精子DNA完整性對體外授精-胚胎移植妊娠結局的影響

汪李虎汪 艷梁嘉穎楊少芬楊旭輝張 杰朱照平易艷紅

1. 廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科（廣州 510010）；2. 廣州金域檢驗中心

精子DNA完整性對體外授精-胚胎移植妊娠結局的影響

汪李虎1*汪 艷2梁嘉穎1楊少芬1楊旭輝1張 杰1朱照平1易艷紅1

1. 廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科（廣州 510010）；2. 廣州金域檢驗中心

目的探討精子DNA完整性對體外受精-胚胎移植（IVF-ET）臨床結局的影響。方法采用染色質擴散實驗（SCD）對接受203個周期IVF-ET治療的男方精液進行精子DNA 完整性檢測。因女方卵巢反應差取消10個周期，剩余193個周期。根據(jù)精子DNA碎片指數(shù)（DFI）是否超過30%和是否藥物治療分為3組：DFI異常組55例（DFI＞30%），DFI正常組（DFI＜30%）78例和DFI治療組60例，其中DFI治療組指患者DFI＞30%，經(jīng)藥物治療3個月，降至30%以下。比較DFI與受精率、2PN 受精率、卵裂率及優(yōu)胚率的相關性；比較3組間的種植率、妊娠率和流產(chǎn)率。結果精子DFI與受精率、2PN受精率及卵裂率均無顯著相關性（P＞0.05），與優(yōu)胚率具有顯著負相關（P＜0.05）。DFI正常組和DFI治療組（治療后DFI＜30%）的種植率及妊娠率均高于DFI異常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DFI正常組與DFI治療組的種植率及妊娠率差異均無統(tǒng)計學統(tǒng)計（P＞0.05）。3組流產(chǎn)率表現(xiàn)相當，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論精子DNA完整性對受精率、2PN受精率及卵裂率無影響，對優(yōu)胚率、種植率及妊娠率有負面影響，藥物改善精子DNA完整性后可提高優(yōu)胚率、種植率及妊娠率。

受精,體外; 精子DNA完整性; 妊娠結局

目前全球不孕不育患者呈逐年增加趨勢，隨著男科診療水平的提高，發(fā)現(xiàn)約有一半與男方因素有關[1]。對男性生育力評估傳統(tǒng)方法主要依靠精液常規(guī)分析和精子形態(tài)分類，但這些方法僅能反映48%的男性生殖能力[2]，因此，僅使用以上方法不足以評估男性生育力。精子DNA完整性的測定被認為是一項評估男性生育能力的穩(wěn)定指標[2]，而且也逐漸用于輔助生殖技術相關妊娠結局的重要預測指標[3]。但也有認為精子DNA完整性與受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率均無相關性[4]。本文對在本院實施IVF-ET的男方采用精子染色質擴散實驗（sperm chromatin dispersion，SCD）檢測精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI），并對部分DFI異常者給予抗氧化劑和中成藥治療，探討精子DNA完整性與IVF-ET臨床結局的關系。

對象與方法

一、研究對象

選取2013年1月1日至2015年10月31日本院行IVFET周期夫婦203對。

男方根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版標準[2]，行精液常規(guī)檢查、精子形態(tài)分析和采用精子染色質擴散實驗檢測精子DNA碎片指數(shù)（DFI）。依據(jù)DFI是否超過30%和是否藥物治療分為3組：DFI異常組（DFI＞30%）55例，DFI正常組（DFI＜30%）78例和DFI治療組60例。其中DFI治療組指患者DFI＞30%，經(jīng)維生素E和中成藥麒麟丸（太安堂集團，國藥準字Z10930034，每日3次，口服，每次6g）治療3個月，降至30%以下。女方納入標準要求：（1）女方年齡＜35歲；（2）長方案降調；（3）新鮮移植周期。雙方染色體核型均正常。

二、精子DNA損傷檢測

購買深圳博稅德生物科技有限公司精子DNA碎片檢測試劑盒，采用SCD法進行檢測。手淫法取精，待精液液化后，用 PBS 稀釋精子密度至 5~10×106/mL。易熔凝膠管80℃溫浴20min，37℃復溫5min。取出待測標本60μL加入上述易熔膠管中，充分混勻，加入30μL精子混合液在經(jīng)過0.65%正常熔點瓊脂預處理過的載玻片上，蓋上22mm×22mm蓋玻片，水平置于4℃冰箱5min。移至室溫，去除蓋玻片，避光條件下，放入 DNA 變性液中孵育7min，轉入裂解液中孵育25min，放入蒸餾水中漂洗1~2min，換水1~2次。玻片依次放入70%、90%和100%乙醇中各脫水2min。玻片風干后用瑞氏染色15min，流水沖洗，空氣干燥。在高倍鏡下計數(shù)大于500條精子，并計算DNA存在損傷精子所占比例即DFI。以 DFI＜30%為正常。

