四種不同方法提取黃芪中黃芪甲苷的對比研究*

何 昊，許 暢，王興中，蘇 力，張家旭

(西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021)

黃芪(Astragali Radix)為豆科植物蒙古黃芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黃芪中含有皂苷、黃酮、多糖等多類化合物，其中黃芪甲苷Astragaloside IV是黃芪中皂苷的主要成分[2]，也是其重要的生理活性成分，具有增強免疫力，消炎、降壓、抗病毒、抗衰老、清除自由基等功效[3]。毛蕊異黃酮能夠提高機體免疫功能，增強機體抗氧化能力，具有抗輻射、抗癌作用，能舒張血管平滑肌，保護心腦血管，還能保護腦細胞、提高記憶力，另具有激素樣作用，可減少糖尿病并發(fā)癥等[4]。因此，黃芪藥材及多種制劑均以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮為定性或定量指標成分。然而，黃芪中黃芪甲苷的含量并不高，因此需要選擇一種高效便利的提取工藝，為黃芪甲苷的提取提供便利。煎煮法、滲漉法均為傳統提取方法，特點為提取時間長，成本低；索氏提取法是連續(xù)回流提取法的一種，提取效率較高；CO2超臨界流體提取法是在高壓下CO2處于超臨界狀態(tài)而提取有效物質的一種技術，可以在接近室溫下進行提取，具有無有機殘留，無公害，分離簡單等特點。

作者分別采用煎煮法、滲漉法、索氏提取法和CO2超臨界流體提取法對黃芪中黃芪甲苷成分進行提取，比較提取條件、浸膏得率及黃芪甲苷質量分數，同時選擇毛蕊異黃酮質量分數對比參照，最終結果為選擇適當的黃芪甲苷提取方法提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

黃芪：購于西安市萬壽路藥材市場，經鑒定為膜莢黃芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge.。藥材干燥、粉碎，過篩(篩孔尺寸：0.425 mm)后保存；黃芪甲苷對照品、毛蕊異黃酮對照品：質量分數>98%，上海源葉生物科技有限公司；乙醇、正丁醇：分析純，乙腈：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；濃氨溶液：分析純，西安化學試劑廠；純凈水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

Waters1525高效液相色譜儀：美國Waters公司；Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器：美國Alltech公司；FW200A高速萬能粉碎機：北京科偉永興儀器有限公司；MH-500型調溫電熱套：北京科偉永興儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水真空泵：鞏義予華儀器有限責任公司；GR-202分析電子天平：日本AND公司；Thermo Micropure超純水儀：賽默飛世爾科技；SFT-100XW型超臨界萃取儀：美國Supercritical Fluid Technologie；滲漉柱:30 mm×300 mm、索氏提取器：500 mL,北京博美華科玻璃有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液配制

精密稱取黃芪甲苷和毛蕊異黃酮對照品，甲醇溶解制成0.5 mg/ mL的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的配制

煎煮法：稱取黃芪藥材粉末20 g，加入20倍量純凈水，持續(xù)煎煮2 h，過濾，減壓濃縮至干。滲漉法：稱取黃芪藥材20 g，加入體積分數70%乙醇潤濕，裝入滲漉柱中，浸漬24 h，之后以0.3 mL/min速度滲漉提取，收集8倍量的滲濾液，減壓濃縮至干。索氏提取法：稱取黃芪藥材粉末20 g，用濾紙包裹好，置入索氏提取器中，加入200 mL體積分數70%乙醇，回流提取4 h，減壓回收溶劑至干。CO2超臨界流體提取法：稱取黃芪藥材20 g，加入超臨界萃取釜中，參數為壓力40 MPa，萃取溫度45 ℃，夾帶劑為無水乙醇，靜態(tài)萃取40 min，動態(tài)萃取30 min，CO2流速10 L/h，所得提取物留待HPLC檢測。以上4種方法所得提取物均加水微熱使其溶解，用水飽和正丁醇振搖萃取4次，每次200 mL，合并正丁醇，之后用氨試液(濃氨溶液400 mL，加水至1 000 mL即得)洗滌2次，每次200 mL，之后蒸干正丁醇。

