GSK3β、CXCR4、MMP-2與胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系

許 瑩，潘振國(guó)，李倩君，潘 峰，吳 健

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院1.消化內(nèi)科; 2.病理科， 江蘇 淮安 223300

GSK3β、CXCR4、MMP-2與胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系

許 瑩1，潘振國(guó)1，李倩君1，潘 峰1，吳 健2

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院1.消化內(nèi)科; 2.病理科， 江蘇 淮安 223300

目的 研究GSK3β、CXCR4、MMP-2在人胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，探索三者與胰腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲的關(guān)系。方法 采用免疫組化法檢測(cè)人胰腺癌及癌旁組織標(biāo)本中GSK3β、CXCR4、MMP-2的表達(dá)，采用Real-time PCR檢測(cè)胰腺癌癌組織及癌旁組織中GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 GSK3β、CXCR4、MMP-2在胰腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)均明顯高于癌旁組織(P<0.05)，胰腺癌患者癌組織中GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表達(dá)均明顯高于癌旁組織(P<0.05)。并且三者在癌組織陽(yáng)性表達(dá)均與患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 GSK3β、CXCR4、MMP-2三者在胰腺癌組織中高表達(dá)，且都和胰腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

胰腺癌；GSK3β；CXCR4；MMP-2

胰腺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，起病隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后極差[1-2]，未經(jīng)治療者1年生存率約20%，5年生存率不到4%。在我國(guó)，胰腺癌發(fā)病率呈逐步上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重危害我國(guó)人口健康的惡性腫瘤。腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移是多基因引起的，因此深入研究和胰腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)的相關(guān)指標(biāo)，可以為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。相關(guān)研究表明GSK3β、CXCR4、MMP-2與細(xì)胞增殖有關(guān)[3]，且在多種腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，目前未有關(guān)于GSK3β、CXCR4、MMP-2三者在胰腺癌中的研究，因此我們推測(cè)三者在胰腺癌中可能高表達(dá)，可能與胰腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院2011年-2014年手術(shù)切除并確診為胰腺癌的77例標(biāo)本，其中男51例，女26例，年齡41歲～75歲，平均年齡(58±5)歲，胰腺癌的臨床分期按2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期法進(jìn)行[4]，對(duì)照組為上述77例標(biāo)本中15例癌組織邊界≥1 cm的癌旁組織。

1.2 主要試劑 GSK3β鼠抗人單克隆抗體及MMP-2 兔抗人單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)。兔抗人CXCR4 多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司、DAB 顯色試劑盒及 SP 免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司)。Trizol﹑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒﹑RNasin﹑SYBR Green(購(gòu)自Invitrogen公司)，內(nèi)參β-actin和目的基因引物由Invitrogen公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 免疫組化步驟：(1)組織標(biāo)本常規(guī)脫蠟脫水。(2)阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%過(guò)氧化氫孵育，PBS沖洗3次，5 min/次。(3)抗原修復(fù)，放入枸櫞酸緩沖液(pH<6.0)中煮沸(95 ℃)15～20 min，自然冷卻，PBS沖洗3次，5 min/次。(4)5% 正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉，室溫孵育 10 min后滴加 一抗，4 ℃ 過(guò)夜。(5)PBS沖洗3次，每次5 min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照)，滴加生物素標(biāo)記二抗孵育，PBS沖洗沖洗3次，每次5 min。(6)滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液孵育，PBS沖洗沖洗3次，每次5min。(7)DAB染色，自來(lái)水沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

