雙孔鉀離子通道TASK-1、TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達(dá)*

范 文方勝英周 慧梅紅彬

1. 武漢市優(yōu)撫醫(yī)院（武漢 430022）；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計(jì)劃生育研究所/生殖醫(yī)學(xué)中心

·論 著·

雙孔鉀離子通道TASK-1、TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達(dá)*

范 文1方勝英1周 慧2**梅紅彬1

1. 武漢市優(yōu)撫醫(yī)院（武漢 430022）；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計(jì)劃生育研究所/生殖醫(yī)學(xué)中心

目的探討雙孔鉀離子通道TASK-1、TRAAK在精子中的表達(dá)水平及TASK-1、TRAAK在弱精子癥發(fā)生機(jī)制中的作用。方法采用非連續(xù)密度梯度離心分離、純化正常對(duì)照組精液標(biāo)本20例和弱精子癥組精液標(biāo)本30例，提取精子總RNA后，采用RT- PCR，SYBR Green 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)精子中TASK-1、TRAAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果TASK-1、TRAAK mRNA在正常對(duì)照組和弱精子癥組精子中均有表達(dá)；其中，TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達(dá)量明顯低于其在正常對(duì)照組精子中的表達(dá)量，下降2.3倍，兩組之間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），TASK-1在弱精子癥患者精子中的表達(dá)量與其在正常對(duì)照組精子中的表達(dá)量沒有明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論TRAAK基因在弱精子癥患者精子中的表達(dá)下調(diào)可能與精子活力下降有關(guān)，提示TRAAK可能成為弱精子癥發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)分子靶標(biāo)。

雙孔鉀離子通道; 弱精子癥; 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

弱精子癥是男性不育的重要原因之一。有報(bào)道稱[1]，超過(guò)80%的男性不育與精子運(yùn)動(dòng)障礙有關(guān)，其中大約20%與精子活動(dòng)力低下有著直接關(guān)系。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，目前已有多種動(dòng)物模型證實(shí)近300個(gè)基因與男性不育有關(guān)，其中包括一些精子動(dòng)力相關(guān)基因如Tektin4 基因[2]、CATSPER1基因[3]、TCTE3基因[4]等。雙孔鉀離子通道（Two-pore domain potassium channels, K2P）是上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)并克隆一種含4個(gè)跨膜片段和2個(gè)孔道結(jié)構(gòu)域的鉀離子通道亞型，由于K2P通道可以在靜息電位處開放，因而也被稱為背景鉀通道或 漏流鉀通道。K2P通道依據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的性質(zhì)可被劃分為6個(gè)亞類：（1）TWIK-1、TWIK-2和KC-NK7；（2）TASK-1、TASK-3和TASK-5；（3）TREK-1、TREK-2 和TRAAK；（4）TASK-2、TALK-1和TALK-2；（5）THIK-1和THIK-2；（6）TRESK。其基因則以KCNK來(lái)命名。K2P通道表達(dá)分布非常廣泛，幾乎在各種組織細(xì)胞都能發(fā)現(xiàn)它們的存在，在不同的組織，K2P通道具有不同的功能。其中，TASK-1[5]廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，參與維持細(xì)胞膜的靜息電位和調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性，具體在不同的組織細(xì)胞中它有著不同的生理功能；TRAAK[6]在小腦中有相對(duì)特異和高水平的表達(dá)，提示它的活性與神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。然而，目前尚缺少TASK-1、TRAAK在人類生殖細(xì)胞的表達(dá)及其與弱精子癥發(fā)生機(jī)制相關(guān)的研究。本研究采用 RT- PCR檢測(cè)TASK-1、TRAAK mRNA在正常男性和弱精子癥患者精子中表達(dá)有無(wú)差異，從而為進(jìn)一步探討弱精子癥的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

資料與方法

一、資料

（一）研究對(duì)象

20例正常男性對(duì)照組（年齡22~45歲）精液標(biāo)本來(lái)自2015年8~12月健康體檢合格供精志愿者，精子濃度≥15×106/mL，精子活力[（a+b）級(jí)精子]百分率≥40%；30例弱精子癥組患者（年齡21~47歲）精液標(biāo)本來(lái)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，精子濃度≥15×106/mL，精子活力[（a+b）級(jí)精子]百分率＜40%，兩組間年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，精液量、pH、液化時(shí)間、正常形態(tài)精子百分率均正常，所有的樣本均排除支原體、衣原體感染，附睪或睪丸炎，系統(tǒng)性疾病病史，且精漿生化、生殖激素、常規(guī)體格檢查正常。

