小鼠胰島β細(xì)胞(Min6)長鏈非編碼RNA Meg3綁定PRC2沉默Hes1表達(dá)

胡艷妹，朱亞男，德　偉

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

小鼠胰島β細(xì)胞(Min6)長鏈非編碼RNA Meg3綁定PRC2沉默Hes1表達(dá)

胡艷妹1，朱亞男2，德偉2

摘要：目的細(xì)胞水平研究Meg3與PRC2復(fù)合物的關(guān)系以及對其下游基因的影響。方法實(shí)時定量 PCR 檢測Meg3在Min6細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的定位，采用RIP技術(shù)、UCSC Genome Browser、CHIP技術(shù)驗(yàn)證Meg3與Ezh2及其下游基因Hes1的關(guān)系。結(jié)果qRT-PCR檢測Min6中轉(zhuǎn)染Si-Ezh2、Si-Suz12后Hes1基因的表達(dá)顯著受到抑制，CHIP結(jié)果表明Ezh2能直接綁定在Hes1的啟動子區(qū)域并介導(dǎo)H3K27me3的修飾過程，而敲除Meg3和Ezh2的表達(dá)使Ezh2與H3k27的結(jié)合能力降低。結(jié)論 lncRNAMeg3在小鼠胰島Min6細(xì)胞中能夠綁定核心蛋白復(fù)合體PRC2，Ezh2可以直接調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子基因Hes1的表達(dá)，該發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)一步豐富和完善胰島功能的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA；胰島β細(xì)胞；Meg3； PRC2；Hes1表達(dá)

2.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210029

長鏈非編碼RNA(lncRNA)的研究在國內(nèi)外已成為熱點(diǎn)，但研究主要都集中在腫瘤方面，胰島細(xì)胞功能方面的研究很少。長鏈非編碼RNA小鼠母系表達(dá)3(lncRNAMeg3)位于12號染色體末端，屬于母源性印跡基因，和人源Meg3基因具有同源性[1-2]。

Polycomb group (PcG) 蛋白是一組通過染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，從生化和功能上分成兩個主要的核心蛋白復(fù)合體PRC1(polycomb repressive complex 1)和PRC2(polycomb repressive complex 2) ，PRC1維持處于阻抑狀態(tài)染色質(zhì)的穩(wěn)定性，PRC2在轉(zhuǎn)錄抑制起始階段發(fā)揮作用[3-5]。PRC2由Ezh2、Suz12、Ezh1、Eed等多種亞基組成。最近研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的胚胎干細(xì)胞中，Meg3可以通過綁定PRC2亞基Ezh2，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因[6]。本文擬通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、RIP技術(shù)及CHIP技術(shù)，研究小鼠成年胰島細(xì)胞系Min6細(xì)胞中Meg3與PRC2復(fù)合物的關(guān)系以及對下游基因的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞系小鼠成年胰島細(xì)胞系Min6細(xì)胞，由南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要儀器及試劑實(shí)驗(yàn)所需DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)，胎牛血清購自加拿大Gibco公司；Meg3、Ezh2抑制劑購自美國Invitrogen公司；RIP、CHIP試劑盒購自美國Millipore公司)。Megafuge 1.0R高速離心機(jī)來自美國Sigma Aldrich公司，實(shí)時定量 PCR 擴(kuò)增儀、低溫高速離心機(jī)購自德國 Eppendorf 公司。

1.3主要方法

1.3.1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)Min6細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)，15%FBS，2.5 mmol·L-1beta-巰基乙醇，100 U·mL-1青霉素，以及100 mg·L-1鏈霉素培養(yǎng)基于37 ℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2核質(zhì)分離預(yù)冷PBS洗滌2次Min6細(xì)胞后進(jìn)行胰酶消化，將細(xì)胞裝入2 mL無菌無酶管，4 ℃胰酶消化5 min，棄上清用1 mL PBS洗滌沉淀，棄上清，加入500 μL細(xì)胞分離試劑，輕輕吹打，冰上靜置5～10 min。上清(質(zhì))轉(zhuǎn)入新2 mL無菌無酶管，4 ℃靜置5 min。 沉淀(核)加入500 μL細(xì)胞分離試劑，輕彈混勻，加入500 μL細(xì)胞溶解/綁定試劑，輕輕吹打混勻，冰上靜置，棄上清，加入預(yù)冷500 μL細(xì)胞分裂試劑，立即劇烈渦旋混勻后加入500 μL無水乙醇，輕輕吹打混勻，將吸附柱放入收集管，每次加入700 μL反應(yīng)液，12 000 g離心30 s。向沉淀加入700 μL清洗液，12 000 g離心30 s，棄收集管加入500 μL清洗液2/3，12 000 g離心30 s，棄收集管最大轉(zhuǎn)速離心空柱1 min，棄收集管。吸附柱換上新收集管，加入 40 μL稀釋溶液(提前水浴到 95 ℃)12 000 g離心 30 s 洗脫后加入10 μL洗脫液洗脫。測定RNA 濃度，DNA 逆轉(zhuǎn)錄，qPCR。

