過氧化物酶體增殖物活化受體-α啟動子區(qū)甲基化：誘導肝內(nèi)脂滴形成及加快非酒精性脂肪性肝病進程

屈 飛， 何 杰， 聶玉強， 李瑜元， 周永健

廣州醫(yī)科大學附屬市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 廣州消化疾病中心，廣東 廣州 510180

過氧化物酶體增殖物活化受體-α啟動子區(qū)甲基化：誘導肝內(nèi)脂滴形成及加快非酒精性脂肪性肝病進程

屈 飛， 何 杰， 聶玉強， 李瑜元， 周永健

廣州醫(yī)科大學附屬市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 廣州消化疾病中心，廣東 廣州 510180

目的 探討過氧化物酶體增殖物活化受體-α(PPAR-α)甲基化與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的相關(guān)性。方法 收集15例NAFLD患者肝臟組織及11例正常對照組肝臟組織，HE染色明確病理分型，RT-PCR、Western blotting分別檢測PPAR-α mRNA及蛋白的表達水平，選取其中的10對行焦磷酸測序檢測PPAR-α啟動子區(qū)甲基化水平。結(jié)果 與對照組比較，NAFLD組肝臟組織可見明顯脂肪沉積，PPAR-α mRNA及蛋白表達均降低(P<0.05)，PPAR-α啟動子區(qū)甲基化水平升高(P=0.025)，啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與PPAR-α蛋白表達量呈負相關(guān)(r=-0.878，P=0.009)。結(jié)論 正常人肝臟發(fā)生脂肪變時，不僅有肝細胞內(nèi)脂肪沉積，且伴有PPAR-α表達降低，降低原因之一是該基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化，從而加快NAFLD的進程。

非酒精性脂肪性肝?。籔PAR-α；DNA甲基化

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，被認為是代謝綜合征在肝臟的具體表現(xiàn)。隨著飲食習慣及生活方式的改變，該病的發(fā)病率明顯上升，中國香港、上海及廣州等發(fā)達地區(qū)成人NAFLD患病率高達15%[1-2]，在美國和西歐被認為是造成慢性肝臟疾病的最常見原因[3]?？蛇M一步發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化及肝癌[4]，造成嚴重的經(jīng)濟和社會負擔。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增值物活化受體(PPARs)參與調(diào)解糖脂代謝、能量合成、炎癥反應(yīng)等，與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。PPAR-α通過促進游離脂肪酸在線粒體的β氧化、減少肝臟脂肪沉積及炎癥因子的產(chǎn)生等作用降低NAFLD的發(fā)生[5]。國內(nèi)外學者對NAFLD 中PPAR-α基因表達量的變化存在一定的爭議[5-11]。

我們前期的實驗結(jié)果研究是以大鼠為研究對象[12]，目前尚缺乏對臨床NAFLD患者肝臟組織中PPAR-α基因甲基化研究報道。因此我們進行了這項研究，探討PPAR-α甲基化與臨床NAFLD患者發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 肝臟標本來源于廣州市第一人民醫(yī)院外科手術(shù)及肝穿患者，具有完整住院資料，并排除酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養(yǎng)、肝豆狀核變性等可導致脂肪肝的特定疾病及合并肝纖維化、肝硬化的病例[13]。本研究已由醫(yī)院倫理委員會審查并通過，患者及家屬均已知情同意。HE-染色確定病理分型，由廣州市第一人民醫(yī)院病理科協(xié)作完成，均由兩名病理科專科醫(yī)師閱片、審核。RNA提取試劑、DNA提取試劑盒購自大連寶生物有限公司，PPAR-α人抗兔抗體購自美國Abcom公司，氯仿、異丙醇等購自上海生工生物有限公司。

共收集符合標準病例26例，根據(jù)病理讀片分組，正常組11例，男7例，女4例；脂肪肝組15例，男6例，女9例。正常組平均年齡(57±19)歲，脂肪肝組平均年齡(52±19)歲。兩者比較，其性別及年齡構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 HE染色 新鮮肝臟組織制成石蠟塊，切片脫蠟等處理后行HE染色，具體步驟如下：蘇木素染液染10 min后用流水沖洗10 min；分化液分化15 s后流水沖洗約20 min；置于水溶性伊紅染液中10 min后流水沖洗10 min；脫水處理后中性樹膠進行封片；閱片，拍照儲存。

1.3 PPAR-α mRNA表達水平的檢測 取綠豆大小的肝臟組織，研缽碎后提取總RNA，取500 ng總RNA，采用10 μl的體系操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μl cDNA為模板，進行RT-PCR擴增。擴增條件為: 95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。采用非參秩和檢驗分析2-△△CT，統(tǒng)計目的基因的相對表達量。使用Oligo7軟件設(shè)計引物，序列見表1。