（二）主要試劑及儀器

Percoll（Pharmacia，美國(guó)），RNA提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)），RT-PCR試劑盒（TOYOBO，日本），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TOYOBO，日本），其余試劑均為分析純；WLJY-9000偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)儀（中國(guó)），LineGene 9620實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BIOER，中國(guó)）。

二、方法

（一）Percoll法分離精液

液化后的精液樣本采用WLJY-9000偉力精子質(zhì)量分析儀分析，按其活力分為正常組和弱精子癥組。入選樣本按文獻(xiàn)[7]采用Percoll（取80%和40%兩個(gè)濃度） 純化精子，收集80%層底部精子，加入5mL體細(xì)胞裂解液（0.1%十二烷基硫酸鈉，0.5% TritonX-100，用RNase-free水配制，4℃保存，臨用前取出冰?。?，吹打分散沉淀，置冰浴15 min，間斷吹打，用0.01mol/L PBS（pH 7.4）洗滌3次，顯微鏡下確認(rèn)無(wú)圓形細(xì)胞，計(jì)數(shù)精子密度。

（二）精子總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

根據(jù)精子密度取1×1 07精子懸液，室溫12 000×g，離心2 min，棄上清，精子沉淀用RNeasy Mini Kit 提取RNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。RNA 提取主要步驟：精子沉淀加入600μL提取緩沖液RLT，用吸管尖頭反復(fù)吹打30s，反復(fù)通過(guò)20G一次性注射器針頭10次剪切DNA；加入等體積70%乙醇，吹打混勻后移至吸附柱10 000×g，室溫離心30 s，棄洗脫液；加700μL漂洗緩沖液RW1至吸附柱，10 000×g，室溫離心30 s， 棄洗脫液；加500μL漂洗緩沖液RPE至吸附柱，10 000×g，室溫離心30 s，棄洗脫液；加500μL漂洗緩沖液RPE至吸附柱，12 000×g，室溫離心2 min，棄洗脫液；加30μL RNase-free水（用前預(yù)熱至70℃）至吸附柱的膜上，12 000×g，室溫離心1 min，收集管中洗脫所得即為細(xì)胞總RNA。取5μL RNA，用UA-1800核酸測(cè)定儀測(cè)定其純度和含量，剩余RNA參照試劑盒方法馬上逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA作為模板用于熒光定量擴(kuò)增。

（三）熒光定量PCR

參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒方法及PCR儀使用方法，實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)體系為：上、下游引物各1.2μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 15μL，cDNA 2μL，補(bǔ)RNase- free水至30μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性60s；95℃15s，59℃20s，72℃45s，共45個(gè)循環(huán)，其中72℃45s階段采集熒光。內(nèi)參β-Actin、TASK-1和TRAAK基因引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。TASK-1、TRAAK mRNA的表達(dá)采用△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。△△Ct=（實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值﹣對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值）﹣（實(shí)驗(yàn)組待測(cè)基因Ct值﹣對(duì)照組待測(cè)基因Ct值）?；虻谋磉_(dá)差異為：2﹣△△Ct。2﹣△△Ct＞2為表達(dá)上調(diào)，2﹣△△Ct＜0.5為表達(dá)下調(diào)，2＞2﹣△△Ct＞0.5為表達(dá)無(wú)明顯變化。

表1 PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以x±s表示，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TASK-1基因在正常對(duì)照組和弱精子癥組中的相對(duì)表達(dá)量

正常對(duì)照組樣本20例和弱精子癥組樣本30例，TASK-1 mRNA的表達(dá)水平如表2所示?？梢钥闯鋈蹙影Y樣本TASK-1 mRNA的表達(dá)水平較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

二、TRAAK基因在正常對(duì)照和弱精子癥組中的相對(duì)表達(dá)量

正常對(duì)照組樣本20例和弱精子癥組樣本30例，TRAAK mRNA的表達(dá)水平如表3所示?？梢钥闯鋈蹙影Y樣本TRAAK mRNA的表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。

