全反式維甲酸增加胃癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性*

王艷萍， 趙先群， 張向東△， 許 威， 向曉輝

(1南陽(yáng)市中心醫(yī)院消化科， 河南 南陽(yáng) 473000； 2中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰脾疾病診療中心， 天津 300162)

·短篇論著·

全反式維甲酸增加胃癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性*

王艷萍1， 趙先群1， 張向東1△， 許 威2， 向曉輝2

(1南陽(yáng)市中心醫(yī)院消化科， 河南 南陽(yáng) 473000；2中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰脾疾病診療中心， 天津 300162)

目的： 研究全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901存活率與放射敏感性的影響，并討論其可能的機(jī)制。方法: MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞的放射敏感性和細(xì)胞周期；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB的mRNA表達(dá)。結(jié)果: ATRA可降低SGC-7901細(xì)胞存活率，當(dāng)濃度到達(dá)8 μmol/L時(shí)，抑制作用達(dá)到最大；ATRA聯(lián)合X射線處理后，與單純放射處理相比，平均致死劑量(D0)和準(zhǔn)閾劑量(Dq)顯著變小(P<0.05)，且擬合的生存曲線明顯下移；ATRA能顯著降低放射誘導(dǎo)的細(xì)胞G2/M期阻滯，下調(diào)SGC-7901細(xì)胞Bcl-2與survivin的mRNA表達(dá)(P<0.05)，上調(diào)Bax與NF-κB的mRNA表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論: ATRA能夠增加胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡及放射敏感性，可能與抑制細(xì)胞周期G2/M期的阻滯作用、下調(diào)Bcl-2與survivin mRNA表達(dá)和上調(diào)NF-κB與Bax mRNA表達(dá)有關(guān)。

全反式維甲酸； 放射治療； 胃癌細(xì)胞SGC-7901； 敏感性

胃癌是常見來源于胃黏膜上皮細(xì)胞的消化道惡性腫瘤。胃癌在全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤中排第4位，死亡率占所有惡性腫瘤的第2位[1]。在中國(guó)，胃癌的發(fā)病率很高，僅次于肺癌與肝癌，其中男性發(fā)病率高于女性。臨床數(shù)據(jù)表明，中國(guó)的胃癌患者確診時(shí)大部分已進(jìn)入III或IV期[2]，施行手術(shù)切除困難，獲得根治的比例很少，因此，在確診后進(jìn)行放療化療是對(duì)胃癌進(jìn)行綜合性治療的重要手段。然而，胃癌對(duì)放射治療敏感性低，可能是由于胃癌細(xì)胞對(duì)射線的敏感性低以及鄰近器官的耐受性低而致放射劑量受到限制，導(dǎo)致無法獲得理想的治療效果。

