雷沙吉蘭對(duì)乳胞素誘導(dǎo)帕金森病大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制

鮑　波　朱少平　胡　利　冷　揚(yáng)　蘇小華　柴星星

(廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，廣東　湛江　524023)

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雷沙吉蘭對(duì)乳胞素誘導(dǎo)帕金森病大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制

鮑波1朱少平1胡利2冷揚(yáng)1蘇小華柴星星

(廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，廣東湛江524023)

〔摘要〕目的觀察雷沙吉蘭對(duì)乳胞素誘導(dǎo)帕金森病(PD)大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制。方法SD大鼠分為空白對(duì)照組、模型組、雷沙吉蘭預(yù)治療組和治療組，通過(guò)立體定向注射乳胞素至模型大鼠左側(cè)黑質(zhì)部位誘導(dǎo)模型，進(jìn)行行為學(xué)、組織病理學(xué)檢測(cè)，PCR檢測(cè)目的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果模型大鼠在阿樸嗎啡的誘導(dǎo)下，向右旋轉(zhuǎn)；與空白對(duì)照組相比，其余各組大鼠腦組織切片中酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，但預(yù)治療組和治療組中TH陽(yáng)性細(xì)胞較多； PCR定量顯示Lamp2A與熱休克蛋白(HSP)70在治療組與空白組間存在差異(P<0.05)，而治療組間無(wú)差異。 結(jié)論雷沙吉蘭可以抵抗乳胞素所致的神經(jīng)損害，改善動(dòng)物行為學(xué)及組織病理學(xué)表現(xiàn)，具有神經(jīng)保護(hù)作用， 其機(jī)制可能與促進(jìn)Lamp2A及HSP 70表達(dá)，減少TH陽(yáng)性細(xì)胞丟失相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕帕金森??；乳胞素；雷沙吉蘭；自噬

帕金森病(PD)是一種不可治愈的、伴隨多巴胺能神經(jīng)元逐步變性而不斷演進(jìn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔1〕，常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、肌強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)障礙，目前常用藥物替代體內(nèi)逐漸減少分泌的多巴胺，減緩PD的運(yùn)動(dòng)癥狀，但需要長(zhǎng)期服藥，并逐漸加大藥物劑量，導(dǎo)致更多的副作用，因此需要改變替代策略，以減輕各種運(yùn)動(dòng)及精神癥狀〔2〕。在體內(nèi)、體外及臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)〔3〕，雷沙吉蘭不僅能明顯改善PD癥狀，而且具有能延緩PD進(jìn)程的作用，其保護(hù)神經(jīng)元的作用受到濃度及代謝產(chǎn)物等因素影響，機(jī)制比較復(fù)雜〔4,5〕。蛋白酶體抑制劑乳胞素被用于構(gòu)建PD大鼠模型〔6〕，可以較好地模擬PD病理改變〔7〕。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)乳胞素腦立體定位注射法構(gòu)建大鼠PD模型，并觀察雷沙吉蘭能否對(duì)抗乳胞素引起的多巴胺能神經(jīng)元損傷，以探討其可能的作用機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物SPF級(jí)健康成年SD大鼠48只，體重250～300 g，雌雄各半，來(lái)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SCXK(粵)2008-0008〕。乳胞素(L6785，Sigma公司)、阿樸嗎啡(A4393，Sigma公司)；雷沙吉蘭和水合氯醛為國(guó)產(chǎn)試劑；抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體(單抗，R&D公司)；抗α-synulein抗體(單抗，Cell Signaling 公司)；DAB試劑盒(中杉金橋)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；PCR擴(kuò)增試劑盒(Takara公司)。大鼠腦立體定位儀(ZH-藍(lán)星C型，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；凝膠成像儀(InGemus LHR型，Syngene公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模將SD大鼠標(biāo)記后隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組、模型組、預(yù)治療組和治療組，各12只。按每只每公斤體重300～350 mg水合氯醛腹腔注射麻醉，利用腦立體定位儀在左側(cè)黑質(zhì)部位注射含8 μg乳胞素的二甲基亞砜(DMSO)溶液2 μl?？瞻讓?duì)照組SD大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射DMSO 2 μl。給予預(yù)治療組及治療組中每只大鼠腹腔注射雷沙吉蘭(使用DMSO溶解)，劑量為0.15 mg/kg，1次/d；分別在造模前1 d和造模后1 w〔8〕開(kāi)始給藥?？瞻讓?duì)照組和模型組給予生理鹽水腹腔注射作為對(duì)照。

1.2.2行為學(xué)檢測(cè)觀察SD大鼠是否出現(xiàn)被毛雜亂、身體屈曲、活動(dòng)遲緩、震顫、抓握等異常行為，同時(shí)采用阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)行為學(xué)改變〔9〕：每只SD大鼠給予頸部皮下注射阿樸嗎啡0.5 mg/kg，3 min后，開(kāi)始計(jì)時(shí)并記錄30 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)，以每分鐘旋轉(zhuǎn)7轉(zhuǎn)及半小時(shí)旋轉(zhuǎn)210轉(zhuǎn)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算達(dá)標(biāo)只數(shù)。手術(shù)前1 d進(jìn)行第1次，手術(shù)后第6、13天和20天分別進(jìn)行第2、3次和四次阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)所有RNA操作用品均用0.1%DEPC水處理，用于RNA的試劑均用DEPC處理的水配制。使用Trizol試劑盒提取中腦組織細(xì)胞總RNA，測(cè)量總RNA的A260、A280及A260/A280，計(jì)算其總RNA的濃度和純度。用二步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳顯色，凝膠圖像分析軟件進(jìn)行電泳區(qū)帶的灰度掃描，計(jì)算各組指標(biāo)的目的條帶/內(nèi)參的灰度比值。各引物如表1。

