調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的表達(dá)及臨床意義

陳艷蓉　肖　瑤　劉　彥　王夢(mèng)然　張　建

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心內(nèi)科，北京　100050)

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調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的表達(dá)及臨床意義

陳艷蓉肖瑤劉彥王夢(mèng)然張建

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心內(nèi)科，北京100050)

〔摘要〕目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、輔助性T細(xì)胞(Th17)的表達(dá)及臨床意義。方法按隨機(jī)數(shù)字法將80只大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組各40只，分別測(cè)定兩組大鼠肺功能，包括用力肺活量(FVC)、0.3 s用力呼氣容積(FEV 0.3)、用力呼氣峰值流速(PEF)、FEV0.3/FVC以及炎性因子，包括白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-17、IL-1β、IL-35以及IL-10水平，并檢測(cè)肺組織IL-17、FoxP3及外周血Treg水平。結(jié)果模型組大鼠日漸少動(dòng)、皮毛無(wú)光澤、大便稀、呼吸急促，有咳嗽、痰鳴音和分泌物；對(duì)照組大鼠則正?；顒?dòng)和呼吸。模型組大鼠FEV0.3、FVC、PEF、FEV0.3/FVC較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-1β水平較對(duì)照組顯著升高，而IL-10及IL-35水平顯著降低(P<0.001)；模型組肺組織中FoxP3的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，而IL-7相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，且模型組外周血Treg水平顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。結(jié)論COPD病變存在高炎性反應(yīng)，與Th17和Treg表達(dá)失衡，調(diào)節(jié)功能降低，以致炎性反應(yīng)進(jìn)一步加重有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕慢性阻塞性肺疾??；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Th17細(xì)胞

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)中的常見病變〔1〕。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)屬于控制機(jī)體自身免疫反應(yīng)的一類細(xì)胞亞群，與自身免疫性疾病有密切關(guān)系〔2〕。輔助性T細(xì)胞(Th17)是新發(fā)現(xiàn)的一種可分泌白細(xì)胞介素(IL)-17的T細(xì)胞亞群，對(duì)自身免疫病變、機(jī)體防御等方面有重要作用。Th17和Treg在體內(nèi)免疫環(huán)境中具有重要的維持作用，且兩者在分化過(guò)程中能相互一致，任意一種表達(dá)失衡都可能導(dǎo)致局部甚至全身性異常免疫變化，導(dǎo)致一系列免疫性疾病、感染、腫瘤等〔3〕，本研究分析Treg、Th17在COPD模型大鼠中的表達(dá)及意義。

1材料與方法

1.1材料80只雄性大鼠，鼠齡6個(gè)月，重量170～200 g，平均(183±12)g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK(遼)2008-2002，清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。將大鼠按照編號(hào)分為模型組和對(duì)照組各40只。

1.2建模方法COPD改良法建立起動(dòng)物模型，并于試驗(yàn)開始的第1、14天采用6%的水合氯醛麻醉成功后，暴露大鼠氣管并注入200 μl(1 mg/ml)脂多糖(由美國(guó)Sigma公司提供，批號(hào)為20100109558)。第2天將模型大鼠放入煙室內(nèi)，以香煙絲10支(紅三環(huán)牌，滁州卷煙廠生產(chǎn)，每支焦油含量為11 mg，尼古丁為0.8 mg)、鋸末50 g混合后點(diǎn)燃煙熏，1次/d，30 min/次，造模周期為28 d。

1.3方法

1.3.1觀察大鼠生長(zhǎng)情況每天對(duì)大鼠活動(dòng)情況、精神、大便、反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)變化(是否咳嗽、有無(wú)痰鳴音、呼吸道分泌物)等情況進(jìn)行觀察和記錄。

1.3.2大鼠肺功能測(cè)定采用動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司，型號(hào)為AniRes2003)測(cè)定大鼠用力肺活量(FVC)、0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)、用力呼氣峰值流速(PEF)以及FEV0.3/FVC。測(cè)定方法：以10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)經(jīng)大鼠腹腔注射行麻醉，成功后由經(jīng)氣管插管，將大鼠放置到體描箱中，頭置于低位，連接呼吸機(jī)行機(jī)械通氣法測(cè)定肺功能。測(cè)定時(shí)采用外加壓力法使之深吸氣和深呼氣，以確保能快速、準(zhǔn)確測(cè)定出各項(xiàng)肺功能指標(biāo)。