Real-time PCR步驟：(1)GSK3β、CXCR4、MMP-2的陽(yáng)性標(biāo)本為手術(shù)切除的胰腺癌組織，對(duì)照組為癌組織邊界1 cm以上切除的癌旁組織。(2)Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，在-80 ℃冰箱中取出癌組織及癌旁組織標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本加入Trizol后勻漿器勻漿后放入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的EP管中，并標(biāo)記好。(3)充分混勻后，每個(gè)EP管中加入氯仿后12 000 r/min,離心15 min。(4)小心的取出(3)中離心后的上層水相，放入新編號(hào)的EP管中，(不要全部將上層水相取出，寧少勿多)。(5)加入異丙醇至(4)中的EP管中，輕輕混勻，在-20 ℃冰箱中放置1 h。(6)離心10 min后，棄去上清液，緩慢地沿EP管壁加入預(yù)冷的75%乙醇，7 500 r/min,離心10 min，棄去上清，EP管倒置放干燥,然后用無(wú)菌ddH2O溶解。(7)逆轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR 反應(yīng)檢測(cè)NS和18 sRNA的表達(dá)，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄完畢后上機(jī)進(jìn)行目的基因和內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4 結(jié)果判定[5]根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)分并做半定量分析，著色強(qiáng)度積分：所計(jì)數(shù)細(xì)胞無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，然后將10個(gè)視野的積分之和除以10，結(jié)果以四舍五入取整數(shù)作為細(xì)胞染色強(qiáng)度積分，然后再對(duì)每張切片的染色細(xì)胞數(shù)進(jìn)行積分，每個(gè)視野按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分，兩項(xiàng)評(píng)分相加，以0～1分作為切片陰性(-)，≥2分為陽(yáng)性(+)，3～4分為中等陽(yáng)性(++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以χ2檢驗(yàn)進(jìn)行定性資料的分析，以t檢驗(yàn)進(jìn)行配對(duì)資料的分析，相關(guān)性分析采用 Spearman, srhotest 進(jìn)行分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表達(dá) 胰腺癌患者癌組織GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 癌組織及癌旁組織GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA表達(dá)圖

Fig 1 Expression of GSK3β、CXCR4、MMP-2 mRNA in pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue

2.2 GSK3β、CXCR4、MMP-2與胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系 GSK3β在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒(見(jiàn)圖2)，CXCR4的陽(yáng)性細(xì)胞為包漿或包膜著色，染色為棕黃色，在胰腺導(dǎo)管及腺泡中均有表達(dá)，在間質(zhì)組織中無(wú)表達(dá)(見(jiàn)圖3)；MMP-2主要在胞漿中表達(dá)。GSK3β、CXCR4、MMP-2在胰腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0. 05，見(jiàn)表1)。GSK3β、CXCR4、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)在胰腺癌患者、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表 1)，而在性別及年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05，見(jiàn)表1)。

圖2 GSK3β的表達(dá)情況(SP 100×); 圖3 CXCR4的表達(dá)情況(SP 100×); 圖4 MMP-2的表達(dá)情況(SP 100 ×) A:胰腺癌組織；B：癌旁組織

Fig 2 The expression of GSK3β(SP 100×); Fig 3 The expression of CXCR4(SP 100×); Fig 4 The expression of MMP-2(SP 100×) A: pancreatic cancer, B: adjacent to cancer tissue

表1 胰腺癌患者GSK3β、CXCR4、MMP-2的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

Tab 1 Relationship between the expression of GSK3β，CXCR4，MMP-2 and clinical features in pancreatic cancer

GSK3β+++/++/+-P值CXCR4+++/++/+-P值MMP?2+++/++/+-P值是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有轉(zhuǎn)移428<0．05307<0．054014<0．05 無(wú)轉(zhuǎn)移141324161112性別 男2811>0．053210>0．053018>0．05 女38102213218年齡(歲) >503812>0．053014>0．053717>0．05 <50189249149組別 癌組織509<0．05379<0．05407<0．05 癌旁組織61217141119

2.3 采用 Spearman, srhotest方法檢測(cè)GSK3β、CXCR4、MMP-2三者之間的相關(guān)性分析 GSK3β陽(yáng)性表達(dá)與CXCR4 陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.140，P<0.05，見(jiàn)表2)，GSK3β陽(yáng)性表達(dá)與MMP-2陽(yáng)性表達(dá)正相關(guān)(r=0.144，P<0.05，見(jiàn)表3)，CXCR4陽(yáng)性表達(dá)與MMP-2陽(yáng)性表達(dá)正相關(guān)(r=0.156，P<0.05，見(jiàn)表4)。

