小干擾RNA沉默IKK/NF-κB信號通路對HSC-T6細胞凋亡的影響

張彥亮， 吳會玲， 岳巧艷， 宋 爽， 宋 希， 陶 臻

南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院感染科(南京市第一醫(yī)院)，江蘇 南京 210006

論著·肝臟相關疾病

小干擾RNA沉默IKK/NF-κB信號通路對HSC-T6細胞凋亡的影響

張彥亮， 吳會玲， 岳巧艷， 宋 爽， 宋 希， 陶 臻

南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院感染科(南京市第一醫(yī)院)，江蘇 南京 210006

目的 研究小干擾RNA(siRNA)沉默IKK/NF-κB信號通路對于肝星狀細胞株HSC-T6凋亡的影響。方法 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫IKKβ的cDNA序列,設計構建合成IKKβsiRNA，采用陽性脂質體轉染，設立空白對照組、陰性對照組及siRNA實驗組，采用TUNEL法和流式細胞儀Annexin-V/PI雙染法測定IKKβsiRNA轉染后24 h、48 h和72 h細胞凋亡率，同時采用Western blotting檢測NF-κB P65、Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表達情況。結果 與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組24 h、48 h和72 h HSC-T6細胞凋亡率均顯著增加(P<0.05)，且具有時間依賴性；實驗組的NF-κB P65及Bcl-2蛋白的表達均明顯升高，而Caspase3和Bax則顯著增加，與空白對照和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 SiRNA沉默IKK/NF-κB信號通路能夠下調NF-κB P65的表達，同時提高Bax和Caspase3的表達，促進HSC-T6凋亡，這種肝星狀細胞凋亡誘導效應具有潛在的逆轉肝纖維化的治療作用。

小干擾RNA；肝纖維化；肝星狀細胞；IKK/NF-κB信號通路；凋亡

肝纖維化是各種病因引起的肝臟慢性進行性的病理過程，肝纖維化的效應細胞肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)的激活、增殖并產(chǎn)生分泌大量ECM是肝纖維化形成的關鍵環(huán)節(jié)，已有多個研究顯示通過誘導活化的HSC發(fā)生凋亡能夠逆轉肝纖維化過程。因此筆者利用體外細胞培養(yǎng)技術，采用小干擾RNA(siRNA)抑制肝星狀細胞株HSC-T6中IKKβ基因的表達，沉默IKK/NF-κB(nucler factor-kappaB, 核因子κB)信號通路，研究其對HSC-T6細胞凋亡的影響，為臨床肝纖維化逆轉治療探索新的靶點和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；脂質體Lipofectamine 2000、TRIzol購自美國 Invitrogen公司；RPMI-164購自美國 GIBCO公司；DMSO(溶解Formazan結晶)購自中國上海久億化學試劑有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒及Taq DNA Polymerase均購自美國 Thermo Fisher公司；Agarose購自西班牙Biowest 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組：HSC-T6細胞含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)。實驗時分為空白對照組、陰性對照組、IKKβsiRNA轉染實驗組。

1.2.2 設計構建合成IKKβsiRNA：通過NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索IKKβ的cDNA序列, 按照siRNA設計原則設計合成IKKβsiRNA，采用RT-PCR檢測siRNA表達對IKKβ基因表達的影響，選取抑制效率最佳的IKKβsiRNA用于實驗(RNA合成由上海吉瑪制藥技術有限公司，引物合成由南京金斯瑞科技有限公司)。SiRNA-1014：S：5′-CCCUCGAUGACAUCUUGAAUU-3′；AS：3′-UUGGGAGCUACUGUAGAACUU-5′。