1.3.3Meg3和Ezh2抑制劑的瞬時轉(zhuǎn)染Min6細(xì)胞按每孔1×106個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%用于轉(zhuǎn)染。取10 μL 脂質(zhì)體稀釋于250 μL的OPTI-MEMI中，溫和吹打混勻，室溫下孵育5 min。取100 pmol si-Meg3或si-Ezh2、si-NC稀釋于250 μL OPTI-MEMI中，吹打混勻。將孵育好的脂質(zhì)體與si-Meg3或si-Ezh2、si-NC稀釋液混合，溫和吹打混勻。于室溫下繼續(xù)孵育20 min。將上述混合物均勻滴入事先加好1.5 mL OPTI-MEMI的6孔培養(yǎng)板中，輕輕混勻。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后，換完全培養(yǎng)基。

1.3.4RNA免疫沉淀法(RIP技術(shù))RIP實(shí)驗(yàn)按照美國密理博公司RNA免疫沉淀試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.3.5染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP技術(shù))首先用1%甲醛處理Min6細(xì)胞使其蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，超聲波將細(xì)胞染色質(zhì)打斷成200～500 bp的片斷；通過抗甲基組蛋白H3和Ezh2抗體沉淀蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)復(fù)合體；用蛋白酶K處理解除交聯(lián)，純化DNA；實(shí)時定量PCR檢測DNA的量。

2結(jié)果

2.1Meg3與Ezh2的綁定利用核質(zhì)分離試劑盒對Min6細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離，實(shí)時定量PCR檢測Meg3在Min6細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的定位。結(jié)果如圖所示(圖1A)：Meg3主要定位在Min6細(xì)胞的細(xì)胞核中，提示Meg3可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)。RIP結(jié)果顯示(圖1B)Min6細(xì)胞中Meg3可以綁定Ezh2。

A：Meg3在Min6中的細(xì)胞定位；B：Min6細(xì)胞系中Meg3可以綁定Ezh2。①與Ig G相比，P<0.05。

圖1Min6細(xì)胞系中Meg3可以綁定Ezh2

2.2Ezh2與下游基因Hes1綁定為驗(yàn)證Min6細(xì)胞中Meg3可以募集PRC2復(fù)合物的亞基Ezh2并綁定Ezh2，從而調(diào)控Ezh2下游轉(zhuǎn)錄抑制因子Hes1的表達(dá)，本文采用UCSC Genome Browser發(fā)現(xiàn)H3K27me3在Hes1啟動子區(qū)域出現(xiàn)峰值(圖2)。

圖2　H3K27me3在Hes1啟動子區(qū)域出現(xiàn)峰值

2.3Meg3綁定PRC2沉默Hes1基因的表達(dá)本研究中qRT-PCR檢測Min6中轉(zhuǎn)染si-Ezh2，si-Suz12后Hes1基因的表達(dá)顯著受到抑制(P<0.05，圖3A)，CHIP結(jié)果表明Ezh2能直接綁定在Hes1的啟動子區(qū)域并介導(dǎo)H3K27me3的修飾過程，而敲除Meg3和Ezh2的表達(dá)使Ezh2與H3K27的結(jié)合能力降低(圖3B、C)。

A：qRT-PCR檢測Min6中轉(zhuǎn)染si-Ezh2,si-Suz12后Hes1的表達(dá)；B、C：CHIP檢測Min6中轉(zhuǎn)染si-Ezh2,si-Suz12后Hes1的表達(dá)。①P<0.05。

圖3Min6細(xì)胞系Meg3綁定PRC2沉默Hes1基因的表達(dá)

3討論

胰島β細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)唯一能合成和分泌胰島素的細(xì)胞，在機(jī)體維持血糖平衡方面起著重要的作用[11]，糖尿病則為因體內(nèi)胰島素分泌絕對或者相對不足所導(dǎo)致的一系列臨床綜合征。研究表明，約30%的lncRNAs只在細(xì)胞核中被發(fā)現(xiàn)，約15%只在細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，而約50%定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[7]。這樣的亞細(xì)胞分布表明lncRNAs參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控。據(jù)文獻(xiàn)報道，大約20%lncRNAs在各種生命進(jìn)程中能夠通過結(jié)合PRC2表觀調(diào)控基因的表達(dá)。PRC2復(fù)合物是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，是由 Ezh2和Suz12組成。PRC2中核心亞基Ezh2具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，優(yōu)先選擇組蛋白3賴氨酸27位點(diǎn)三甲基化(Histone3 Lysine 27 trimethylation，H3K27me3)修飾，進(jìn)而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄失活。根據(jù)生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測Meg3與Ezh2存在結(jié)合。本研究RIP結(jié)果顯示Min6細(xì)胞中Meg3可以綁定Ezh2。

