Wdr5通過(guò)Wnt通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

王曉鋒，王玉平，魏文珍，胡曉丹，李瑞英，周永寧

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 1.消化科；2.甘肅省胃腸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.感染科，甘肅 蘭州 730000

Wdr5通過(guò)Wnt通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

王曉鋒1,2,3，王玉平1,2，魏文珍1,2，胡曉丹1,2，李瑞英1,2，周永寧1,2

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 1.消化科；2.甘肅省胃腸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.感染科，甘肅 蘭州 730000

目的 研究Wdr5對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。方法 構(gòu)建Wdr5的shRNA病毒感染肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2下調(diào)Wdr5的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT等方法檢測(cè)下調(diào)Wdr5表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 下調(diào)Wdr5后，肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2的克隆形成、細(xì)胞增殖能力顯著降低，Wnt通路關(guān)鍵基因APC和β-catenin顯著降低。結(jié)論 下調(diào)Wdr5能抑制肝癌細(xì)胞增殖，這一過(guò)程可能是通過(guò)Wnt通路進(jìn)行的。

Wdr5；肝癌；增殖；Wnt通路；APC；β-catenin

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是最常見(jiàn)的致死性惡性腫瘤之一[1-2]。我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率都顯著高于世界平均水平[3-4]。由于絕大多數(shù)的肝癌確診時(shí)已處于晚期，常規(guī)的手術(shù)以及介入、放化療等手段已經(jīng)難以奏效[5-6]。深入研究肝癌發(fā)生的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)制，將為肝癌的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的理論基礎(chǔ)[7-8]。Wdr5(WD repeat-containing protein 5) 是WD-40蛋白家族的成員之一，同時(shí)也是染色體H3修飾蛋白復(fù)合體Trithorax group(TrxG)的重要組分之一[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)Wdr5在胚胎干細(xì)胞的全能性維持、分化及腫瘤形成等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[11-16]。其異常激活并持續(xù)性活動(dòng)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[17-19]。然而關(guān)于Wdr5在肝癌細(xì)胞中的功能和具體機(jī)制的相關(guān)研究并未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)慢病毒系統(tǒng)干擾Wdr5在肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2中的表達(dá)，進(jìn)而研究Wdr5對(duì)肝癌細(xì)胞的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源與試劑 人肝癌細(xì)胞293T細(xì)胞、Huh7和HepG2(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))，MTT(美國(guó)Sigma公司)，細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM，美國(guó)Hyclone公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Hyclone公司)，特級(jí)胎牛血清(FBS，美國(guó)Hyclone公司)，PLVX-shRNA2(美國(guó)clontech公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%，美國(guó)Gibco公司)，Polybrene(美國(guó)Sigma公司)，100×雙抗(青霉素+鏈霉素，美國(guó)Gibco公司)，DNA轉(zhuǎn)染試劑FuGene HD(瑞士羅氏公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，Wdr5、Gapdh、APC、β-catenin抗體(英國(guó)abcam公司)，shRNA引物以及定量PCR引物合成(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%特級(jí)胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Wdr5 shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建、病毒包裝及感染： shRNA序列從Sigma-Aldrich公司的網(wǎng)站上獲得，具體序列見(jiàn)表1。在病毒包裝時(shí)，將上述質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒通過(guò)FuGene HD轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中，8 h之后換液，48 h之后收集第1批病毒樣本，72 h之后再收集第2批病毒樣本，用0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌。感染肝癌細(xì)胞系采用懸浮感染的方式。肝癌細(xì)胞消化計(jì)數(shù)之后，將2×105個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板中，每個(gè)孔中加入1 ml普通培養(yǎng)基和0.5 ml病毒液，每個(gè)孔再加入1.5 μl的polybrene(8 μg/ml polybrene)，12 h之后，將病毒液換成新鮮的培養(yǎng)基，并進(jìn)行傳代。每個(gè)感染的細(xì)胞都帶有綠色熒光標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞儀篩選出感染了病毒的細(xì)胞。

