肝素結(jié)合表皮生長因子對(duì)部分肝移植大鼠肝細(xì)胞CyclinD1表達(dá)的影響

周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴(yán)輝弟，林培藝

廈門市第二醫(yī)院肝膽外科，福建 廈門 361021

肝素結(jié)合表皮生長因子對(duì)部分肝移植大鼠肝細(xì)胞CyclinD1表達(dá)的影響

周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴(yán)輝弟，林培藝

廈門市第二醫(yī)院肝膽外科，福建 廈門 361021

目的 觀察肝素結(jié)合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth falrtor like growth factor, HB-EGF)對(duì)部分肝移植大鼠肝細(xì)胞CyclinD1表達(dá)的影響，并探討其促進(jìn)肝再生的機(jī)制。方法 首先采用改良的“兩袖套”法構(gòu)建大鼠部分(60%)肝移植模型，共75只，受體隨機(jī)平均分為A、B、C三組。其中，A組經(jīng)皮下注射生理鹽水(100 mg/kg)，B組皮下注射HGF(100 mg/kg)，C組為皮下注射HB-EGF(100 mg/kg)，1次/d。手術(shù)后第1天 、第2天 、第3天 、第5天和第7天各處死5只受體大鼠，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting 檢測肝組織中CyclinD1 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果 RT-PCR 檢測結(jié)果表明，C組術(shù)后第1天CyclinD1 mRNA表達(dá)就達(dá)到高峰，且顯著高于A、B組(P<0.05)，之后1周逐漸降低；Western blotting 檢測結(jié)果表明，三組CyclinD1 蛋白表達(dá)水平均有上升，但C組術(shù)后第1天即達(dá)到高峰，且顯著高于A、B組(P<0.05)。結(jié)論 HE-EGF可能通過上調(diào)肝移植后肝細(xì)胞 CyclinD1 的表達(dá)來促進(jìn)肝再生。

肝素結(jié)合表皮生長因子；部分肝移植；肝再生；CyclinD1

肝素結(jié)合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor like growth factor, HB-EGF)是一種新的生長因子，屬于完全促有絲分裂原，由Besner等[1-2]在1990年首次在人巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到。研究表明，HB-EGF對(duì)大鼠部分肝移植后的肝再生有明顯的促進(jìn)作用，且其促進(jìn)作用優(yōu)先于肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)。但其具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)外源性HB-EGF和HGF注入部分肝移植大鼠模型，應(yīng)用RT-PCR及Western blotting方法檢測實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞周期因子CyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)HB-EGF對(duì)肝移植后肝細(xì)胞再生影響的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 肝素結(jié)合表皮生長因子(ProSpec，艾美捷科技有限公司)，肝細(xì)胞生長因子(sciencecell，美國)，總RNA提取試劑(Sigma-Aldrich， 德國)，低溶點(diǎn)瓊脂糖 (Amresco，美國)，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(50 bp Ladder)(Amresco，美國)，引物合成與探針修飾(金斯瑞生物科技有限公司)，兔抗人CyclinD1多克隆抗體(上海篤瑪生物科技有限公司)，PCR 擴(kuò)增儀(德國Bio-Bid公司) ，自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀(美國Molecular Devices公司) 。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康、雄性Wistar大鼠，鼠齡體質(zhì)量200～220 g，購自廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。且供、受體體質(zhì)量差距控制在10 g以內(nèi)。以改良的“兩袖套”法建立大鼠部分(60%)肝移植模型，受體隨機(jī)分為三組：A組：術(shù)后皮下注射生理鹽水(100 mg/kg，1次/d)；B組：術(shù)后皮下注射HGF(100 mg/kg，1次/d)；C組：術(shù)后皮下注射HB-EGF(100 mg/kg，1次/d)。分別于術(shù)后第1、2、3、5、7天各組處死5只受體大鼠。

1.3 半定量RT-PCR檢測CyclinD1 mRNA的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，具體方法采用TRIzol一步提取, 保存于-70 ℃超低溫冰箱中。然后由AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后，取10 μl的產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，并使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，與內(nèi)參GAPDH灰度比值表示。