1.2.3 轉染IKKβsiRNA：轉染接種適當數(shù)量的細胞至細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉染時的細胞密度能夠達到50%～60%；用250 μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋20 μmol/L的貯存液輕輕混勻，室溫孵育5 min；用250 μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋5 μl lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min；將兩者輕輕混勻，室溫孵育20 min；將siRNA-lipo2000混合液加入含有細胞的500 μl培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻培養(yǎng)4～6 h 后，將孔中含siRNA-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡：將對數(shù)生長期的細胞消化接種到60 mm培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，根據(jù)組別設置加入相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組。作用24 h、48 h、72 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞洗滌離心收集5×105個細胞； 加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl Propidium Iodide，混勻反應5～15 min后用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm; Em=530 nm)細胞凋亡的情況。再次收集5×105個細胞的單細胞懸液用體積分數(shù)為70%乙醇固定2 h(或過夜)，4 ℃保存后洗滌；加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI染色混勻，4 ℃避光30 min后上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

1.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡：預處理細胞后加1%的Triton-100使之通透，經(jīng)過PBS浸泡洗滌3次后加3% H2O2甲醇溶液對酶進行滅活，重復洗滌。在每個樣本中滴加100 μl TdT酶反應液，避光濕潤37 ℃反應1 h后洗滌。滴加100 μl Streptavadin-HRP，避光濕潤37 ℃反應30 min。DAB法顯色，終止顯色后復染并封片，使用光學顯微鏡進行觀察，選取10個高倍視野，每個視野計數(shù)300個細胞，計算3 000個細胞中陽性細胞所占的比例，即凋亡率。

1.2.6 Western blotting檢測凋亡相關蛋白表達：提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5～2 h 后，分別用一抗和二抗進行反應后與免疫印跡化學發(fā)光試劑(ECL)反應。X線片曝光、顯影、定影后分析表達情況，計算凋亡指數(shù)(AI)：細胞凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%。

2 結果

2.1 Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡 空白對照組24 h、48 h、72 h的凋亡率分別為(2.38±0.25)%、(3.86±0.37)%、(4.62±0.35)%；陰性對照組分別為(3.65±0.41)%、(3.95±0.81)%、(5.53±0.85)%；實驗組分別為(9.24±2.32)%、(19.35±4.15)%、(27.33±7.37)%，實驗組與其他兩組3個時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=14.21,P<0.05;F=25.32,P<0.05，見圖1)。

2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡 空白對照組24 h、48 h、72 h的凋亡率分別為(5.29±0.72)%、(7.29±0.98)%、(10.76±1.53)%；陰性對照組分別為(6.25±1.38)%、(7.96±1.56)%、(9.6±2.15)%；實驗組分別為(15.18±3.96)%、(24.48±5.12)%、(31.44±5.25)%，實驗組與其他兩組3個時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=21.79,P<0.05;F=41.21,P<0.01，見圖2)。

2.3 Western blotting檢測凋亡相關蛋白表達 IKKβsiRNA干預后實驗組的NF-κB P65及Bcl-2蛋白表達明顯減少， 而Caspase3和Bax蛋白表達則有顯著增加，且這種效應具有時間相關性，與空白對照組和陰性對照組比較4種凋亡相關蛋白差異均有統(tǒng)計學意義(F=31.7,P<0.05)，兩對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而實驗組在3個時間點與兩對照組比較4種凋亡蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3、4)。

圖1 Annexin V/PI檢測HSC-T6細胞凋亡 A:空白對照組；B:陰性對照組；C:SiRNA實驗組

Fig 1 Apoptosis rate of HSC-T6 cells detected by AnnexinV/PI double staining A: blank control group; B: negative control group; C: experimental group

圖2 TUNEL法檢測細胞凋亡 A:空白對照組; B:陰性對照組; C:siRNA實驗組

Fig 2 Apoptosis rate detected by TUNEL staining A: blank control group; B: negative control group; C: experimental group