表2 正常對(duì)照組和弱精子癥組中TASK-1 mRNA的表達(dá)量（

表2 正常對(duì)照組和弱精子癥組中TASK-1 mRNA的表達(dá)量（

與正常對(duì)照組比較，△P＞0.05，△Ct值=待測(cè)基因Ct值﹣內(nèi)參基因Ct值

組別 n Ct (TASK-1) Ct (β-Actin) △Ct △△Ct 2﹣△△Ct對(duì)照組 20 24.35±0.87 20.95±1.02 3.38±0.93 0±0.93 1弱精癥組 30 24.75±1.0 21.53±0.91 3.22±0.84△0.16±0.84 0.9

表3 正常對(duì)照組和弱精子癥組中TRAAK mRNA的表達(dá)量

表3 正常對(duì)照組和弱精子癥組中TRAAK mRNA的表達(dá)量

與正常對(duì)照組比較，﹡P＜0.05，△Ct值=待測(cè)基因Ct值﹣內(nèi)參基因Ct值

組別 n Ct (TRAAK) Ct (β-Actin) △Ct △△Ct 2﹣△△Ct對(duì)照組 20 29.33±2.07 20.95±1.02 8.38±2.24 0±2.24 1弱精癥組 30 28.66±1.98 21.53±0.91 7.12±2.04*1.26±2.04 0.42

討 論

不孕不育的診斷和治療在臨床上已經(jīng)廣泛開展，其中弱精子癥是男性不育的主要原因之一，它的病因和病理復(fù)雜多樣，但其顯著特征是精子運(yùn)動(dòng)能力下降。對(duì)弱精子癥的探討也成為學(xué)者近年來(lái)研究的重要課題。為了深入了解弱精子癥的發(fā)病機(jī)制，人們從分子水平進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了一些與弱精子癥相關(guān)的基因和蛋白，如基因tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP4、SEPT4、Smcp，蛋白ACTB、ANXA5、PRM1、PRM2、SABP等均被證實(shí)與弱精子癥的發(fā)生有關(guān)[8]，其中大部分與鞭毛的軸絲、線粒體、外周致密纖維相關(guān)，但在很大程度上精子動(dòng)力缺陷的確切分子機(jī)制仍不明朗。離子通道可以使精子適應(yīng)不斷變化的微環(huán)境，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)、精子活化、頂體反應(yīng)及受精過(guò)程中的趨卵運(yùn)動(dòng)十分重要。作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在精子質(zhì)膜上，Ca2+信號(hào)通過(guò)質(zhì)膜上Ca2+相關(guān)通道來(lái)調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，這些通道均被證實(shí)存在于精子尾部鞭毛上，在精子運(yùn)動(dòng)調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用[9]。其中CatSper通道在精子運(yùn)動(dòng)、精子超活化和受精中的作用已有較好的研究，是目前公認(rèn)的哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞上最重要的Ca2+通道[10]。作為CRISPs家族中激素非依賴性,且唯一特異性表達(dá)于睪丸的蛋白，CRISP2定位于精子頂體和尾部的外致密纖維鞘，它通過(guò)RyR受體調(diào)控Ca2+通道的活性,參與精子鞭毛運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)、頂體反應(yīng)和精卵融合等過(guò)程[11]。K+通道在精子獲能及頂體反應(yīng)的誘發(fā)中也起著舉足輕重的作用。其中Slo3是精子特異性K+通道，是生理?xiàng)l件下在精子中起主要作用的K+通道，人和小鼠的Slo3具有組織特異性，均只在睪丸和精子中表達(dá)，它介導(dǎo)成熟精子產(chǎn)生pH依賴性鉀電流，調(diào)控與細(xì)胞膜電位相關(guān)的信號(hào)過(guò)程，從而影響雄性生育[12]。作為K2P家族的成員，TASK-1通道對(duì)缺氧和pH值變化敏感，參與了呼吸的化學(xué)調(diào)控[13]，能夠調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮[14]，參與形成心肌動(dòng)作電位平臺(tái)期[15]，調(diào)節(jié)醛固酮分泌[16]，還是許多麻醉劑的靶標(biāo)[17,18]；TRAAK通道可以被多不飽和脂肪酸、機(jī)械張力、細(xì)胞內(nèi)堿性條件所激活[19]，在病理狀態(tài)下對(duì)腦缺血提供一種保護(hù)機(jī)制[20]。Chow等[21]通過(guò)免疫印跡和免疫熒光分析附睪的精子樣本，第一次證實(shí)K2P通道TASK-2、REK-1和TRAAK在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的精子中有表達(dá)，并且K2P受體激動(dòng)劑二十二碳六烯酸使表達(dá)增強(qiáng)，拮抗劑釓使表達(dá)減弱。Hur等[22]首次證明K2P通道在牛生殖器官和生殖細(xì)胞的表達(dá)，KCNK3、KCNK9、KCNK2、KCNK10、KCNK4在卵巢中、睪丸、卵母細(xì)胞、胚胎和精子中均有表達(dá)，其中KCNK10、KCNK4在卵母細(xì)胞細(xì)上有高表達(dá)，KCNK3、KCNK4在精子頭部高表達(dá)。這些均提示K2P通道可能介導(dǎo)生殖細(xì)胞的背景K+電導(dǎo)并調(diào)節(jié)其各種生理過(guò)程，如發(fā)生、成熟和受精。然而，目前并沒有K2P通道在人精子上表達(dá)的報(bào)道。為了研究K2P通道是否在精子中表達(dá)及弱精子癥的發(fā)生是否與K2P通道有關(guān)，我們選取了K2P通道中的亞類TASK-1、TRAAK作為研究，通過(guò) RT- PCR證實(shí)，TASK-1、TRAAK mRNA在成熟精子中均有表達(dá)，與正常男性相比，弱精子癥患者精子中TRAAK表達(dá)明顯下降，但TASK-1的表達(dá)沒有變化。由此可以推斷，弱精子癥患者精子中TRAAK表達(dá)的下降，可能會(huì)導(dǎo)致精子活力低下。然而，考慮到TREK-1、TREK-2 和TRAAK結(jié)構(gòu)和功能的相似性，其中一種K2P表達(dá)的改變可能導(dǎo)致其他K2P表達(dá)的變化，因此同時(shí)檢測(cè)三者在弱精子癥患者精子中的表達(dá)差異可能優(yōu)于單個(gè)指標(biāo)。另外，雖然研究結(jié)果表明TRAAK mRNA在弱精子癥患者較正常人表達(dá)下調(diào)約2.3倍（P＜0.05） ，但由于生物體內(nèi) mRNA的表達(dá)與蛋白質(zhì)表達(dá)程度往往是不一致的，而真正生物學(xué)功能的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，因此后續(xù)我們會(huì)采用 Western印跡技術(shù)在蛋白水平上對(duì)TRAAK進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。總之，TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達(dá)下降，可能是導(dǎo)致精子活力低下的原因之一，但是還需對(duì)TRAAK的表達(dá)下調(diào)的機(jī)制以及K2P之間的相互作用作進(jìn)一步的深入研究。K2P在男性生殖中可能起著十分重要的作用。TRAAK可能是弱精子癥發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要分子靶標(biāo)，值得進(jìn)一步深入研究。

