中心組合響應(yīng)面優(yōu)化里氏木霉B4菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基組成研究*

屈海峰，白殿國(guó)，于占春，岳 軍，王繼艷，寧艷春，李?lèi)?ài)力，徐友海，胡世洋

(1.中國(guó)石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；2.吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林 吉林 132101；3.欽州出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西 欽州 535000)

化石燃料燃燒所排放的大量二氧化碳，造成了嚴(yán)重的溫室效應(yīng)，同時(shí)機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣也是引起霧霾的原因之一。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年的農(nóng)作物秸稈量約達(dá)7億t，除少部分被利用外，大部分被焚燒，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。而將秸稈轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，替代部分汽油使用，可以減少二氧化碳的排放，同時(shí)也可解決因秸稈焚燒所造成的環(huán)境問(wèn)題[1-2]。

將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇，首先需要將大分子狀態(tài)的纖維素轉(zhuǎn)化為酵母可以利用的可發(fā)酵性糖。主要途徑有兩條：一是通過(guò)酸法水解木質(zhì)纖維素材料為可發(fā)酵性糖，另一條途徑是生物轉(zhuǎn)化法。由于酸法存在一系列的問(wèn)題，生物轉(zhuǎn)化法已成為主要的發(fā)展方向[3-4]。

里氏木霉是常用于發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的菌株，能夠分泌較多的胞外蛋白，酶系構(gòu)成中外切酶組分占到蛋白含量的60%～70%，且比較均衡[5-6]。但是受制于較低的酶活性，如何提高里氏木霉的產(chǎn)酶能力仍是研究的重點(diǎn)。一方面可對(duì)菌株進(jìn)行遺傳改造[7-8]，另一方面可通過(guò)發(fā)酵控制策略的研究，優(yōu)化發(fā)酵條件，充分發(fā)揮菌株的性能[9-10]。碳源、氮源是影響里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的兩個(gè)主要因素，很多文獻(xiàn)研究了碳、氮源種類(lèi)對(duì)于酶活的影響，但多使用昂貴的纖維素粉、乳糖、酵母粉、玉米漿、豆餅粉，這些物質(zhì)的使用增加了纖維素酶的生產(chǎn)成本[11-12]，因此有必要研究使用廉價(jià)的碳、氮源替代，從而降低成本。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

菌種為里氏木霉B4菌株：由本實(shí)驗(yàn)室保存，保存條件為4 ℃，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，保存過(guò)程中每月將菌株進(jìn)行重復(fù)培養(yǎng)。

葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、NaNO3，MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O：均為分析純，玉米芯粉、麥麩：市售。

電熱恒溫水浴鍋：HHS，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；振蕩培養(yǎng)箱：BS-1E，金壇市富華儀器有限公司；離心機(jī)：Anke TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；微孔板光譜儀：Spectra Max Plus 384，美國(guó) Molecular Device；超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

種子培養(yǎng)基(1 L)：20 g葡萄糖、3 g KH2PO4、5 g(NH4)2SO4、0.5 g MgSO4、3 g CaCO3、2 g NaNO3，上述物質(zhì)加水配制成1 L溶液，pH值自然，500 mL的三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均勻配制分裝后121 ℃滅菌30 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1 L)：培養(yǎng)基中含有不同含量的玉米芯粉、麥麩、(NH4)2SO4，其余與種子培養(yǎng)基相同，500 mL的三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均勻配制分裝后121 ℃滅菌30 min。

微量元素濃縮液(1 L)：250 mg MnSO4·H2O、360 mg ZnSO4·7H2O、370 mg CoCl2·6H2O、750 mg FeSO4·7H2O，上述物質(zhì)加水配制成1 L溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子制備

加入孢子懸液1 mL(孢子數(shù)量控制在106～108/mL)到滅菌后的種子培養(yǎng)基中，接種后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃，180 r/min下培養(yǎng)40 h，作為一級(jí)種子備用。

1.2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)

吸取10 mL種子液在無(wú)菌操作條件下，加入到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于28 ℃，180 r/min下培養(yǎng)96 h，培養(yǎng)過(guò)程中，每24 h取樣并測(cè)定濾紙酶活。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Minitab 15進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Statistica 6.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面的分析。

1.2.4 濾紙酶活測(cè)定

濾紙酶活(FPase)的測(cè)定：將Waterman 1號(hào)濾紙裁剪成1 cm×6 cm大小的長(zhǎng)條形狀，質(zhì)量為49.5～50.5 mg，折疊成M狀放入25 mL比色管底部，加入 pH=4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 mL，然后加入0.5 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液并混勻，對(duì)照為煮沸10 min滅活的相同稀釋倍數(shù)的粗酶液。于50 ℃水浴水解60 min，然后用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定生成的還原糖(以葡萄糖計(jì))。FPase酶活力的定義是以上述條件下每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(IU)。

2 結(jié)果與討論

2.1 三因素中心組合優(yōu)化

碳源、氮源是影響里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的主要因素[13-14]，其中硫酸銨與豆餅粉是纖維素酶發(fā)酵過(guò)程中常用的兩種氮源，兩種氮源中硫酸銨為生理酸性鹽，而豆餅粉被利用后，發(fā)酵液pH值呈堿性，里氏木霉的最適生長(zhǎng)pH值在4～5，pH值過(guò)高會(huì)造成菌絲生長(zhǎng)裂解，產(chǎn)酶量下降。相關(guān)研究表明在里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的過(guò)程中，相比于有機(jī)氮源[15]，無(wú)機(jī)氮源硫酸銨已經(jīng)足夠菌絲的生長(zhǎng)及酶的分泌，并且采用廉價(jià)易得的麥麩及玉米芯代替價(jià)格較高的纖維素粉為碳源，可以降低成本。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以麥麩、玉米芯、硫酸銨為主要因素，以濾紙酶活為響應(yīng)值進(jìn)行了三因素五水平的優(yōu)化，并使用Statistic 6.0與Minitab 15軟件進(jìn)行響應(yīng)面及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，因子及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表2。