1.3.3大鼠炎性因子水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定建模28 d后血清炎性因子，包括IL-6、IL-17、IL-1β、IL-35以及IL-10水平，由經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。方法：采用包被緩沖液將IL-6、IL-17、IL-1β、IL-10及IL-35捕獲抗體(均由美國(guó)RD公司提供)稀釋為適宜濃度；各凹孔分別加入稀釋抗體100 μl，室溫條件下孵育2 h；結(jié)束后移除包被液，并采用0.05%吐溫-20洗滌緩沖液對(duì)凹孔清洗2次；再次分別加封閉液300 μl，經(jīng)室溫下孵育1 h后倒出殘留液，300 μl洗滌液清洗2次；各凹孔再分別加入稀釋生物素化檢測(cè)抗體100 μl，37℃條件下孵育1 h；倒出洗滌液，連續(xù)重復(fù)3次。每凹孔增加稀釋后的堿性磷酸酶標(biāo)記特異性抗體溶液100 μl，室溫下孵育1 h；倒出殘余液體后進(jìn)行3次洗滌；洗滌液浸泡5min;倒出液體于各凹孔倒入洗滌液進(jìn)行洗滌，連續(xù)洗滌5次；各孔加入底物200 μl；室溫下顯色30 min，后于凹孔中加入0.05 ml H2SO4，并采用酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK公司提供，型號(hào)ELX800)波長(zhǎng)約410 mm測(cè)定IL-6、IL-17、IL-1β、IL-10及IL-35光密度(OD值)。

1.3.4大鼠肺組織IL-17、FoxP3的表達(dá)建模完成28 d后以鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)由專業(yè)人員根據(jù)相關(guān)試劑盒的操作說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行。方法：①首先制作肺組織切片：于大鼠右肺取組織以10%甲醛48 h固定，對(duì)右肺上葉和肺門組織進(jìn)行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋等常規(guī)處理后，制成5 μm厚度的切片；再對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、脫水、染色和中性樹膠封片等常規(guī)處理，后備用。②表達(dá)情況測(cè)定：將IL-17、FoxP3單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司提供，批號(hào)為SC-165)按照1∶200進(jìn)行稀釋，在各肺組織切片中人選擇一張，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)0.01 mol/L代替一抗染色，作為陰性對(duì)照。在切片中選5個(gè)視野，以細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中有黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。免疫組化染色半定量測(cè)定：采用由美國(guó)Image-pro plus公司提供的專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析，以積分光密度(IOD)來(lái)表示肺組織中IL-17、FoxP3的蛋白表達(dá)情況，IOD越高蛋白表達(dá)越高(IOD為面積密度和平均光密度的乘積)。

1.3.5大鼠外周血Treg水平檢測(cè)建模成功28 d后，取100 μl新鮮血液按照每管106個(gè)細(xì)胞分別加入1.0 μg CD25單抗(美國(guó)BD公司提供，批號(hào)132004)、0.25 μg CD4單抗(美國(guó)BD公司提供，批號(hào)110240)，避光約0.5 h后加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，再避光約20 min。后以PBS清洗2遍，離心后除去上清液，采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter，型號(hào)Epicsel XL)對(duì)Treg表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠體征觀察外觀：對(duì)照組大鼠均活潑好動(dòng)，全身皮毛有光澤、食量正常，體重均漸漸增高；模型組大鼠日漸蜷伏、少動(dòng)、拱背、蜷臥、食量減少，毛不具有光澤、易脫落，大便溏稀、體重與對(duì)照組相比較低。呼吸：對(duì)照組大鼠呼吸較為平穩(wěn)，呼吸道內(nèi)無(wú)分泌物，無(wú)痰鳴音；模型組大鼠則呼吸急促、口鼻流出明顯分泌物，不時(shí)聞及痰鳴音、咳嗽，且隨著入組時(shí)間的加長(zhǎng)，癥狀漸漸加重。

2.2兩組大鼠肺功能指標(biāo)比較模型組大鼠FEV0.3、FVC、PEF、FEV0.3/FVC較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，見表1。

2.3兩組大鼠炎性因子水平比較模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-1β水平較對(duì)照組顯著升高，而IL-10及IL-35水平顯著降低(P<0.001)，見表2。

表1　兩組大鼠肺功能指標(biāo)比較

表2　兩組大鼠模型血清炎性因子水平比較

2.4兩組肺組織中IL-7、FoxP3和外周血中Treg水平比較模型組肺組織中FoxP3的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，而IL-7相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，且模型組外周血Treg水平顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，見表3。