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（2016-07-08收稿）

Expression of K2P channel TASK-1, TRAAK in the ejaculated sperm of asthenozoospermic men*

Fan Wen1, Fang Shengying1, Zhou Hui2**, Mei Hongbin11. YouFu Hospital of Wuhan City, Wuhan 430022, China; 2 Centre of Reproductive Medicine and Family Planning Research
Institute, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Zhou Hui, E-mail: zhouhui10191@sina.com

ObjectiveTo investigate the expression level of K2P channel TASK-1, TRAAK in the sperm cells and the role of TASK-1, TRAAK in the pathogenesis of asthenozoospermia.MethodsSemen samples were collected from 20 normal controls and 30 asthenozoospermia patients and purified using Percoll discontinuous density gradients; after extracted the total RNA, the relative expressions of TASK-1, TRAAK mRNA were detected in the two groups by RT- PCR, SYBR Green real- time PCR.ResultsTASK-1, TRAAK mRNA were expressed in the sperm cells both in the normal control group and the asthenozoospermia patient group; the expression of TRAAK mRNA was down- regulated by 2.3 times in the asthenospermia patients, signifcantly lower than in the normal control group (P<0.05), while, there was no signifcant difference of TASK-1 mRNA in the two groups (P>0.05).ConclusionThe down- regulation of TRAAK mRNA in the sperm of asthenospermia patients may be related with decreased sperm motility, which suggests that TRAAK may serve as a potential molecular target for the research of asthenospermia．

K2P channel; asthenozoospermia; reverse transcriptase polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.002

R 698.2

資助：本課題受湖北省衛(wèi)生計(jì)生科研項(xiàng)目基金資助（WJ2015MB254）

**通訊作者，E-mail: zhouhui10191@sina.com