三、IVF方案

女方超排卵均采用常規(guī)長方案，卵泡成熟后肌注hCG，34~36h 在陰道B超引導下取卵；于采卵后4-6h 行體外受精，受精后第3天進行胚胎評價，根據(jù)卵裂球數(shù)目、形態(tài)、碎片多少將胚胎分為4級[5]其中Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優(yōu)質胚胎。取卵后第3天移植1~2枚胚胎。移植28d后行陰道超聲檢查孕囊及胎心。

四、統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料以x±s表示；組間計數(shù)、計量資料比較采用t檢驗；組間率的比較采用x2檢驗；相關性分析采用直線相關分析；P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、研究對象基本情況

203對夫妻共進行203個IVF周期：DFI異常組55個周期，DFI正常組78個周期和DFI治療組60個周期。組間比較，男女方年齡、精子密度、正常形態(tài)精子百分率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；獲卵數(shù)及移植胚胎數(shù)也無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

二、DFI與受精率、2PN受精率、卵裂率及優(yōu)胚率的相關性分析

精子DFI與受精率、2PN 受精率、卵裂率均無明顯相關性（P＞0.05），精子DFI與優(yōu)胚率呈顯著負相關，見表2。

三、DFI與IVF-ET妊娠結局的關系

DFI正常組和DFI治療組的種植率及妊娠率均高于DFI異常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DFI正常組與DFI治療組的種植率及妊娠率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。3組流產(chǎn)率表現(xiàn)相當，差異均無統(tǒng)計學意義（均為P＞0.05），見表3。

表1 男女雙方基本情況比較

表2 DFI與受精情況的相關性分析

表3 3組IVF-ET妊娠結局的比較

討 論

目前大量研究報道精子DNA完整性影響男性生育力，但對IVF臨床結局仍存在諸多爭議。有研究認為精子DNA損傷與受精率相關[3]，但有研究報道兩者無相關性[4]。Borini等[6]認為早期胚胎的發(fā)育主要受母源基因組的調控，受精以及受精卵2~4細胞卵裂均依賴卵母細胞發(fā)育和成熟階段積累的線粒體RNA，父源基因組在胚胎發(fā)育至4~8細胞期后開始激活并影響胚胎的繼續(xù)發(fā)育，因而認為精子DNA損傷并不影響受精以及細胞卵裂。同時，Jin等[7]發(fā)現(xiàn)卵母細胞的修復能力可能是決定精子DNA損傷影響IVF結局的關鍵因素，且卵母細胞的數(shù)量和質量是其修復能力的保障。本研究結果顯示在女方獲卵數(shù)和卵子質量相當情況下，精子DFI與受精率、2PN受精率、卵裂率均無相關性，說明DFI對精卵結合、胚胎卵裂沒有明確的預示作用。

在精子形成過程中，組蛋白逐漸被魚精蛋白替代，由二硫鍵交聯(lián)形成高度致密細胞核，這種致密結構有利于保護精子染色質抵抗外界應激[8]，保持精子DNA的完整性，保證遺傳信息完整地傳遞給卵母細胞，在后續(xù)的胚胎發(fā)育中正確地表達。導致精子DNA完整性損傷的因素較多，包括環(huán)境毒物、精索靜脈曲張、生殖道感染等病理性因素，以及精子冷凍、化療、放療等醫(yī)源性損傷，通過精子發(fā)生缺陷、氧化應激、精子凋亡異常等機制造成DFI增高。在IVF過程中，男方精子在體外暴露時易引起氧化應激反應從而進一步加重DNA損傷。Janny等[9]認為質量差的精子受精后的胚胎，在3~4d大量胚胎質量評分低甚至發(fā)育停滯，致使DFI高的DFI異常組患者優(yōu)胚率比DFI低的DFI正常組患者顯著降低以及胚胎碎片增多、種植率降低等。本文結果顯示DFI與優(yōu)胚率呈顯著負相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；DFI異常組的種植率和妊娠率均低于DFI正常組和DFI治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），均與國外資料相符。