表2 GSK3β表達(dá)與CXCR4表達(dá)的相關(guān)性

Tab 2 The correlation between expressions of GSK3β and CXCR4

CXCR4+++/++/+CXCR4-r值P值GSK3β+++/++/+46100．429<0．05GSK3β-813

表3 GSK3β表達(dá)與MMP-2表達(dá)的相關(guān)性

Tab 3 The correlation between expressions of GSK3β and MMP-2

MMP?2+++/++/+MMP?2-r值P值GSK3β+++/++/+41150．249<0．05GSK3β-1011

表4 CXCR4表達(dá)與MMP-2表達(dá)的相關(guān)性

Tab 4 The expression correlation of CXCR4 and MMP-2

MMP?2+++/++/+MMP?2-r值P值CXCR4+++/++/+42120．374<0．05CXCR4-914

3 討論

胰腺癌是目前威脅人類健康的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，胰腺癌起病隱匿，早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，且病情發(fā)展較迅速，死亡率較高[1]，病死率已居于惡性腫瘤的第4位[2]，大多數(shù)患者確診胰腺癌已屬于晚期，及早的發(fā)現(xiàn)診治對(duì)胰腺癌患者尤為重要，但由于目前缺乏相對(duì)有效地治療方案[6]，積極的探尋胰腺癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制較重要。

GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的糖代謝、細(xì)胞增殖與凋亡[7-8]，通過(guò)抑制GSK3β的表達(dá)，細(xì)胞可以發(fā)生EMT[9-10]，而EMT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)GSK3β與腫瘤的侵襲及發(fā)展有一定的關(guān)系，本研究與發(fā)現(xiàn)胰腺癌癌組織GSK3β表達(dá)明顯高于癌旁組織，這與以往的研究相符合。趨化因子(chemokine)是一個(gè)細(xì)胞因子超家族，它在多種生理或病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種趨化因子和受體[11]，CXCR4 是其中一個(gè)受體，目前發(fā)現(xiàn)多種腫瘤如肝癌表達(dá)CXCR4，并且發(fā)現(xiàn)CXCR4的表達(dá)量與腫瘤患者的預(yù)后有明確的關(guān)系[11-13]，相關(guān)研究也表明趨化因子與其受體CXCR4的相互作用和腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)展有相關(guān)性[14-16]，MMP-2被認(rèn)為能夠溶解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。MMP-2它可以降解Ⅳ型膠原蛋白，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系[17-18]。

GSK3β、CXCR4、MMP-2三者已經(jīng)被證實(shí)與細(xì)胞的增殖有關(guān)，且在多種腫瘤組織內(nèi)表達(dá)[3]，但目前暫未有在胰腺癌患者組織標(biāo)本表達(dá)情況的相關(guān)研究，本研究顯示GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的表達(dá)均明顯高于癌旁組織，且三者的的陽(yáng)性表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)顯著性差異，但均與腫瘤患者是否淋巴轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性，認(rèn)為GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的含量高低與胰腺癌是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，這與以前其他腫瘤的相關(guān)研究[19]相吻合，進(jìn)一步我們采用Spearman方法進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，GSK3β、CXCR4、MMP-2三者之間均存在正相關(guān)，我們推測(cè)可能存在GSK3β、CXCR4、MMP-2三者的信號(hào)通路，進(jìn)而影響胰腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，我們下一步試驗(yàn)將就三者之間的信號(hào)通路方面進(jìn)行研究，以期胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供更多的理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：李健)

Relationship of invasion and metastasis of pancreatic cancer with GSK3β, CXCR4 and MMP-2

XU Ying1, PAN Zhenguo1, LI Qianjun1, PAN Feng1, WU Jian2

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, Huai’an First People’s Hospital, Nanjing Medical University, Huai’an 223300, China

Objective To investigate the expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue, and explore the relationship of GSK3β, CXCR4, MMP-2 with invasion and metastasis of pancreatic cancer.Methods The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue were detected by immunohistochemistry techonology. The mRNA expressions of the three genes of pancreatic cancer and adjacent to cancer tissue were detected by Real-time PCR.Results The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 in pancreatic cancer tissue were significantly higher than those in adjacent to cancer tissue both in gene and protein (P< 0.05), and they were significantly related with lymph node metastasis and clinical stage (P<0.05).Conclusion The expressions of GSK3β, CXCR4 and MMP-2 in pancreatic cancer tissue are high, and they have a relattionship with lymph node metastasis.

Pancreatic cancer; GSK3β; CXCR4; MMP-2

許瑩，主治醫(yī)師，碩士研究生，研究方向：胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。E-mail: xinying1318@163.com。

潘峰，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。E-mail: fengliupan@126.com。

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.027

R735.9

A

1006-5709(2016)11-1308-04

2016-01-18