血府逐瘀湯對心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關基因GATA4、NKx2.5調控作用的研究

周　菁，張　焱，張　倩，鄧中龍，朱巖峰

(上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437)

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血府逐瘀湯對心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關基因GATA4、NKx2.5調控作用的研究

周菁，張焱，張倩，鄧中龍，朱巖峰

(上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437)

[摘要]目的觀察血府逐瘀湯對心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關基因GATA4、NKx2.5的調控作用。方法采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支方法建立心肌梗死模型，將成模大鼠隨機分為模型組和血府逐瘀湯組，每組30只。另選擇同月齡健康SD大鼠10只作為假手術組。模型組給予生理鹽水2 mL/次灌胃，血府逐瘀湯組給予濃煎血府逐瘀湯2 mL/次灌胃，均1次/d。采用RT-PCR方法檢測3組大鼠干預1 d、10 d、15 d心肌組織中GATA4、Nkx2.5mRNA表達水平。結果干預1d后，模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量均明顯低于假手術組(P均<0.05)；干預10 d后，模型組和血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量與假手術組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量和血府逐瘀湯組GATA4mRNA表達量均明顯高于干預1 d后(P均<0.05)；干預15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量均明顯高于假手術組(P均<0.05)。干預1 d、10 d、15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量均較模型組有所升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結論大鼠心肌梗死后，其心肌組織中GATA4、Nkx2.5mRNA表達量呈現先下降、再升高的趨勢。血府逐瘀湯可發(fā)揮一定的促進心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關基因GATA4、NKx2.5表達增加的作用，該作用可能是祛瘀中藥促進梗死后心肌組織迅速修復、愈合的機制之一。

[關鍵詞]血府逐瘀湯；心肌梗死；GATA4；Nkx2.5

我國目前聯(lián)用西藥及中藥綜合治療冠心病心肌梗死的方案很普遍。冠心病心肌梗死相當于祖國醫(yī)學“胸痹心痛”“真心痛”范疇，而“胸痹心痛”“真心痛”以血瘀、痰濁作為標實的特點已得到廣泛認可。臨床上中醫(yī)藥專家針對冠心病“真心痛”的防治多從祛瘀化痰著手，且取得較好臨床療效[1-3]，但有關祛瘀中藥對梗死后心肌發(fā)育相關基因調控作用的實驗研究卻相對較少。本研究選用《醫(yī)林改錯》記載之血府逐瘀湯為代表方，觀察了該方對急性心肌梗死大鼠心肌組織中心肌發(fā)育相關基因GATA4、NKx2.5mRNA表達的影響，現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1動物雄性SD大鼠70只，清潔級，體質量(250±20)g。北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：11400700038123。

1.2藥物血府逐瘀湯，組方：當歸9 g、生地9 g、 桃仁12 g、紅花9 g、枳殼6 g、赤芍6 g、柴胡3 g、甘草3 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g、牛膝10 g。自動煎藥機統(tǒng)一煎藥，控制時間及加水量，濃煎至生藥含量為1 g/mL。

1.3試劑及儀器Trizol(Invitrogen)；二乙基焦碳酸酯(DEPC，國藥)；引物合成(Invitrogen)；無水乙醇、氯仿、滅菌的DEPC 水、PCR master mix、逆轉錄試劑盒等(Biotnt)。微型離心機，GyroSpin(GYROZEN)；旋渦混合器，GL-88B(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；恒溫金屬浴，HB-100(杭州博日科技有限公司)；qPCR儀，ViiA7(life technology(ABI))；離心機，TDL-80-2B(飛鴿牌)；超細勻漿器，F6/10-6G(FLUKO(上海)流體機械制造有限公司)；移液器，10 μL/200 μL /1 000 μL(Dragonlab)。

1.4造模及給藥方法參考文獻[4-5]報道的造模方法，結扎大鼠左冠狀動脈前降支。結扎前后記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖，以結扎部位以下心肌變蒼白、搏動減弱且出現J點明顯抬高為造模成功。術后將存活大鼠隨機分為模型組和血府逐瘀湯組，每組30只。另選取預留的10只健康雄性SD大鼠作為假手術組。模型組給予生理鹽水2 mL/次灌胃，血府逐瘀湯組給予血府逐瘀湯2 mL/次灌胃，均1次/d。

1.5心肌組織中GATA4、Nkx2.5mRNA檢測方法分別于干預1 d、10 d、15 d后每組各處死10只大鼠，取心肌組織，以β-actin為內參，從心肌組織中提取總RNA。以提取出的mRNA進行逆轉錄，成為cDNA模板進行RT-PCR實驗。擴增條件95 ℃ 5 min→95 ℃ 15 s→ 60 ℃ 30 s(讀熒光)→95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s(0.3 ℃/s)；95 ℃ 15 s，共進行40個循環(huán)。

2結果

干預1 d后，模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量均明顯低于假手術組(P均<0.05), 血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量有低于假手術組的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；干預10 d后，模型組和血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量與假手術組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量和血府逐瘀湯組GATA4mRNA表達量均明顯高于干預1 d后(P均<0.05)；干預15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量均明顯高于假手術組(P均<0.05)。干預1 d、10 d、15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達量均較模型組有所升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠干預后不同時間點GATA4、NKx2.5mRNA表達量比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與干預1d比較，P<0.05。