精子DNA損傷與男性不育密切相關，其損傷程度與自然受孕率呈顯著負相關，有報道認為DFI≥30%，則自然生育的可能性幾乎為零[4]。而且本研究提示精子DNA損傷與IVF- ET的優(yōu)胚率、胚胎種植率、臨床妊娠率相關。因此，有必要對高DFI的患者在接受IVF前進行治療，以提高精子DNA完整性。首先應針對引起DNA損傷的病因進行治療，如精索靜脈曲張患者行精索靜脈高位結扎術，生殖道感染患者根據(jù)藥敏試驗選擇有效抗生素規(guī)范治療?？寡趸瘎┠苡行У乇Ｗo精子DNA免受ROS的損傷[10]。Tunc等對不育癥患者口服抗氧化劑維生素E片劑治療后，精子核DNA完整性提高，凋亡精子和精液中抗氧化鎂活性顯著提高[11]。根據(jù)中醫(yī)“腎主生殖”理論，本課題采用具有“補腎填精，益氣養(yǎng)血”的麒麟丸和抗氧化劑維生素E聯(lián)合治療3個月，高DFI患者均降至正常；且DFI治療組與DFI正常組的胚胎種植率、臨床妊娠率，均高于DFI異常組（未經(jīng)治療）。因此，中醫(yī)藥在精子DNA損傷的預防和保護中可能起到一定的作用，是值得深入研究的領域。

1 World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen.5th ed. Geneva: World Health Organization. 2010:112-114

2 Omran HM, Bakhiet M, Dashti MG. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep 2013; 7(5):1631-1635

3 Huang CC, Lin DP, Tsao HM, et al. Sperm DNAfragmentation negatively correlates with velocity and fertilization rates but might not affect pregnancy rates. Fertil Steril 2005; 84(1): 130-140

4 Bungum M, Humaidan P, Axmon A, et al. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome. Hum Reprod 2007; 22(1): 174-179

5 莊廣倫. 現(xiàn)代輔助生育技術. 第1版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2005: 238-239

6 Borini A, Tarozzi N, Bizzaro D, et al. Sperm DNA fragmentation: Paternal effect on early post-implantation embryo development in ART. Hum Reprod 2006; 21(11): 2876-2881

7 Jin J, Pan C, Fei Q, et al. Effect of sperm DNA fragmentation on the clinical outcomes for in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection in women with different ovarian reserves. Fertil Steril 2015; 103(4): 910-916

8 Reusser P. Oral valganciclovir: A new option for treatment of cytomegalovirus infection and disease in immunocompromised hosts. Expert Opin Investing Drugs 2011; 10(9): 1745-1753

9 Janny L, Menezo YJ. Evidence for a strong paternal effect on human preimplantation embryo development and blastocyst formation. Mol Reprod Dev 1994; 38(1): 136-142

10 Kammann U, Bunke M, Steinhart H, et al. Apermancent fsh cell(EPC) for genotoxicity testing of marine sediments with the comet assay. Mutat Res 2001; 498(1-2): 67-77

11 Tunc O, Thompson J, Trem Ellen K. Improvement in sperm DNA quality using an oral antioxidant therapy. Reprod Biom Online 2009 18(6): 761-768

（2016-08-05收稿）

Influence of the sperm DNA integrity on the clinical pregnancy outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer

Wang Lihu1*, Wang Yan2, Liang Jiaying1, Yang Shaofen1, Yang Xuhui1, Zhang Jie1, Zhu Zhaoping1, Yi Yanhong1
1.Center of Reproductive Health and Infertility, Guangdong Women and Children's Hospital，Guangzhou 510010，Guangdong, China; 2.Guangzhou Kingmed Center for Clinical Laboratory

Wang lihu, E-mail:wanglihu25@163.com; Tel:13501540187

ObjectiveTo investigate the infuence of sperm DNA integrity on the clinical pregnancy outcomes of in vitro fertilization (IVF-ET).MethodsThis study included 203 couples accepted conventional IVF-ET cycles. 193 couples had fnally fnished the study due to cancelling 10 cases. Sperm chromatin dispersion (SCD) was used to test sperm DNA integrity. According to the level of sperm fragmentation index(DFI) and weather treatment the high DFI or not, the cases were divided into the normal DFI group(DFI<30%) and the abnormal DFI group(DFI≥30%) group and treatment DFI group(DFI≥30% after treatment), and the results among the three groups were compared.ResultsNo statistically signifcant correlation were observed among sperm DFI with fertilization rates, 2PN fertilization rates and zygote transgene rates (P>0.05), but DFI was negatively correlated with the optimal embryo rates (P<0.05) between the normal DFI group and the abnormal DFI group or between the abnormal DFI group and the treatment DFI group. The implantation rate and clinical pregnancy rate in the normal DFI group and the treatment DFI group were higher than the abnormal DFI group，showing signifcant difference (P<0.05). No statistically signifcant difference was observed between the normal DFI groupand the treatment DFI group.ConclusionIn IVF-ET treatment，the sperm DNA integrity has no effect on fertilization rate，2PN fertilization rates and zygote transgene rates，but DFI has negative effect on optimal embryo rates，implantation rate and clinical pregnancy rate. The optimal embryo rates, implantation rate and clinical pregnancy rate might increased if DFI exceeded 30% after treatment.

fertilization in vitro; sperm DNA integrity; pregnancy outcome

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.008

R 321-33

*通訊作者，E-mail:wanglihu25@163.com; Tel:13501540187