切斷雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)對(duì)犬急性壞死性胰腺炎小腸免疫功能的影響

楊天保，孫君軍，易　芳，楊延輝

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切斷雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)對(duì)犬急性壞死性胰腺炎小腸免疫功能的影響

楊天保1，2，孫君軍1，易芳1，楊延輝1

摘要：目的探討在切斷內(nèi)臟神經(jīng)后對(duì)犬急性壞死性胰腺炎小腸免疫功能的影響。方法選取健康成年雜種犬17只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)5只、急性壞死性胰腺炎模型組(ANP組)6只和ANP+內(nèi)臟大神經(jīng)切斷組(GSNT組)6只。分別于術(shù)前2 h，術(shù)后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d抽取外周靜脈血，檢測(cè)血漿淀粉酶。7 d后處死動(dòng)物取小腸黏液檢測(cè)SIgA濃度，取小腸組織行病理學(xué)檢查和評(píng)分。實(shí)驗(yàn)中途死亡動(dòng)物放棄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并做死因分析。結(jié)果血漿淀粉酶ANP組和GSNT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；小腸黏液中SIgA濃度，GSNT組高于ANP組但低于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；小腸組織病理學(xué)評(píng)分，GSNT組高于ANP組但低于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ANP組死亡1只。結(jié)論切斷雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)可改善犬急性ANP時(shí)小腸的免疫功能，減輕小腸的病理損傷程度。

關(guān)鍵詞：急性壞死性胰腺炎；內(nèi)臟大神經(jīng)；小腸免疫功能

2.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003

急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreati-tis,ANP)是普外科常見的一種急危重癥疾病，以發(fā)病兇險(xiǎn)、病死率高著稱。繼發(fā)感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能衰竭是急性壞死性胰腺炎的重要死因，直接死于感染性休克的達(dá)19%[1]。ANP時(shí)腸道功能發(fā)生明顯障礙[2]，患者常表現(xiàn)為腹脹、惡心、嘔吐等。另外，細(xì)菌感染也是急性壞死性胰腺炎發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)[3]，繼發(fā)于急性壞死性胰腺炎感染的細(xì)菌主要是腸道菌群移位導(dǎo)致，這與腸道功能障礙密切相關(guān)[4-5]，而小腸的免疫功能對(duì)于維持腸道正常功能、防止細(xì)菌內(nèi)毒素移位有重要作用[6]。內(nèi)臟神經(jīng)對(duì)于調(diào)節(jié)內(nèi)臟器官的功能及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要作用，“膽堿能抗炎通路”概念的提出使神經(jīng)與炎癥的關(guān)系成為近些年的研究熱點(diǎn)，刺激迷走神經(jīng)可產(chǎn)生抗炎作用[7-9]。本研究以犬ANP模型為基礎(chǔ)，通過切斷雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)，觀察ANP時(shí)小腸病理學(xué)評(píng)分和黏液中SIgA的變化，為臨床治療急性壞死性胰腺炎提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料選取健康成年(2～3歲)雄性雜種犬17只，體質(zhì)量10～15 kg；牛磺膽酸鈉、胰蛋白酶均購自美國SIGMA公司；犬SIgA ELISA試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham operation，SO組)5只、急性壞死性胰腺炎模型組(acute necrotizing pancreatitis，ANP組)6只和ANP+內(nèi)臟大神經(jīng)切斷組(greater splanchnic nerve transection，GSNT組)6只。

1.2.2手術(shù)步驟①用舒泰50(犬全身麻醉藥)按15 mg·kg-1行肌肉注射，全麻成功后取仰臥位四肢固定于犬專用手術(shù)臺(tái)上，消毒、鋪無菌單，取腹部正中切口，逐層切開皮膚進(jìn)入腹腔。②解剖分離出左右內(nèi)臟大神經(jīng)，并掛線備用。③取距幽門約12 cm處縱行切開十二指腸前外側(cè)腸壁約2 cm，找到十二指腸副乳頭。沿副乳頭開口插入直徑1～2 mm的塑料導(dǎo)管(硬膜外麻醉導(dǎo)管)，置入主胰管5 cm左右，經(jīng)微量注射泵(調(diào)整好壓力后)，向主胰管內(nèi)以7.6 kPa恒定壓力注入50 g·L-1?；悄懰徕c(0.5 mL·kg-1)和胰蛋白酶(3 000 U·kg-1)混合制劑誘導(dǎo)ANP(在注入誘導(dǎo)藥物之前暫時(shí)夾閉膽總管)。注射完畢后即可見胰腺組織充血水腫，觀察10 min后包膜下點(diǎn)狀或片狀出血壞死，表明ANP模型建立成功。④提起所有掛線，逐個(gè)剪斷雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)干。⑤逐層關(guān)閉腹壁切口并消毒包扎。GSNT組按上述步驟進(jìn)行。SO組在步驟2中僅分離神經(jīng)，免去掛線；步驟3中以相同方法向胰管內(nèi)注入等量生理鹽水；免去步驟4，余步驟同GSNT組。ANP組僅免去步驟4，余步驟同GSNT組。整個(gè)手術(shù)過程嚴(yán)格按照無菌原則進(jìn)行操作。