1.2.3 定量PCR： Trizol一步法提取總RNA。每個(gè)樣本加0.5 μg的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性：94 ℃ 4 min；循環(huán)：94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。定量PCR檢測(cè)采用automated Stratagene Mx3000 QPCR system，以Gapdh為內(nèi)參。采用2-△△CT方法進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blotting蛋白檢測(cè): 需要收集的細(xì)胞樣本用PBS洗1次，消化后計(jì)數(shù)，將相同數(shù)目的細(xì)胞收集到1.5 ml EP管中，采用1×SDS上樣緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，在95 ℃的金屬浴中熱變性5 min后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 shRNA和定量PCR引物序列

Tab 1 Primer sequences of shRNA and quantitative RCR

名稱序列(5′→3′)shWdr5APFgatccCCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGTTTTTgshWdr5APRaattcAAAAACCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGgshWdr5BPFgatccCCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGTTTTTgshWdr5BPRaattcAAAAACCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGgWdr5PFAATTCAGCCCGAATGGAGAGTWdr5PRAGGCTACATCGGATATTCCCAGAPCPFAAAATGTCCCTCCGTTCTTATGGAPCPRCTGAAGTTGAGCGTAATACCAGTβ?cateninPFCATCTACACAGTTTGATGCTGCTβ?cateninPRCATCTACACAGTTTGATGCTGCTGapdhPFGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGapdhPRGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn): 將細(xì)胞樣本用PBS洗1遍，消化之后進(jìn)行計(jì)數(shù)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)用6孔板進(jìn)行，每個(gè)樣本在每個(gè)孔中加500個(gè)細(xì)胞，3 d后換液，之后每隔2 d換液，10 d后進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入甲醇進(jìn)行固定20 min，之后去除固定液在室溫晾置10～15 min，待固定液干了之后，加入1%(w/v)結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，染色30 min，棄去染液，用5 ml/孔超純水洗滌3次，棄去洗滌液，室溫靜置5～10 min，待洗滌液風(fēng)干后，在光學(xué)顯微鏡下觀察克隆形態(tài)，然后用數(shù)碼相機(jī)拍照，記錄每孔形成克隆數(shù)目的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 4.0軟件處理，應(yīng)用Student’s t-test進(jìn)行檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wdr5-shRNA慢病毒感染肝癌細(xì)胞系鑒定 為了研究Wdr5在肝癌細(xì)胞系中的作用，我們構(gòu)建了兩個(gè)Wdr5的shRNA：shWdr5 A和shWdr5 B。在測(cè)序檢測(cè)結(jié)果顯示正確之后，將這兩個(gè)shRNA質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒共同包裝病毒，收集病毒后進(jìn)行肝癌細(xì)胞的感染。為了排除細(xì)胞系的影響，我們采用了兩個(gè)肝癌細(xì)胞系：Huh7和HepG2。感染2 d后發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞攜帶綠色熒光，提示感染成功，進(jìn)行2次傳代后進(jìn)行流式細(xì)胞儀篩選，重新鋪板之后進(jìn)行檢測(cè)，兩個(gè)細(xì)胞系的樣本中細(xì)胞攜帶有綠色熒光，表明感染病毒成功(見(jiàn)圖1)。

2.2 Wdr5-shRNA慢病毒干擾效果檢測(cè) 對(duì)Huh7中Wdr5的干擾效果進(jìn)行檢測(cè)，定量PCR結(jié)果顯示，Wdr5的表達(dá)水平降低，shWdr5 A和shWdr5 B都具有非常顯著的干擾效果(見(jiàn)圖2A)。又在蛋白水平檢測(cè)shWdr5 A和shWdr5 B的干擾效果，結(jié)果顯示，在蛋白水平，Wdr5的表達(dá)也被顯著抑制，這與mRNA表達(dá)的結(jié)果一致(見(jiàn)圖2C)。在HepG2細(xì)胞中也通過(guò)定量PCR和Western blotting檢測(cè)了Wdr5的表達(dá)效果，結(jié)果與Huh7的結(jié)果一致(見(jiàn)圖2B、2D)。