表3　兩組大鼠模型肺組織中IL-7、FoxP3表達(dá)情況和

3討論

COPD作為一種全身性病變，不僅累及呼吸系統(tǒng)，而且病程進(jìn)展過(guò)程中對(duì)全身器官、相關(guān)系統(tǒng)均有不良影響〔4〕。COPD病機(jī)較為復(fù)雜，早期研究認(rèn)為巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞是導(dǎo)致COPD炎性反應(yīng)的主要細(xì)胞，但隨著近年來(lái)研究的不斷深入已證實(shí)，T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致的炎性反應(yīng)以及自身免疫均是激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的關(guān)鍵〔4〕。由于二氧化碳潴留、低氧以及反復(fù)性感染等導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處于應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)了下丘腦-垂體-腎上腺髓質(zhì)軸的過(guò)度興奮，提高了胰高糖素、糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺等分解激素的水平，胰島素釋放被抑制，進(jìn)而發(fā)生胰島素抵抗(IR)，造成血糖增高現(xiàn)象〔5〕。這不僅增加了機(jī)體能量消耗，還對(duì)病患呼吸肌力量、免疫功能等造成損傷，引起毛細(xì)血管閉塞、肺小動(dòng)脈硬化等，進(jìn)而形成死腔樣通氣，肺通氣/血流失衡，氧合指數(shù)顯著降低，局部組織嚴(yán)重缺氧，最終形成惡性循環(huán)〔6〕。

研究顯示，香煙所參與的激活T細(xì)胞并介導(dǎo)相應(yīng)免疫應(yīng)答，對(duì)COPD的氣道炎性反應(yīng)具有持續(xù)性進(jìn)展作用〔7〕。本研究與相關(guān)文獻(xiàn)〔8〕報(bào)道結(jié)果一致，證實(shí)COPD大鼠模型肺功能降低后，肺組織中FoxP3表達(dá)降低，其免疫調(diào)節(jié)作用降低，難以抑制機(jī)體收到的炎性刺激，進(jìn)而導(dǎo)致COPD肺功能持續(xù)性降低，這也可能是臨床上COPD患者出現(xiàn)肺氣腫的原因〔9〕。

Treg作為一組CD4T細(xì)胞亞型，以負(fù)免疫調(diào)節(jié)功能為主，可介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、加強(qiáng)免疫耐受性，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)。Treg表達(dá)異常與多種慢性炎性病變、自身免疫性疾病均有密切關(guān)系〔10〕。Treg細(xì)胞免疫機(jī)制主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：①細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴性機(jī)制，也是Treg主要作用機(jī)制，CD4+CD25+Treg通過(guò)效應(yīng)T細(xì)胞的該作用機(jī)制對(duì)T細(xì)胞增殖、IL-2轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)行抑制〔11〕；②抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制，目前普遍認(rèn)為IL-2、IL-10等因子在Treg細(xì)胞抑制功能中有重要作用；③通過(guò)與抗原呈遞細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。王華英等〔1〕提出了Treg/Th17平衡的新理論。Th17能特異性分泌出IL-17，將中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞向炎性組織聚集，加重炎性反應(yīng)。Treg則可抑制炎癥反應(yīng)，以維持免疫穩(wěn)定性。兩者通過(guò)相互抑制、拮抗，促使內(nèi)環(huán)境維持在相對(duì)平衡的狀態(tài)〔12〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)了COPD導(dǎo)致炎性反應(yīng)，Treg、Th17的表達(dá)明顯失衡〔13〕。COPD的肺功能與Treg、Th17表達(dá)情況密切相關(guān)，且Treg、Th17在免疫調(diào)節(jié)中有相互抑制、拮抗作用。當(dāng)Treg、Th17表達(dá)失衡，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能降低，則導(dǎo)致炎性反應(yīng)加重。因此臨床檢測(cè)二者有助于針對(duì)病情制定科學(xué)、有效的治療方案，值得進(jìn)一步研究。

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〔2015-06-11修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

第一作者：陳艷蓉(1980-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)，呼吸病學(xué)方面的研究。

〔中圖分類號(hào)〕R563

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2078-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.013

通訊作者：張建(1955-)，男，主任醫(yī)師，主要從事老年病，呼吸病學(xué)方面的研究。