1.2.3術(shù)后維持全部動(dòng)物制模完成后，禁食、禁飲，行完全腸外營養(yǎng)(每日氨基酸液2.0 g·kg-1、20%脂肪乳劑2.0 g·kg-1、50%葡萄糖4.0 g·kg-1、氯化鉀1.0 g、氯化鈉1.5 g，總補(bǔ)液量為每日70 mL·kg-1，手術(shù)期間和術(shù)后8 h內(nèi)適當(dāng)增加補(bǔ)液量)。

1.2.4標(biāo)本采集及檢測(cè)分別于術(shù)前2 h，術(shù)后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d抽取外周靜脈血3 mL，3 000 r·min-1，離心15 min取上清液，保存于-80 ℃冰箱待測(cè)；術(shù)后7 d處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取距回盲瓣10 cm的小腸組織，縱行剖開腸壁，用干凈的載玻片輕輕刮取腸黏膜表面黏液置于試管內(nèi)，并加入2 mL PBS液充分振蕩混勻，3 000 r·min-1，離心15 min取上清液，保存于-80 ℃冰箱待測(cè)；取距回盲瓣15 cm處小腸2 cm，使用眼科剪剪成1 cm×1 cm大小組織塊，常規(guī)制作病理切片，行HE染色。血漿淀粉酶采用全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝TBA-2000FR)進(jìn)行檢測(cè)；小腸黏液SIgA應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(意大利SEAC，ALISEI.Q.S)進(jìn)行定量檢測(cè)；小腸病理切片按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分[10]。(在HE染色情況下對(duì)腸黏膜絨毛、固有層、毛細(xì)血管、炎性組織浸潤等情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。)

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的方差分析、SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血漿淀粉酶水平術(shù)前2 h，3組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d，ANP組和GSNT組分別與SO組比較，血漿淀粉酶活性均顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；在術(shù)后12 h、24 h、3 d、5 d、7 d，GSNT組與ANP組血漿淀粉酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

①術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與SO組比較，P<0.05；②術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與ANP組比較，P>0.05。SO組：假手術(shù)組；ANP組：急性壞死性胰腺炎模型組；GSNT組:ANP+內(nèi)臟大神經(jīng)切斷組。圖1　3組血漿淀粉酶各時(shí)間點(diǎn)變化情況

2.2小腸黏液中SIgA水平ANP組和GSNT組分別與SO組比較，小腸黏液中SIgA濃度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；GSNT組小腸黏液中SigA高于ANP組(P<0.05)，見表1。

2.3小腸組織病理學(xué)評(píng)分ANP組和GSNT組分別與SO組比較，小腸病理學(xué)評(píng)分均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GSNT組小腸病理學(xué)評(píng)分明顯低于ANP組(P<0.05)，見表1。

表1　3組間小腸黏液SIgA濃度和病理學(xué)評(píng)分比較

注：①與SO組比較，P<0.05；②與ANP組比較，P<0.05。SO組：假手術(shù)組；ANP組：急性壞死性胰腺炎模型組；GSNT組:ANP+內(nèi)臟大神經(jīng)切斷組。

2.4ANP組死亡1只死亡動(dòng)物死因分析，病理解剖顯示其死于感染性休克、多器官功能衰竭。

3討論

本研究選用大型動(dòng)物犬，因其胰腺組織發(fā)達(dá)，且解剖結(jié)構(gòu)及生理功能與人類較為相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床更具指導(dǎo)意義[11]。胰腺淀粉酶是評(píng)價(jià)急性胰腺炎的經(jīng)典指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，ANP組造模成功后較術(shù)前明顯升高(P<0.01)，但是術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)ANP組與GSNT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)合術(shù)后注射造模藥物后胰腺組織明顯發(fā)生彌漫性充血水腫，并出現(xiàn)點(diǎn)片狀的出血壞死，由此成功建立ANP模型。