在小鼠的胚胎干細(xì)胞中，Meg3可以綁定PRC2亞基Ezh2，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因。有研究表明，成年胰島β細(xì)胞的功能維持與轉(zhuǎn)錄抑制因子有關(guān)。已報道的轉(zhuǎn)錄抑制因子有Hes1、Bhlhe22、Insm1、Sox6、Crem、Stx3[8]。在小鼠胚胎時期，Hes1負(fù)性調(diào)控胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的形成，抑制Ngn3蛋白的表達(dá)[9]。在小鼠MIN6細(xì)胞系中，Hes1被抑制后，轉(zhuǎn)錄因子MafA、Pdx1、NeuroD等轉(zhuǎn)錄因子的核酸水平上調(diào)[10]。作為通過染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子PRC2由Ezh2、Suz12、Ezh1、Eed等多種亞基組成[11-12]。眾多的lncRNA通過綁定PRC2復(fù)合物，結(jié)合到靶基因的H3組蛋白第27位賴氨酸處，發(fā)揮組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的功能，使其甲基化，從而使靶基因表達(dá)沉默，在表觀遺傳學(xué)上對其進(jìn)行調(diào)控[13]。而最近研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的胚胎干細(xì)胞中，Meg3可以綁定PRC2亞基Ezh2，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因。因此，本文致力于找到一個中間因子，可以介導(dǎo)Meg3與轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系，Meg3表達(dá)下調(diào)之后，作用于中間因子，使其表達(dá)上調(diào)，從而引起轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)。

作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，在Balb/c小鼠中，Meg3在胰島β細(xì)胞中特異性高表達(dá)，用siRNA干擾Meg3，胰島素的合成和分泌明顯減少，胰島素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MafA、Pdx1、NeuroD的核酸和蛋白水平表達(dá)下調(diào)，提示Meg3通過促進(jìn)胰島素的合成和分泌來維持胰島細(xì)胞的功能[14]。本文發(fā)現(xiàn)在Min6 細(xì)胞中，Meg3可以綁定Ezh2，Ezh2能直接綁定在Hes1的啟動子區(qū)域并介導(dǎo)H3K27me3的修飾過程。

綜上所述，Meg3綁定PRC2沉默Hes1基因的表達(dá)是通過H3K27me3修飾，進(jìn)而導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄失活。在小鼠β細(xì)胞中，Meg3可以募集PRC2復(fù)合物的亞基Ezh2并綁定Ezh2，抑制下游轉(zhuǎn)錄抑制因子Hes1的表達(dá)。

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作者單位：1.銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽銅陵 244000

LncRNA Meg3 Silences Hes1 Expression by Binding to PRC2 in Mice Pancreatic β Cells(Min6)

HU Yan-mei, Zhu Ya-nan, De-wei

(1.Medical Department of Tongling Polytechnic,Tongling 244000,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology School of Basic Medical Science,Nanjin Medical University,Nanjing 210029,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship of Meg3 and PRC2 complexes as well as its downstream genes in pancreatic β cells (Min6). MethodsqPCR detection Meg3 in localization of Min6 cell nucleus and cytoplasm, we also verified that the relationship of Meg3, Ezh2 as well as its downstream genes Hes1 by RIP, UCSC Genome Browser and CHIP. ResultsThe expression of Hes1 was significantly suppressed by downregulation of Si-Ezh2 and Si-Suz12 using small interfering RNA in Min6 cells. The results of CHIP assays showed that Ezh2 could directly bind to the promoter region of Hes1 and mediate H3K27me3 modification, while transfection of Meg3 and Ezh2 led to reduced Ezh2 and H3K27 binding ability. ConclusionThese results indicated that lncRNA Meg3 could bind PRC2 complex in Min6 cells, and Ezh2 could regulate the expression of downstream transcription factor gene Hes1 directly. The discovery would further enrich and improve the gene regulatory network of pancreatic β cells on Meg3 and PRC2 complexes.

Key words:lncRNA；pancreatic β cells；Meg3； PRC2；Hes1 expression

文章編號：1672-688X(2016)02-0081-04

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.001

中圖分類號：R587.1;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：安徽省2015年度高校自然科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.KJ2015A374)
安徽省2015年度高等教育振興計劃重大項(xiàng)目(No.2015zdjy175)

收稿日期：2016-03-03

作者簡介：胡艷妹(1979-)，女，安徽蚌埠人，講師，從事胰腺發(fā)育研究工作。