根據(jù)NCBI Genebank中大鼠HO-1基因序列，引物及探針的設(shè)計(jì)如下：RCYCLIND1F-2 5′-ACAACTCTATCCGCCCCGA-3′，RCYCLIND1R：5′-GAGGGTGGGTTGGAAATGA-3′ 217 bp; R-GAPDHF:5′-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3′，R-GAPDHR:5′-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3′, 141 bp。

1.4 Western blotting檢測CyclinD1蛋白的表達(dá) 首先組織塊稱重并粉碎，配置蛋白裂解液，然后裂解組織樣本，加入適當(dāng)?shù)木彌_液，隨后采用 BCA 蛋白測定試劑盒內(nèi)蛋白的濃度。然后10% SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，放置冰浴轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min，之后微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，室溫?fù)u動(dòng)溫育2 h 進(jìn)行封閉，封閉后的濾膜再分別與 CyclinD1 (稀釋比為 1∶200) 4 ℃ 溫育過夜。選擇IgG作為二抗(稀釋比為 1∶5 000)，洗膜后使用 beyoECL 發(fā)光法顯色，自動(dòng)洗片機(jī)洗片，內(nèi)參采用 GAPDH掃描 X 光片，最后計(jì)算灰度值。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后各組肝組織中CyclinD1mRNA的表達(dá)C組在術(shù)后第1天CyclinD1mRNA的表達(dá)明顯高于A組和B組(P<0.05)，之后逐漸降低；B組則在術(shù)后的第2天到達(dá)高峰，且明顯高于另外兩組(P<0.05)。術(shù)后第3天A組即達(dá)高峰，且明顯高于其他兩組(P<0.05)，而在其他各時(shí)間點(diǎn)，A組的表達(dá)相對(duì)減少，并低于B組和C組(P<0.05，見表1、圖1～2)。

表1 肝組織中CyclinD1 mRNA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況(ΔCt)

Tab 1 The expression of CyclinD1 mRNA in every time point(ΔCt)

組別只數(shù)術(shù)后天數(shù)(d)12357A組255．1±0．327．1±0．478．5±0．523．7±0．221．4±0．08B組258．1±0．39?8．7±0．48?5．8±0．53?4．8±0．19?2．2±0．06?C組258．9±0．49?▲7．9±0．51?▲6．0±0．49?5．1±0．11?2．3±0．07?

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，▲P<0.05。

圖1 GAPDH產(chǎn)物電泳圖; 圖2 CyclinD1的表達(dá)

Fig 1 The electrophoresis diagram of GAPDH； Fig 2 The expression of CyclinD1

2.2 術(shù)后各組肝組織中CyclinD1蛋白的表達(dá) CyclinD1 蛋白表達(dá)水平在三組中的所有時(shí)間點(diǎn)均有升高，但C組術(shù)后第1天表達(dá)就達(dá)到高峰，且顯著高于另外兩組(P<0.05，見表 2、圖 3)。

組別例數(shù)術(shù)后天數(shù)(d)12357A組50．162±0．0450．287±0．0360．396±0．0950．492±0．0640．653±0．016B組50．151±0．0450．248±0．0180．336±0．0450．411±0．0240．582±0．089C組50．332±0．069?▲0．343±0．0260．331±0．0750．343±0．0510．398±0．076

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，▲P<0.05。

圖3 Western blotting 檢測CyclinD1蛋白表達(dá)

Fig 3 The expression of CyclinD1 protein determined by Western blotting

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，注入HB-EGF的部分肝移植小鼠，CyclinD1在 mRNA 和蛋白水平表達(dá)均有上調(diào)，與對(duì)照組比較差異顯著，與文獻(xiàn)報(bào)道[3]一致。表明CyclinD1 蛋白表達(dá)的上調(diào)，參與了HB-EGF促進(jìn)肝移植后肝細(xì)胞再生的過程。