表1 三因素中心組合水平表

表2 中心組合因子水平設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比表

續(xù)表

響應(yīng)面法可以直觀看出因素對(duì)于響應(yīng)值的影響，并且可以得出進(jìn)一步的優(yōu)化方向或是最佳工藝條件，為了對(duì)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，利用Statistic 6.0軟件分析了中心組合三個(gè)因素：ρ(麥麩)、ρ(玉米芯)和ρ(硫酸銨)對(duì)響應(yīng)值濾紙酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。通過(guò)對(duì)響應(yīng)曲面和等高線圖的分析可以看出ρ(麥麩)、ρ(玉米芯)和ρ(硫酸銨)這三個(gè)因素對(duì)于濾紙酶活的影響趨勢(shì)。

圖1 中心組合響應(yīng)面圖(硫酸銨與玉米芯交互作用)

圖2 中心組合響應(yīng)面圖(麥麩與玉米芯交互作用)

圖3 中心組合響應(yīng)面圖(麥麩與硫酸銨交互作用)

由圖1可知，當(dāng)ρ(硫酸銨)由低水平增加到高水平時(shí)酶活有增加的趨勢(shì)，固定硫酸銨用量，ρ(玉米芯)無(wú)論在低水平與高水平時(shí)都不利于產(chǎn)酶，較高的產(chǎn)酶區(qū)間是ρ(玉米芯)=40～60 g/L。

由圖2可知，ρ(玉米芯)在高水平和低水平時(shí)，酶活都處在較低值，從三維曲面圖中可以得出，當(dāng)ρ(玉米芯)=50 g/L時(shí)，響應(yīng)曲面的顏色最深，表示酶活處于最高值，因此為取得較高的酶產(chǎn)量，ρ(玉米芯)=50 g/L為宜；固定ρ(玉米芯)，ρ(麥麩)由低水平增加到高水平時(shí)酶活逐漸降低，因此為提高酶的產(chǎn)量應(yīng)減少麥麩的用量。

由圖3可知，當(dāng)ρ(麥麩)處于高水平而ρ(硫酸銨)處于低水平時(shí)酶活處于較高值，ρ(麥麩)處于高水平增加硫酸銨的用量會(huì)降低濾紙酶活；ρ(麥麩)與ρ(硫酸銨)同時(shí)處于低水平時(shí)酶活也處于較低值；當(dāng)ρ(麥麩)處于低水平而ρ(硫酸銨)處于高水平時(shí)，酶活趨于增加的趨勢(shì)。因此為增加濾紙酶活應(yīng)增加硫酸銨的用量而相應(yīng)的降低麥麩的用量。ρ(玉米芯)、ρ(硫酸銨)和ρ(麥麩)三個(gè)因素中，ρ(麥麩)對(duì)產(chǎn)酶的影響最小，應(yīng)降低麥麩的用量。

利用Minitab軟件對(duì)于ρ(玉米芯)、ρ(硫酸銨)和ρ(麥麩)三因素中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 中心組合優(yōu)化以濾紙酶活為響應(yīng)值的結(jié)果分析

表4 以濾紙酶活為響應(yīng)值的擬合模型統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.2 兩因素中心組合優(yōu)化

在三因素的中心組合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)麥麩的加入量在低水平時(shí)對(duì)產(chǎn)酶更加有利，因此培養(yǎng)基中不添加麥麩，只對(duì)ρ(玉米芯)與ρ(硫酸銨)進(jìn)行兩因素五水平的全因子優(yōu)化，利用Minitab軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各水平實(shí)驗(yàn)值見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型的預(yù)測(cè)值見(jiàn)表6。

表5 二因素中心組合水平表

表6 二因素全因子水平設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比表

利用Statistic 6.0軟件對(duì)ρ(玉米芯)、ρ(硫酸銨)以及濾紙酶活為響應(yīng)值時(shí)進(jìn)行了響應(yīng)面分析(見(jiàn)圖4)。通過(guò)對(duì)響應(yīng)曲面和等高線圖的分析可以看出，當(dāng)ρ(玉米芯)<55 g/L時(shí)，無(wú)論硫酸銨在低水平與高水平時(shí)酶活都處于較低值，只有ρ(玉米芯)>55 g/L時(shí)，濾紙酶活才逐漸增加。較適宜的ρ(硫酸銨)=12 g/L，繼續(xù)增加硫酸銨的用量導(dǎo)致酶活下降。

圖4 二因素全因子響應(yīng)面(玉米芯與硫酸銨交互作用)

表7 中心組合優(yōu)化以濾紙酶活為響應(yīng)值的結(jié)果分析

表8 以濾紙酶活為響應(yīng)值的擬合模型統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 論

采用廉價(jià)易得的碳源玉米芯、氮源硫酸銨，經(jīng)過(guò)三因素五水平及兩因素五水平兩輪實(shí)驗(yàn)，里氏木霉產(chǎn)酶培養(yǎng)條件得到了優(yōu)化。僅采用硫酸銨做為氮源也可以滿足菌體的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶需求，模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)組成為ρ(玉米芯)=75 g/L、ρ(硫酸銨)=12 g/L，此條件下濾紙酶活為3.12 FPU/mL,較優(yōu)化前提高58.38%，回歸模型的p<0.05，模型顯著，可以用于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)。

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