3討論

急性心肌梗死是在冠狀動脈粥樣硬化病變狹窄的基礎上由急性血栓形成而導致血管閉塞，使心肌嚴重而持久缺血壞死的一種疾病。從中醫(yī)角度來講，急性心肌梗死的發(fā)生過程類似出現了瘀血內停、瘀滯不通的血瘀證，治宜活血化瘀。大多數專家推崇以“祛瘀生新”為治療指導原則，然而有關其“祛瘀”及“生新”的具體作用環(huán)節(jié)，現代實驗研究還不夠詳盡。張金生[6]認為“生新”層面包含“生新血、生新物、生新脈、化舊生新”4個方面。其中“生新物”是受損臟器“真氣”復生的過程，先天之精是新物再生的物質基礎。其提出活血化瘀的“生新”是機體“復其真氣”之新。而作為心肌梗死后的心肌細胞再生，也需要機體“真氣修復”。因此，針對梗死后的心肌組織，從調控心肌細胞發(fā)育的基因層面來研究將是很有啟發(fā)的。

Linke等[7]研究認為激活心臟原始細胞可顯著促進梗死后受損組織的修復，而心肌發(fā)育相關基因GATA4和Nkx2.5在促使心臟原始細胞分化成心肌細胞中起重要作用。國內有研究發(fā)現，在正常心肌中，基因GATA4、Nkx2.5有較強的表達；心肌梗死后，GATA4、Nkx2.5表達下降，7 d后又有所恢復[8]。體外實驗表明，Nkx2.5基因的表達可以啟動心肌的發(fā)生[9]。心肌梗死后，有Nkx2.5表達陽性的干細胞遷移到梗死灶，并且分化為心肌細胞[10]。這些研究說明心肌中Nkx2.5表達陽性的干細胞具有向心肌細胞分化的潛能。此外，Heineke等[11]研究發(fā)現，在鼠類心臟中特異性高表達GATA4可以增加心肌毛細血管和小血管密度，增強冠脈流量儲備和冠脈灌注依賴的心肌收縮力，提示GATA4可調控冠脈血管生成。GATA4還可以激活p19細胞的Nkx2.5啟動子。Nkx2.5和GATA4可協(xié)同作用誘導心肌分化[12]。

本研究結果發(fā)現，在急性心肌梗死后第1天，模型組大鼠GATA4、Nkx2.5mRNA表達水平均顯著下降，并在10 d后升高，提示心肌梗死可激活GATA4、Nkx2.5表達，與文獻[8]報道相符；予以血府逐瘀湯干預1 d、10 d、15 d后，大鼠心肌組織中的GATA4、Nkx2.5mRNA表達量均升高，雖然與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義，但仍提示血府逐瘀湯可能對梗死后大鼠的心肌發(fā)育相關基因GATA4、Nkx2.5表達具有正性促進作用。GATA4、Nkx2.5表達的增加在促使心臟原始細胞分化成心肌細胞及增加心肌毛細血管和小血管密度、調控冠脈血管生成中起到一定的作用，提示血府逐瘀湯可能是通過上調GATA4、Nkx2.5的表達來促進梗死后心肌組織迅速修復、愈合的。此外，本實驗結果也提示下一步可能需要通過適當延長血府逐瘀湯的干預時間或通過擴大樣本量來連續(xù)觀察梗死后大鼠心肌發(fā)育相關基因GATA4、Nkx2.5的表達趨勢，以獲得更有意義的實驗結果，為豐富中醫(yī)“祛瘀生新”的理論內涵提供機制支持。

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Regulatory effect of Xuefu Zhuyu decoction on GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction

ZHOU Jing, ZHANG Yan, ZHANG Qian, DENG Zhonglong, ZHU Yanfeng

(Yueyang Hospital of Integrative Chinese & Western Medicine Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200437, China)

Abstract:Objective It is to explore the regulatory effect of Xuefu Zhuyu decoction on gene GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction. Methods The left anterior descending coronary arteries of SD rats were ligated to establish rat models of myocardial infarction. All rats with myocardial infarction were divided into model group (n=30) and Xuefu Zhuyu decoction group (n=30).Anther 10 rats were selected as sham group (n=10).The rats in control group were treated with 2mL of 0.9% NaCl per day. The rats in Xuefu Zhuyu decoction group were treated with 2 mL of concentrated decoction per day. Treatment duration was also altered. There were three different duration of treatments specifically 1 day, 10 days, and 15 days. The levels of GATA4, Nkx2.5mRNA in myocardium were detected by RT-PCR. Results On the 1st day after myocardial infarction, the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in myocardial infarction model group were significantly decreased compared to those in the sham group (P<0.05). On the 10th day after myocardial infarction,the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in model group and Xuefu Zhuyu decoction group were not significantly increased compared to those in the sham group (P>0.05), but the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in model group and the expression of GATA4mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group on the 10th day were significantly increased compared to those in the sham group on the 1st day (P<0.05). On the 15th day after myocardial infarction,the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group were significantly increased compared to those in the sham group (P<0.05). On the 1st, 10th and 15th day after myocardial infarction, the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group were increased compared to those in the myocardial infarction model group, but there was not significant difference between the two groups(P>0.05).Conclusion Xuefu Zhuyu decoction may have a regulatory effect on gene GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction and this effect may be one of the genetic basis of accelerated myocardial cell repair.

Key words:Xuefu Zhuyu decoction; myocardial infarction; GATA4; Nkx2.5

[收稿日期]2016-01-05

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)14-1486-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.002

[基金項目]國家自然科學基金(青年基金)資助項目(81202668)

[作者簡介]周菁，女，中醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結合防治冠心病的研究。