目前研究[4]表明，肝細(xì)胞能否順利通過細(xì)胞周期增殖階段( G1～S期) ，CyclinD1 起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，并且作為肝細(xì)胞有絲分裂時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞周期( G1期) 的標(biāo)識(shí)因子。CyclinD1 Pcdk4復(fù)合物，能夠磷酸化諸多抑制蛋白，比如Rb 和p130 等，以及對(duì)于E2F 活化釋放，起到誘導(dǎo)作用；而E2F對(duì)肝細(xì)胞通過G1的控制點(diǎn)起到主要推動(dòng)作用，并最終進(jìn)行有絲分裂。肝細(xì)胞通過G1后，依賴CyclinD1的調(diào)控作用，細(xì)胞周期循環(huán)將周而復(fù)始地進(jìn)行。眾多研究[5]發(fā)現(xiàn)CyclinD1對(duì)于許多有絲分裂原而言，是主要的關(guān)鍵作用點(diǎn)，如生長因子HGF在活化ERK1/2后，通過激活A(yù)P21和NF2κB，從而上調(diào)CyclinD1表達(dá)[6]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

據(jù)報(bào)道,大鼠部分肝切除術(shù)后，CyclinD1 mRNA即開始大量表達(dá)，并在術(shù)后12 h達(dá)到高峰，且其蛋白表達(dá)也隨之增多，并于第1天表達(dá)到達(dá)峰值。Mathur等[7]研究證實(shí)HB-EGF通過Ras/Raf的途徑級(jí)聯(lián)激活MAPK激酶，而MAPK最終能夠誘導(dǎo)CyclinD1的表達(dá)和活性，支持我們的結(jié)果。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝大部切除后，其再生肝臟組織中HB-EGF、HGF和TGF-α 均有表達(dá)，但HB-EGF早于HGF和TGF-α[7-8]，這也與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

我們認(rèn)為HG-EGF促進(jìn)肝移植后肝細(xì)胞再生的機(jī)制可能是誘導(dǎo)Ra的高表達(dá)，Ras被激活后，再級(jí)聯(lián)放大激活MAPK。隨后被激活的MAPK轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，直接激活轉(zhuǎn)錄因子。另外，MAPK還可以刺激Fos和Jun 等因子形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，并結(jié)合myc基因旁的特異的DNA序列，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄myc基因產(chǎn)物，該轉(zhuǎn)錄因子能激活其他基因。最后，這些信號(hào)共同誘導(dǎo)CyclinD1的表達(dá)，并對(duì)肝細(xì)胞再生產(chǎn)生促進(jìn)作用。另外，大鼠部分肝移植后由于凝血紊亂、機(jī)體應(yīng)激等諸多因素的影響，使得很多促肝生長的細(xì)胞因子減少甚至消失，導(dǎo)致CyclinD1的表達(dá)降低，肝再生延遲，也間接地證明了我們的觀點(diǎn)。

[1]Besner G, Higashiyama S, Klagsbrun M. Isolation and characterization of a macrophage-derived heparin-binding growth factor [J]. Cell Regul, 1990, 1(11): 811-819.

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Effects of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor on CyclinD1 of hepatic cell after partial transplantation in rats

ZHOU Lixin, SU Jiqin, WANG Maolin, YAN Huidi, LIN Peiyi

Department of Hepatobiliary Surgery, the NO.2 Hospital of Xiamen, Xiamen 361021, China

Objective To observe effect of using heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) on the expression of CyclinD1 of hepatic cell after partial transplantation in rats so as to explore its mechanism．Methods The Two-cuff technique was adopted firstly to construct liver transplantation model of rat part (60%), totally 75 rats. The receptors were divided averagely and randomly into 3 groups: group A, B and C. Then 100 mg/kg the 0.9% NaCl (group A), 100 mg/kg HGF (group B) and 100 mg/kg HB-EGF (group C) were administered, respectively. All groups were done once a day. Subsequently, 5 receptors rats died for each group on the 1st, 2nd, 3rd, 5th and 7th days after the operation. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting were used to detect expressions of CyclinD1 mRNA and protein in the hepatic tissue. Results The expression of CyclinD1 mRNA in liver tissue peaked in group C, was higher than other groups on the 1st day after operation. The expression of CyclinD1 protein was increased in 3 groups, but that in the group C was higher than that in other two groups on the 1st day．Conclusion HB-EGF can promote liver regeneration after partial liver transplantation in rats. The mechanism may be related with the increase of CyclinD1 mRNA and protein．

Heparin binding epidermal growth factor like growth factor; Partial liver transplantation; Regeneration; CyclinD1

廈門市科技計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(3502Z20139012)

周立新，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：肝膽外科臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：zhoulix318@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.015

R575

A

1006-5709(2016)11-1267-03

2016-05-10