表1 目的基因及內(nèi)參引物信息

Tab 1 The primer information of target gene and inner reference

基因名稱引物名稱堿基序列(5′to3′)堿基數(shù)(bp)擴增長度(bp)PPAR?α上游引物AGTGACATTGCTAAAATACGGAGT24202PPAR?α下游引物GTCATCCAGTTCCAGTGCATT21β?actin上游引物CGAGAAGATGACCCAGATCATGT23194β?actin下游引物CCAGGTCCAGACGCAGGA18

1.4 Western blotting 檢測PPAR-α蛋白表達 (1) 將組織標本研碎后稱重，按0.1 g/ml比例加入蛋白裂解液冰浴0.5 h，離心取上清，并蛋白定量；(2) SDS-PAGE電泳，調(diào)節(jié)電壓為120 V，當染料電泳至距底部約1 cm時關(guān)閉電源；(3) 轉(zhuǎn)膜：恒流為350 mA，濕轉(zhuǎn)膜時間為1 h，四周冰塊降溫；(4) 封閉、孵育：一抗為人抗兔抗體，4 ℃搖床過夜，第2天室溫再孵育1 h，二抗為山羊抗兔抗體，4 ℃孵育1 h；(5) 曝光、顯影：曝光時間1～30 s，IPP 6.0軟件分析光密度值，以目的基因/GAPDH帶的密度比值表示目的基因蛋白表達水平。

1.5 亞硫酸氫鹽克隆測序法檢測PPAR-α基因甲基化 肝臟組織DNA的提取及甲基化修飾按照試劑盒說明進行。設(shè)計引物PCR儀擴增目的基因上游引物5′-AGTAGGGGCGGGTATGGTTTTTG-3′，下游引物5′-ACCTCCTCAATAAACCCAACTCTACTACTC-3′，目的片段大小133 bp。擴增條件為：94 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。最后進行克隆測序：PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒的連接，大腸桿菌感受態(tài)的制備，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，重組菌的鑒定及測序。采用Chromas 2分析軟件對DNA序列和測序序列進行比對。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理組織學特征 A為正常肝臟組織，可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無空泡樣變性及脂肪沉積。B為輕度脂肪變性，可見肝內(nèi)少量脂滴貯積(<30%)。C為重度脂肪變性：可見肝內(nèi)大量脂滴貯積)(>60%)。見圖1。

圖1 肝臟病理組織學特征( HE 200×) A：正常肝臟組織；B：輕度脂肪變性；C：重度脂肪變性

2.2 人體肝臟組織PPAR-α mRNA表達 正常組PPAR-α mRNA相對表達量為2.242±0.749，脂肪肝組 PPAR-α mRNA相對表達量為1.630±0.499，脂肪肝組PPAR-α mRNA的表達量與正常組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。脂肪肝組：(0.68～2.48,M50：1.63)；正常組：(1.46～3.69,M50：1.99，見圖2)。

圖2 人體肝臟組織PPAR-α mRNA表達

2.3 人體肝臟組織PPAR-α蛋白表達 灰度值掃描后統(tǒng)計分析說明正常組PPAR-α蛋白表達量為0.248±0.039，脂肪肝組PPAR-α蛋白表達量為0.102±0.018，脂肪肝組的PPAR-α蛋白表達較正常組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 人體肝臟組織PPAR-α蛋白表達

Fig 3 The expression of PPAR-α protein in human liver tissue

2.4 人體肝臟組織PPAR-α啟動子區(qū)甲基化程度 脂肪肝組甲基化率(80%)較正常組甲基化率(20%)而言，PPAR-α啟動子區(qū)甲基化程度明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體甲基化測序堿基序列圖及峰值圖如圖4所示。

圖4 亞硫酸氫鹽修飾后測序所得堿基序列圖及峰值曲線圖

2.5 PPAR-α啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與蛋白表達量的相關(guān)性分析 用Person直線相關(guān)分析得出：PPAR-α啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與PPAR-α蛋白表達量呈負相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義(r=-0.878，P=0.009。)

3 討論

NAFLD 發(fā)病機制尚不明確，通常解釋為“二次打擊學說”。即初次打擊主要指胰島素抵抗導致的肝內(nèi)脂質(zhì)沉積；“二次打擊”主要指氧化應(yīng)激導致的脂質(zhì)過氧化損傷及其異常細胞因子的作用導致肝臟炎癥和纖維化[14]。然而新的研究發(fā)現(xiàn)非甘油三酯在肝臟的沉積，而是脂肪酸(fatty acids，F(xiàn)As) 及其代謝產(chǎn)物等可能對肝臟有毒性作用[15]。PPARs是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族成員之一。在肝臟及脂肪組織中高表達，可被脂肪酸、膽汁酸及低密度脂蛋白等配體激活，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)及糖代謝、抗炎和抗纖維化作用，尤其在FAs儲存及分解代謝中起到核心作用，與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能作為治療NAFLD有效靶點[16]。