2.3 干擾Wdr5能抑制肝癌細(xì)胞系增殖 在成功構(gòu)建Wdr5干擾細(xì)胞系后，進(jìn)一步檢測(cè)Wdr5被干擾之后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，在Huh7細(xì)胞中，干擾Wdr5后，與對(duì)照組比較，干擾組細(xì)胞增殖能力明顯降低(見(jiàn)圖3A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，又在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示干擾組的細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組比較明顯降低，與Huh7的結(jié)果非常一致(見(jiàn)圖3B)。同時(shí)，也通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)肝癌細(xì)胞系的增殖能力進(jìn)行研究，與之前MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果也一致(見(jiàn)圖3C、3D)。

圖1 Wdr5-shRNA慢病毒能夠高效感染Huh7細(xì)胞系和HepG2細(xì)胞系(100×) A : Huh7細(xì)胞系；B: HepG2細(xì)胞系

Fig 1 Huh7 and HepG2 cells were infected by Wdr5-shRNA through lentiviral transfection(100×) A: Huh7 cells B: HepG2 cells

圖2Wdr5-shRNA慢病毒能夠在Huh7細(xì)胞系和HepG2細(xì)胞系中有效沉默Wdr5的表達(dá)A：qRT-PCR檢測(cè)Huh7細(xì)胞系中Wdr5的表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞系中Wdr5的表達(dá)；C：Westernblotting檢測(cè)Huh7細(xì)胞系中Wdr5的表達(dá)；D：Westernblotting檢測(cè)HepG2細(xì)胞系中Wdr5的表達(dá)

Fig2TheexpressionofWdr5inHuh7andHepG2cellsweresignificantlydownregulatedaftertansfectionA:theexpressionofWdr5wasdetectedbyqRT-PCRinHuh7;B:theexpressionofWdr5wasdetectedbyqRT-PCRinHepG2;C:theexpressionofWdr5wasdetectedbyWesternblottinginHuh7;D:theexpressionofWdr5wasdetectedbyWesternblottinginHepG2

圖3 沉默Wdr5能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖A：MTT法檢測(cè)Huh7細(xì)胞增殖；B：MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖；C：Huh7細(xì)胞系的細(xì)胞克隆形成；D：HepG2細(xì)胞系的細(xì)胞克隆形成

Fig3ThecolonyformationandcellproliferationwereallinhibitedafterWdr5knockdownA：theHuh7proliferationwasobservedbyMTT;B:theHepG2proliferationwasobservedbyMTT;C:theHuh7proliferationwasobservedbycolonyformationassays;D:theHepG2proliferationwasobservedbycolonyformationassays

2.4 干擾Wdr5能抑制Wnt通路 定量PCR結(jié)果顯示：在Huh7細(xì)胞中，Wdr5被干擾后，Wnt通路關(guān)鍵基因APC和β-catenin的表達(dá)被顯著下調(diào)(見(jiàn)圖4A、4B)。進(jìn)一步的Westernblotting結(jié)果顯示，在蛋白水平，這兩個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)也被抑制(見(jiàn)圖4C)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖4 沉默Wdr5基因能夠抑制Wnt通路的表達(dá) A：qRT-PCR檢測(cè)APC基因的表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)β-catenin基因的表達(dá)；C：Western blotting檢測(cè)APC基因和β-catenin基因的表達(dá)

Fig 4 The expression levels of APC and β-catenin were all down-regulated after Wdr5 knockdown A: the expression of APC was detected by qRT-PCR; B: the expression of β-catenin was detected by qRT-PCR; C: the expression of APC and β-catenin were detected by Western blotting