注：與空白對照組比較, *P<0.05；與陰性對照組比較, △P<0.05。

圖3 IKKβsiRNA對HSC-T6相關凋亡蛋白表達的影響

Fig 3 Effect of IKKβsiRNA on the expression of HSC-T6 related apoptosis protein

注：A:空白對照組；B:陰性對照組；C:SiRNA實驗組；1：24 h; 2:48 h; 3:72 h。

圖4 IKKβsiRNA對HSC-T6相關凋亡蛋白表達的影響

Fig 4 Effect of IKKβ siRNA on the expression of HSC-T6 related apoptosis protein

3 討論

在肝纖維化的病理機制中,大量激活的HSC起主導作用,目前認為激活的HSC有4種去向：(1)由激活型轉變回靜止型；(2)發(fā)生細胞凋亡；(3)免疫清除；(4)衰老[1]。其中凋亡途徑不但可以減少激活增殖HSC 數(shù)量,也不引起溶酶體等細胞器的破壞,且凋亡的細胞可在數(shù)小時內被周圍的內皮細胞或枯否細胞吞噬, 因而很少引起微環(huán)境的炎癥損傷,是一種理想的清除HSC 的方式，多個研究顯示如能誘導HSC凋亡則能夠逆轉肝纖維化的病理過程[2-3]。

多個研究表明NF-κB具有抗凋亡作用，在靜息狀態(tài)下其與抑制蛋白IκB結合呈無活性狀態(tài)，當受內毒素、TNF等外界信號刺激后, IκB在蛋白激酶IKK的作用下發(fā)生磷酸化降解, NF-κB由胞質迅速移位至胞核, 與特異性κB序列結合, 誘導抗凋亡相關基因轉錄，發(fā)揮抗凋亡效應[4-5]。而IKK復合體(IκB 激酶)是NF-κB 信號通路的主要調節(jié)物，它由3個亞基組成，其中IKKβ尤為重要，將鼠的IKKβ基因敲除后, NF-κB活化受到嚴重抑制，鼠胚胎時期即會死亡, 并會由于肝臟細胞發(fā)生凋亡而表現(xiàn)出肝臟退化病變。已有實驗研究證明，將NF-κB基因敲除能顯著促進HSC的凋亡并減少細胞外基質的產(chǎn)生[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素和丹皮酚等中藥單體均能夠顯著抑制肝星狀細胞的NF-κB的活化，從而使活化的肝星狀細胞凋亡增加，發(fā)揮其抗纖維化效應[6-7]。學者Oakley等[8]采用選擇性的NF-κB抑制劑柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP)進行干預，結果發(fā)現(xiàn)SASP在體內和體外實驗均能誘導HSC凋亡，減少細胞基質的合成。

本研究通過構建siRNAIKKβ沉默HSC-T6 IKK/NF-κB信號通路，結果發(fā)現(xiàn)NF-κB P65蛋白表達水平明顯降低，同時流式細胞儀Annexin V/PI雙染法和Tunel法檢測均顯示實驗組HSC-T6細胞凋亡率顯著增加，與空白對照組及陰性對照組比較有顯著性差異，由此可見抑制NF-κB的活化能顯著增加肝星狀細胞的凋亡，這與在腫瘤、腎臟病領域的研究相類似[7-8]。同時Western blotting結果顯示實驗組凋亡相關蛋白Bcl-2的表達明顯下降，而Caspase3和Bax蛋白表達則顯著增加，與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，且這種效應具有時間相關性，由此可見IKK/NF-κB信號通路對細胞凋亡的調控作用系通過調節(jié)相關凋亡、抗凋亡蛋白的表達來實現(xiàn)，阻斷其通路能誘導促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達的增加，促進細胞凋亡的發(fā)生。

由此可見肝纖維化過程中，IKK/NF-κB信號通路扮演著重要的角色，其能抑制HSC的凋亡，使得活化的HSC數(shù)量維持在高水平狀態(tài)，最終導致肝臟內細胞外基質的異常沉積發(fā)展成為肝纖維化甚至肝硬化，沉默其信號通路則能夠顯著抑制NF-κB活性，從而促進HSC的凋亡，將有可能成為逆轉肝纖維化，以IKK/NF-κB信號通路為靶點的治療策略具有非常好的臨床應用前景。

[1]De Minicis S, Candelaresi C, Agostinelli L, et al. Endoplasmic Reticulum stress induces hepatic stellate cell apoptosis and contributes to fibrosis resolution [J]. Liver Int, 2012, 32(10): 1574-1584.