表1　引物序列

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)所有大鼠在手術(shù)后第20天完成行為學(xué)檢測(cè)后處死，取左側(cè)黑質(zhì)固定后作連續(xù)病理切片，片厚4 μm。切片用抗TH單抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，先在10倍物鏡下選擇TH陽(yáng)性細(xì)胞密集區(qū)，然后在40倍物鏡放大倍數(shù)下進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)大鼠腦組織蠟塊的4張切片細(xì)胞數(shù)取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用同樣的方法對(duì)α-syn蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察其在大鼠中腦切片上是否有聚集現(xiàn)象及分布情況。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察所有大鼠在造模之前進(jìn)行的阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為中均未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為。模型組及治療組SD大鼠，在注射乳胞素后4 d，逐漸出現(xiàn)行為遲緩，對(duì)外界反應(yīng)變得遲鈍，出現(xiàn)弓背姿勢(shì)，部分出現(xiàn)自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。在注射乳胞素后第6天，檢測(cè)阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組中的大鼠沒(méi)有出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，而模型組及治療組中分別有4只和3只SD大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)，速度在7 r/min以上，旋轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)于10 min；預(yù)治療組中則未見(jiàn)到大鼠的誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為。注射乳胞素后第13天進(jìn)行阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照組沒(méi)有SD大鼠發(fā)生旋轉(zhuǎn)行為；模型組中有7只SD大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，旋轉(zhuǎn)所維持的時(shí)間均比上次測(cè)試有所增加；治療組有5只大鼠出現(xiàn)誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為，預(yù)治療組中有2只大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為(達(dá)到標(biāo)準(zhǔn))。在第20天進(jìn)行的旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)與第13天進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

2.2Lamp2A、HSP70 mRNA的表達(dá)水平結(jié)果分析Lamp2A平均吸光度比值各組間有顯著差異，治療組及預(yù)治療組平均吸光度比值較空白對(duì)照組及模型組均升高。HSP70平均吸光度比值各組間有顯著差異，治療組及預(yù)治療組平均吸光度比值較空白對(duì)照組及模型組均升高。見(jiàn)表2。

2.3α-syn染色結(jié)果模型組大鼠腦皮質(zhì)和中腦神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)到棕色的聚集成團(tuán)塊狀的小結(jié)，散在分布，治療組及預(yù)治療組中大鼠神經(jīng)元中聚集的α-syn蛋白比模型組中的聚集減少。

2.4TH免疫組織化學(xué)結(jié)果及分析圖1可見(jiàn)，空白對(duì)照組SD大鼠中，可見(jiàn)黑質(zhì)染成棕色，大體觀呈倒眉毛狀；高倍鏡下，棕色染色集中在胞質(zhì)和神經(jīng)突觸。對(duì)黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)元計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)注射乳胞素的各組大鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照〔(55.64±6.35)〕組顯著減少，治療組〔(34.79±3.16)〕及預(yù)治療組〔(42.38±3.08)〕中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組〔(19.96±2.31)〕多，使用雷沙吉蘭預(yù)治療組大鼠TH陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)較治療組多。

表2　各組SD大鼠Lamp2A及HSP70 mRNA表達(dá)

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0. 05，4)P<0.01

圖1　各組大鼠TH免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(DAB，×400)

3討論

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，PD等老年人高發(fā)的神經(jīng)變性疾病已經(jīng)成為一個(gè)重要的社會(huì)問(wèn)題〔10〕。目前PD的病因還不是十分清楚，遺傳和環(huán)境因素交互作用可能是主要的原因〔11〕。左旋多巴仍是目前治療的常用藥〔12〕，雷沙吉蘭也被認(rèn)為具有神經(jīng)保護(hù)作用而在臨床上協(xié)同左旋多巴進(jìn)行治療〔13〕。在體內(nèi)、體外及臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)〔3〕，雷沙吉蘭不僅能明顯的改善PD癥狀，而且具有能延緩PD進(jìn)程的作用。結(jié)構(gòu)分析顯示，其神經(jīng)保護(hù)作用活性來(lái)自于藥物的炔丙基胺〔14〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用雷沙吉蘭治療組SD模型大鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與預(yù)治療組有減少，模型組中TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與治療組相比顯著減少，給予雷沙吉蘭預(yù)治療比治療可以更有效地保護(hù)神經(jīng)元，延緩多巴胺能神經(jīng)元的凋亡進(jìn)程，也提示早期給予雷沙吉蘭能夠保護(hù)神經(jīng)元。最近研究表明，PD的發(fā)病機(jī)制之一是細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤蛋白聚積。已確定α-syn的聚積促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)元的丟失〔15〕。伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬(CMA)可能參與調(diào)節(jié)多種與神經(jīng)元功能相關(guān)的蛋白，其活性的改變也許與PD動(dòng)物模型及PD病人的發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔16〕。Lamp2A是CMA途徑的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)量的增加表明CMA作用增強(qiáng)〔17〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷沙吉蘭能促進(jìn)HSP70及Lamp2A的表達(dá)。HSP70蛋白與靶蛋白的KFERQ序列結(jié)合后，將識(shí)別的底物輸送至溶酶體表面與Lamp2A結(jié)合，形成溶酶體HSP轉(zhuǎn)位復(fù)合物，進(jìn)入溶酶體內(nèi)腔，迅速被降解〔18〕。CMA降解蛋白的作用在雷沙吉蘭藥物的作用下增強(qiáng)。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010B060500015)

〔中圖分類號(hào)〕R742.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2065-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.007

1廣東醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室

2廣東醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室

第一作者：鮑波(1968-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理研究。