腸屏障功能包含機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障，正常的腸屏障功能可抵御腸道內(nèi)抗原物質(zhì)損傷腸黏膜，還可以防止正常寄居于腸道的細(xì)菌、毒素移位至其他組織器官，對(duì)于維持機(jī)體微環(huán)境穩(wěn)定有重要作用。小腸的免疫屏障主要由腸黏膜相關(guān)淋巴組織、黏膜固有層淋巴細(xì)胞及腸道內(nèi)漿細(xì)胞分泌的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)組成，通過體液免疫和細(xì)胞免疫共同抵御有害物質(zhì)的侵襲。生理狀態(tài)下腸道通過細(xì)胞免疫和體液免疫，既能對(duì)食物抗原產(chǎn)生免疫耐受，又可監(jiān)控、清除致病物質(zhì)，其中由漿細(xì)胞分泌至腸腔表面的SIgA在維持腸道免疫功能中有重要作用。SIgA可與細(xì)菌表面攜帶的抗原結(jié)合，阻止其與腸上皮細(xì)胞的黏附，從而阻止了細(xì)菌對(duì)腸壁的侵襲[12]。ANP時(shí)機(jī)體免疫功能發(fā)生紊亂，胃腸道的免疫功能也發(fā)生障礙，腸黏膜相關(guān)淋巴組織內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，散在分布的淋巴細(xì)胞也受到破壞。有研究發(fā)現(xiàn)，在ANP發(fā)生的早期階段由漿細(xì)胞分泌至腸道表面的SIgA已有顯著減少[13]。自主神經(jīng)系統(tǒng)中交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)的分支在調(diào)節(jié)免疫功能中起著重要作用[14]，Borovikova在2000年首次提出了“膽堿能抗炎通路”的概念[9]，表明刺激迷走神經(jīng)可產(chǎn)生抗炎作用。ANP是一種典型炎癥性疾病，ANP時(shí)致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β明顯升高，切斷內(nèi)臟大神經(jīng)后則致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β明顯降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10明顯升高，且胰腺病理損傷明顯減輕[15]。本研究結(jié)果顯示，ANP組小腸黏液中SIgA濃度明顯較SO組降低，表明ANP時(shí)腸道免疫功能障礙。然而，GSNT組小腸黏液中SIgA濃度明顯較ANP組高，表明切斷雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)可改善小腸的免疫功能，這種作用可能與分布于小腸的迷走神經(jīng)失去交感神經(jīng)抑制時(shí)活動(dòng)性增強(qiáng)，其神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿增加，作用于腸道內(nèi)的B淋巴細(xì)胞，促使其增殖活化合成分泌免疫球蛋白增加相關(guān)。術(shù)后7 d小腸組織的病理學(xué)評(píng)分也顯示GSNT組評(píng)分明顯低于ANP組，即內(nèi)臟大神經(jīng)切斷后小腸病理損傷程度明顯減輕，表明內(nèi)臟大神經(jīng)切斷對(duì)小腸組織有保護(hù)作用。

綜上所述，內(nèi)臟大神經(jīng)在犬急性壞死性胰腺炎時(shí)對(duì)小腸免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用，切斷內(nèi)臟大神經(jīng)可改善免疫細(xì)胞的活性，提高SIgA的分泌量，減輕小腸的病理損傷程度，對(duì)急性壞死性胰腺炎有一定的治療作用。

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作者單位：1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

Effect of Small Intestinal Immunological function after Cutting off the Bilateral Greater Splanchnic Nerve in the Dog with Acute Necrotizing Pancreatitis

YANG Tian-bao1,2, SUN Jun-jun1, YI Fang1, YANG Yan-hui1

(1.First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.College of Clinical Medicine of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo research the effect of small intestinal immune after bilateral greater splanchnic nerve transection in dog with acute necrotizing pancreatitis.Methods17 mongrel heath dogs were randomly divided into three groups, sham operation group (SO group) 5, acute necrotizing pancreatitis model group (ANP group) 6, and ANP with bilateral greater splanchnic nerve transection group (GSNT group) 6. The plasma levels of pancreatic amylase were monitored at 2 hours before operation. 2 hours, 12 hours, 24 hours, 3 days, 5 days and 7 days after operation. At post-operation 7 days all animals were killed, small intestinal mucous was collected to detect the level of SIgA, and a section small intestinal was collected to make pathological examination and score. If the animals were dead in process of experiment, all the related data would be abandoned, but the cause of death was investigated.ResultsThere were no significant difference between ANP group and GSNT group on the levels of plasma pancreatic amylase (P>0.05). The concentration of SIgA from small intestinal mucous was obvious reducing in ANP group and GSNT group compared with SO group (P<0.01), besides it was higher in GSNT group than ANP group(P<0.01). The pathological scores of small intestinal among the three groups, the ANP group and GSNT group scores were higher than that of SO group (P<0.01), while GSNT group was lower than ANP group(P<0.05). The ANP group had a dead animal in the experiment.ConclusionCutting off bilateral greater splanchnic never could improve small intestinal immunological function and alleviate the degree of small intestinal damage.

Key words:acute necrotizing pancreatitis；spalnchnic nerve；small intestinal immune

文章編號(hào)：1672-688X(2016)02-0087-04

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.003

中圖分類號(hào)：R657.5+1;R392.32

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2016-03-14

作者簡(jiǎn)介：楊天保(1988-)，男，河南漯河人，從事普外科疾病的臨床與基礎(chǔ)研究工作。