[2]Liu L, Wei J, Huo X, et al. The Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 induces apoptosis of hepatic, stellate cells in vivo in a bile duct ligation-induced model of liver fibrosis [J]. Mol Med Rep, 2012, 6(6): 1231-1238.

[3]Zhu YH, Chen Z, Qian ZY, et al. Effects of crocetin on proliferation and collagen synthesis of hepatic stellate cell [J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2013, 18(8): 841-847.

[4]Yang L, Zhou Y, Li Y, et al. Mutations of p53 and KRAS activate NF-κB to promote chemoresistance and tumorigenesis via dysregulation of cell cycle and suppression of apoptosis in lung cancer cells [J]. Cancer Letters, 2014, 357(2): 520-526.

[5]Elsharkawy AM, Wright MC, Hay RT, et al. Persistent activation of nuclear factor-κB in cultured rat hepatic stellate cells involves the induction of potentially novel rel-like factors and prolonged changes in the expression of IκB family proteins [J]. Hepatology, 1999, 30(3): 761-769.

[6]Kim BH, Yoon JH, Yang JI, et al. Guggulsterone attenuates activation and survival of hepatic stellate cell by inhibiting nuclear factor kappa B activation and inducing apoptosis [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(12): 1859-1868.

[7]Kong D, Zhang F, Wei D, et al. Paeonol inhibits hepatic fibrogenesis via disrupting nuclear factor-κB pathway in activated stellate cells: in vivo and in vitro studies [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(7): 1223-1233.

[8]Oakley F, Meso M, Iredale JP, et al. Inhibition of inhibitor of kappaB kinases stimulates hepatic stellate cell apoptosis and accelerated recovery from rat liver fibrosis [J]. Gastroenterology, 2005, 128(1): 108-120.

(責任編輯：王全楚)

Effects of small interfering RNA silencing IKK/NF-κB on the apoptosis of HSC-T6

ZHANG Yanliang, WU Huiling, YUE Qiaoyan, SONG Shuang, SONG Xi, TAO Zhen

Department of Infectious Disease, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China

Objective To investigate the effects of small interfering RNA (siRNA) silencing IKK/NF-κB on the apoptosis of hepate stellate cell line T6 (HSC-T6). Methods Chemically synthesized siRNA directed against IKKβ was transfected into HSC-T6 by cationic liposome Lipofectamine. The cells were divided into blank control group, negative control group and experimental group. TUNEL staining and AnnexinV/PI double staining with Flow cytometry (FCM) were used to detect the apoptosis rate of the cells at 24 hours,48 hours, 72 hours. The protein levels of NF-κB P65, Bcl-2, Bax and Caspase3 were analyzed by Western blotting. Results Compared with the negative control group and blank control group, the apoptosis rate in experimental group was increased significantly with time (P<0.05). In the experimental group, the expressions of NF-κB P65 and Bcl-2 were decreased significantly, while the expressions of Caspase and Bax were increased compared with the negative control group and blank control group (P<0.05). Conclusion SiRNA silencing IKK/NF-κB can down-regulate the expression of NF-κB P65, while can increase the expressions of Bax and Caspase3, by which can promote apoptosis of HSC-T6. This may be a potential strategy for the reverse effect of hepatic fibrosis.

SiRNA; Liver fibrosis; Hepatic stellate cell; IKK/NF-κB signal pathway; Aptoptosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.013

南京市衛(wèi)生科技發(fā)展項目 (QYK11173)

張彥亮，副主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：復雜疑難重癥感染性疾病。E-mail: swinburn@163.com

陶臻，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：呼吸系統(tǒng)感染性疾病。E-mail: tz1010@126.com

R575

A

1006-5709(2016)11-1258-04

2016-02-15