99mTc]干預(yù)MSCs誘導(dǎo)分化的免疫組化染色：锝[99mTc]干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時，得到MTT法證實(shí)細(xì)胞活力無影響的放射性比活度(740 MBq·mL-1)。以此對原代培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并在30 μmol·L-1維甲酸誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后8 d、13 d時，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Nestin、NSE、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，計算Nestin、NSE、GFAP染色陽性的細(xì)胞數(shù)比例。

2結(jié)果

2.1MSCs的培養(yǎng)原代培養(yǎng)72 h，貼壁細(xì)胞分裂增殖，細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞不斷分裂增殖，新生的細(xì)胞圓形，位于中心，周圍的細(xì)胞逐漸變?yōu)樗笮巍? d后可見集落形成，1周后集落增多，互相融合，細(xì)胞逐漸變成梭形。多次傳代的MSCs達(dá)融合生長時，有更均勻有序的成纖維細(xì)胞樣分布，見圖1A。

2.2神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和免疫組化全反式維甲酸誘導(dǎo)4 d后，大部分細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變：較多細(xì)胞形態(tài)呈神經(jīng)元樣改變，可見明顯神經(jīng)元樣的細(xì)胞突起，相鄰細(xì)胞間相互聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀；7 d后大部分細(xì)胞呈神經(jīng)元樣形態(tài)。對照組形態(tài)未發(fā)生明顯改變。誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)8 d和13 d后的細(xì)胞進(jìn)行NSE、Nestin、GAFP免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，DAB染色顯示胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達(dá)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樣細(xì)胞特異性標(biāo)記物Nestin和NSE染色呈陽性(見圖1B、C)，膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志GAFP為陰性，對照組染色均為陰性。

2.3锝[99mTc]干預(yù)MSCs細(xì)胞活力的測定與對照組相比較，锝[99mTc]濃度為740、1 110 MBq·mL-1組的細(xì)胞活力在各時間點(diǎn)均無明顯變化(P>0.05)；當(dāng)锝[99mTc]濃度升高至1 480、2 960 MBq·mL-1時，兩組細(xì)胞活力明顯降低(均P<0.05)。見表1。

表1　不同濃度锝[99mTc]干預(yù)MSCs存活率　%

2.4锝[99mTc]干預(yù)MSCs分化的免疫組化740 MBq·mL-锝[99mTc]干預(yù)維甲酸誘導(dǎo)MSCs定向分化為神經(jīng)元的能力，誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)8 d和13 d后的NSE、Nestin、GAFP免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，DAB染色顯示胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達(dá)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樣細(xì)胞的Nestin和NSE染色呈陽性(見圖1D、E)，GAFP為陰性。NSE表達(dá)呈逐漸上調(diào)，Nestin表達(dá)下降，對照組染色均為陰性(見表2)。

A：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣改變(×400)；B：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞維甲酸誘導(dǎo)后Nestin陽性(SP，×400)；C：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞維甲酸誘導(dǎo)后NSE陽性(SP，×400)；D：锝[99mTc]對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在維甲酸誘導(dǎo)后NSE染色(SP，×200)；E：锝[99mTc]對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在維甲酸誘導(dǎo)后Nestin染色(SP，×200)。圖1　锝[99mTc]對MSCS誘導(dǎo)的影響

%

3討論

骨髓MSCs在骨髓中的含量極少，大約10～100 MSCs/1×106BMCs左右[8]。目前對于骨髓中MSCs的分離比較常用的方法是密度梯度離心法[9]、貼壁細(xì)胞分離法、流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離法。作為組織工程的種子細(xì)胞，細(xì)胞的純度越高越好。密度梯度離心法操作較貼細(xì)胞分離法稍復(fù)雜，但細(xì)胞純度較后者高，更符合組織工程研究的要求。作者通過密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞分離法分離得到大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)幾次傳代后，細(xì)胞變?yōu)樾螒B(tài)更均一、排列更有序的成纖維細(xì)胞樣，通過此方法培養(yǎng)的MSCs在第一代時純度達(dá)90%，第二代超過95%。

[99mTc]是核素顯像中目前臨床應(yīng)用最廣泛的顯像核素，70%～80%用于標(biāo)記亞甲基二膦酸鹽為全身骨顯像。但其對骨髓中富集的干細(xì)胞特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的輻射能造成什么樣的后果，目前還不清楚，國內(nèi)也缺乏相關(guān)的研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用锝[99mTc]對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活和分化的影響做了研究，實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)正常檢查劑量(740～1 110 MBq·mL-1)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有明顯影響。在放射性活度>1 110 MBq·mL-1時，可引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性降低。在隨后的試驗(yàn)中，作者用安全劑量(740 MBq·mL-1)的锝[99mTc]干預(yù)維甲酸誘導(dǎo)的MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，8 d、13 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，可表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物Nestin和NSE，但分化能力總體上有所降低。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，被锝[99mTc]干預(yù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞仍具有正常生長及多向分化的能力，其毒性和劑量大小的關(guān)系不明顯。這項(xiàng)研究為臨床上指導(dǎo)核醫(yī)學(xué)常規(guī)工作以確保受檢者的安全性及核醫(yī)學(xué)醫(yī)務(wù)工作者和核醫(yī)學(xué)工作相關(guān)人員的個人防護(hù)管理等提供了基礎(chǔ)研究支持。

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作者單位：河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

Intervention Study of Retinoic Acid Induced Bone Mesenchymal Stem Cell Differentiated into Neuron with Nuclide Technetium[99mTc]

LI Wei

(First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impact of [99mTc] to bone mesenchymal stem cells (MSCs) induced by retinoic acid to differentiate into neuron-like cell.MethodsMSCs were isolated and purified by density gradient centrifugation and adherent culture, and then induced into neuron-like cell by 30 μmol·L-1retinoic acid. Biologcial effects of neuron-like cell were determined after [99mTc] interfered in the differentiation of MSCs.ResultsAfter the interference of 740、1 110 MBq·mL-1[99mTc] for 6 hours, cell survival rate was(96.03±2.21)% and (94.47±2.12)%respectively,and Nestin and NSE were expressed in the progress of 740 MBq·mL-1[99mTc] interfering in the differentiation of MSCs. ConclusionThe cell viability and differentiation of MSCs were not affected by the conventional dose of [99mTc] in vitro.

Key words:99mTc；bone mesenchymal stem cell；nerve precursor cell；neuron

文章編號：1672-688X(2016)02-0084-03

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.002

中圖分類號：R445.5;R818.03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2016-02-22

作者簡介：李瑋(1974-)，男，河南洛陽人，醫(yī)師，從事核醫(yī)學(xué)診斷治療工作。