3 討論

目前，肝癌是國(guó)內(nèi)發(fā)病率和死亡率第2高的惡性腫瘤。深入研究肝癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，找出肝癌中的關(guān)鍵基因或者表面標(biāo)記基因，將為肝癌的臨床診斷、臨床治療和藥物開(kāi)發(fā)提供重要意義。在這一研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)影響肝癌細(xì)胞的重要基因：WD-40蛋白Wdr5。它對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有重要的作用，當(dāng)它被干擾時(shí)，肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2的表達(dá)都被顯著抑制，這一影響并沒(méi)有細(xì)胞系特異性，因此它可能對(duì)肝癌細(xì)胞具有較為普遍的作用。這一結(jié)果顯示，Wdr5表達(dá)量的高低可以反映肝癌細(xì)胞的增殖能力，當(dāng)肝癌細(xì)胞高表達(dá)Wdr5時(shí)，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。在臨床上，Wdr5可以作為反映肝癌增殖能力及惡性程度的一個(gè)潛在指標(biāo)。

Wdr5是染色體H3修飾蛋白復(fù)合體TrxG的重要組分之一，當(dāng)H3的第4位賴氨酸被TrxG催化三甲基化時(shí)，則能降低染色體的折疊，促進(jìn)染色體的開(kāi)放，進(jìn)而促進(jìn)所在基因的表達(dá)。因此高表達(dá)Wdr5能促進(jìn)基因的表達(dá)，而干擾Wdr5則能抑制基因的表達(dá)。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)Wdr5被干擾后能夠抑制Wnt通路重要蛋白APC和β-catenin的表達(dá)。Wdr5可能通過(guò)影響APC和β-catenin等基因的啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H3K4的甲基化修飾來(lái)調(diào)節(jié)這兩個(gè)基因的表達(dá)，當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的研究。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)Wdr5對(duì)肝癌細(xì)胞系的增殖具有重要調(diào)節(jié)作用，且這一作用的重要機(jī)制之一是它能夠影響Wnt通路中的關(guān)鍵基因APC和β-catenin的表達(dá)，這對(duì)肝癌增殖調(diào)節(jié)的研究和肝癌的診斷治療應(yīng)用具有重要的價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Wdr5 promoting cells proliferation in hepatocelluar carcinoma through Wnt signaling pathway

WANG Xiaofeng1,2,3, WANG Yuping1,2, WEI Wenzhen1,2, HU Xiaodan1,2, LI Ruiying1,2, ZHOU Yongning1,2

1.Department of Gastroenterology; 2.The Key Laboratory for Gastrointestinal Diseases of Gansu Province; 3.Department of Infectioous Diseases, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Objective To study the effect of Wdr5 on cells proliferation in hepatocellular carcinoma by constructing the Wdr5 knock-out cell models.Methods Two shRNAs targeting Wdr5 were generated: shWdr5 A and shWdr5 B, and then infected Huh7 and HepG2 cells by lentiviral transfection. The expression of Wdr5 was detected by qPCR and Western blotting. MTT and colony formation assays were used to observe the effect of Wdr5 on cell proliferation. The expressions of APC and β-catenin were also tested at mRNA and protein level after Wdr5 silencing. Results The expression of Wdr5 in Huh7 and HepG2 cells was significantly down regulated after tansfection. The colony formation and cell proliferation were all inhibited after Wdr5 knockdown. And the expressions of APC and β-catenin were all down-regulated after Wdr5 knockdown.Conclusion Down regulating the expression of Wdr5 could inhibit the cells proliferation of hepatocellular carcinoma, and this could be involved in the regulation of APC and β-catenin in Wnt pathway.

Wdr5; Hepatocelluar carcinoma; Proliferation; Wnt; APC; β-catenin

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.014

R735.7

A

1006-5709(2016)11-1262-05

2016-03-09