相關(guān)研究在NAFLD小鼠模型[5,8,17]及NAFLD患者[6]肝臟組織中，及我們前期在NAFLD大鼠肝細胞模型[12]中發(fā)現(xiàn)，模型組PPAR-α表達量較正常對照組明顯降低。同時我們發(fā)現(xiàn)模型組PPAR-α基因啟動子區(qū)甲基化率明顯增加；給予姜黃素對模型組肝細胞去甲基化處理后，可降低PPAR-α啟動子區(qū)甲基化率，促進PPAR-α mRNA 表達，改善脂肪變性程度[12]。本實驗得出NAFLD組的PPAR-α基因表達較正常組比較明顯降低，基因甲基化率明顯高于正常組，啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與蛋白表達量呈負相關(guān)(見圖5)。

圖5 PPAR-α甲基化發(fā)生率與與蛋白表達的相關(guān)性

Fig 5 The correlation between the incidence of methylation and expression on PPAR-α protein

我們在體外、大鼠體內(nèi)、人體內(nèi)逐步驗證得出PPAR-α的表達量與該基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率呈負相關(guān)，甲基化程度越高，基因的表達越低。PPAR-α屬于人體肝臟的保護基因，說明表觀遺傳學尤其是DNA甲基化對NAFLD的發(fā)生、發(fā)展有一定的促進作用。PPAR-α表達增加可增加FAs的β 氧化，增加脂肪代謝，減少脂肪合成及降低炎癥細胞因子的活性，在一定程度上可促使NASH向NAFLD轉(zhuǎn)變，從而改善患者預(yù)后[6]。DNA甲基化最大意義在于它具有可逆性，從DNA甲基化的水平上來闡釋與NAFLD發(fā)病相關(guān)的脂肪細胞分化、脂肪代謝、胰島素抵抗等基因表達的調(diào)控，可能成為早期診斷及靶向治療的前提條件，為新藥研制及二次開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為NAFLD 在臨床上治療提供有力佐證。本文首次在人體內(nèi)闡述PPAR-α基因甲基化與其表達水平的相關(guān)性及其在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用，具有一定的獨創(chuàng)性。缺點在于標本病例數(shù)相對較少，可適當增加樣品量，以便更有說服力。

綜上所述，PPAR-α基因?qū)Ω闻K具有一定的保護作用，可減輕脂肪沉積及炎癥細胞因子的活性，NAFLD發(fā)生時PPAR-α表達量降低，降低可能原因之一是基因啟動子發(fā)生甲基化。臨床應(yīng)用去甲基化藥物來治療NAFLD存在一定的理論基礎(chǔ)，具體尚待進一步研究。

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(責任編輯：王全楚)

The methylation of Peroxisome proliferator-activated receptor-α promoter: induce intrahepatic fat deposition and promote the progress of nonalcoholic fatty liver disease

QU Fei, HE Jie, NIE Yuqiang, LI Yuyuan, ZHOU Yongjian

Department of Gastroenterology, Guangzhou Medical University Affiliated Hospital-Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, China

Objective To study the relationship between the methylation of Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha (PPAR-α) promoter and non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD). Methods Fifteen patients with NAFLD and 11 healthy individuals as controls were enrolled. Hematoxylin-eosin staining was applied to definite pathological classification. RT-PCR and Western blotting were used to assess the mRNA and protein expressions of PPAR-α. Bisulfite cloning sequencing method (BSP) was used to assess the degree of methylation in 10 pairs of them. Results There were visible fat deposits in liver tissue of NAFLD group. Compared with normal group, the expressions of PPAR-α mRNA and protein were decreased in NAFLD group (P<0.05); while the degree of methylation in PPAR-α promoter was increased (P=0.025).The protein expression was significantly (negatively) correlated with the degree of methylation in PPAR-α promoter (r=-0.878，P=0.009). Conclusion When normal livers turn to NAFLD, not only have intrahepatic fat deposition in the cells, but also accompanied by expression of PPAR-α decreased.The methylation of PPAR-α promoter may be one reason for the decreasing, which can promote the progress of NAFLD.

Non-alcoholic fatty liver disease; PPAR-α; DNA methylation

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.018

廣州市科信局科技惠民項目(2014Y2-00139)

屈飛，醫(yī)學碩士。E-mail：305805547@qq.com

周永健，醫(yī)學博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：非酒精性脂肪性肝病及消化系常見疾病的臨床研究。E-mail：yjzhou@gzhmu.edu.cn

R575.5

A

1006-5709(2016)11-1279-04

2016-03-20