1.2.3 液相色譜分析條件

色譜柱Kromasil C18分析柱(4.6 mm×150 mm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)(0 min，0∶100；0～4 min，20∶80；4～8 min，40∶60；8～12 min，60∶40；12～16 min，80∶20；16～20 min，100∶0；梯度洗脫)；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；ELSD檢測器；進樣量20 μL。

2 結果與討論

2.1 HPLC-ELSD法同時測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮質量分數的方法學驗證

2.1.1 色譜條件的選擇

由于黃芪甲苷僅在201 nm附近有末端吸收，因此采用紫外檢測器導致噪音較大、重現性差。故實驗采用HPLC-ELSD法同時對黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮的質量分數進行測定[5]。

采用HPLC-ELSD方法，以Kromasil Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱；乙腈和水為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測器，ELSD 參數：漂移管溫度95 ℃，載氣流速2.1 L/min。

2.1.2 液相色譜分析專屬性實驗

按照上述色譜條件，對標準品溶液進行混合進樣測定分析，記錄色譜圖，結果見圖1。

t/mina 黃芪甲苷和毛蕊異黃酮對照品

t/minb 黃芪藥材供試品圖1 標準溶液HPLC-ELSD圖譜

以上結果證明該方法專屬性好。

2.1.3 標準曲線的建立

精密吸取1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL標準品儲備液，置于10 mL容量瓶中，加入定量甲醇稀釋至刻度，按2.1.1的色譜條件分別進樣20 μL，測定峰面積。分別以各組分的峰面積(y)為縱坐標，質量分數(x)為橫坐標繪制標準曲線。結果如下。

回歸方程：y=87.776x-0.188 6(r=0.999 2，n=6)。

以上結果證明線性關系良好。

2.1.4 精密度實驗

取黃芪浸膏粉，按1.2.2制備樣品溶液，在2.1.1色譜條件下測定，重復進樣6次，每次20 μL，測得黃芪甲苷和毛蕊異黃酮色譜峰面積的RSD分別為2.7%和3.1%，見表1。表明該方法的精密度良好。

表1 精密度實驗

2.1.5 穩(wěn)定性實驗

取黃芪浸膏粉末，按1.2.2制備樣品溶液，分別于0，2，4，8，12 h測定，測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮質量分數的RSD分別為1.6%和2.1%，見表2。表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性實驗

2.1.6 回收率實驗

取黃芪浸膏粉末，分別加入對照品溶液6.0，4.0，2.0 mL，按1.2.2制備樣品溶液，在2.2.1色譜條件下，進樣20 μL。每個樣品重復3次，計算平均回收率，結果見表3。

表3 回收率實驗結果

2.2 四種不同提取方法質量分數測定及結果

采用煎煮法、索氏提取法、滲漉法和CO2超臨界流體提取法4種不同的方法對黃芪藥材進行提取，以干浸膏得率、黃芪甲苷得率、毛蕊異黃酮得率、提取時間、成本等多方面進行綜合比較，結果見表4。

由表4可看出，CO2超臨界流體提取法對于黃芪甲苷和毛蕊異黃酮提取率均最高，提取時間最短，但設備成本較高。

表4 四種不同提取方法的綜合比較

3 結 論

同時選用浸膏得率、黃芪甲苷質量分數和毛蕊異黃酮質量分數作為觀測指標，可綜合考察各提取方法對黃芪中主要指標成分的提取效率，對于提取方法的選擇更具有參考性。綜合比較4種提取方法提取黃芪中黃芪甲苷的提取效率，以干浸膏得率以及黃芪甲苷和毛蕊異黃酮質量分數為標準，得出CO2超臨界流體提取法提取時間最短，提取效率最高，是一種簡便、快速，值得推廣的提取方法，但是，CO2超臨界流體提取法設備成本較高，這也是推廣過程中需要注意的一點。

參 考 文 獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2015版(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：302-303.

[2] Bian Y Y,Guan J,Bi Z M,et al.Studies on chemical constituents ofAstragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao[J].China Pharm J,2006,41(16):1217-1221.

[3] 段立軍，孫博航.黃芪甲苷的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2011，28(5):410-416.

[4] 張冬青，王海寶，王淑芳，等.毛蕊異黃酮生物活性的研究進展[J].中國中藥雜志,2015,40(22):4339-4345.

[5] 宋成英，封加福.HPLC同時測定黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(11):115-117.