全反式維甲酸(all-transretinoic acid, ATRA)作為維生素A的主要代謝產(chǎn)物，主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞或惡性逆轉(zhuǎn)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抗腫瘤血管生成，達(dá)到抑制腫瘤惡化的作用，是一種誘導(dǎo)分化劑[3-5]。全反式維甲酸對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖具有抑制作用，與奧沙利鉑具有協(xié)同作用；其作用機(jī)制可能與Bcl-2和survivin蛋白下調(diào)有關(guān)[6]。全反式維甲酸作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞72 h后，顯著抑制PPARγ的表達(dá)[7]。另外，全反式維甲酸通過下調(diào)survivin蛋白和增強(qiáng)caspase活性，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN-45的凋亡[8]。對(duì)204例中晚期胃癌患者，采用全反式維甲酸聯(lián)合化療[9]，發(fā)現(xiàn)患者的近期療效好，生存期延長(zhǎng)。但是，由全反式維甲酸引起的不良反應(yīng)增加。本實(shí)驗(yàn)擬用全反式維甲酸聯(lián)合放射治療對(duì)SGC-7901細(xì)胞的作用進(jìn)行研究，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(江西省腫瘤醫(yī)院組織工程研究所)；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，MTT試劑和全反式維甲酸(Sigma)；青霉素和鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)(上海生工生物工程有限公司)； RNA提取試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)； Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB引物設(shè)計(jì)與合成(上海生工生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素與鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2、99%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞基本鋪滿瓶底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，換新鮮培養(yǎng)基，輕輕吹打至單細(xì)胞懸液，傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)ATRA對(duì)SGC-7901細(xì)胞存活率的影響 收集處于對(duì)數(shù)增殖期的SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為2×107/L，加于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)貼壁后，分別加入終濃度為1、2、4、8和16 μmol/L的ATRA，置于37 ℃、5% CO2、99%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換100 μL新鮮培養(yǎng)基，加入20 μL MTT試劑(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO終止反應(yīng)，于570 nm處采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad)檢測(cè)吸光度(A)，細(xì)胞活力抑制率=(1-A藥物組)/A正常對(duì)照組×100%，設(shè)空白調(diào)零孔和正常對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁，實(shí)驗(yàn)分2組：放射(radidation，Rad)組：給予不同劑量X射線照射；聯(lián)合(combination，Com)組：8 μmol/L ATRA處理24 h，再給予不同劑量X射線照射。照射劑量分別為0、2、4、6和8 Gy，將細(xì)胞懸液稀釋為以下濃度：0 Gy組為每孔250個(gè)細(xì)胞；2 Gy組為每孔500個(gè)細(xì)胞，4 Gy組為每孔1 000個(gè)細(xì)胞，6 Gy組為每孔2 000個(gè)細(xì)胞和8 Gy組為每孔4 000個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于照射野(20 cm×20 cm)內(nèi)，距射野邊緣為3 cm，用直線加速器6 MV的X線照射，源皮距(source-to-skin distance,SSD)為100 cm，劑量率為300 cGy/min。照射后，更換無藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)14 d。用無水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。細(xì)胞存活曲線依據(jù)靶單擊型模型公式SF=1-(1-e-D/D0)N擬合；克隆形成率(plating efficiency，PE)=克隆數(shù)/細(xì)胞數(shù)×100%；細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction，SF)=照射劑量的克隆數(shù)/(細(xì)胞接種數(shù)×未照射克隆形成率)，并計(jì)算放射敏感性參數(shù)D0、Dq及N值。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期 收集處于對(duì)數(shù)增殖期的SGC-7901細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照(control)組、ATRA組、6Gy組和ATRA+6Gy組，經(jīng)相應(yīng)處理后更換無藥培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、99%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，加入PI染色，采用FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 依據(jù)2.4項(xiàng)分組，按照TRIzol說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(引物序列見表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃ 7 min；95 ℃ 15s、60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；63 ℃ 5 min。所得結(jié)果于AB7500熒光定量操作系統(tǒng)(Life Technologies)進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，任意兩組數(shù)據(jù)間比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qPCR引物序列

結(jié) 果

1 ATRA對(duì)SGC-7901細(xì)胞存活率的影響

隨著ATRA濃度的升高，SGC-7901細(xì)胞的存活率逐漸下降；當(dāng)ATRA濃度增加至8 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降至最低值(圖1)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用8 μmol/L 的ATRA進(jìn)行。

Figure 1. The inhibitory effect of ATRA at different concentrations on the viability of the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度ATRA對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定SGC-7901細(xì)胞的放射敏感性

與放射組相比，在各照射劑量下聯(lián)合組的存活分?jǐn)?shù)降低，并有生存曲線的整體下移，見圖2、表2。

Figure 2.The effect of ATRA on the radiosensitivity of SGC-7901 cells. Com: combination (ATRA+X-ray radiotherapy); Rad: X-ray radiotherapy alone. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRad group.

圖2 ATRA對(duì)SGC-7901細(xì)胞放射敏感性的影響

表2 SGC-7901細(xì)胞照射后存活曲線的相關(guān)參數(shù)

Com: combination (ATRA+X-ray radiotherapy); Rad: X-ray radiotherapy alone.*P<0.05vsRad group.

3 各組SGC-7901細(xì)胞周期的變化

與對(duì)照組相比，ATRA組、6 Gy組和ATRA+6 Gy組的細(xì)胞周期G2/M期的比例顯著增加(P<0.05)，6 Gy組中G2/M期的所占比例最大，其中ATRA+6 Gy組G2/M期的所占比例顯著低于6 Gy組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The change of cell cycle in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs6 Gy group.

圖3 各組SGC-7901細(xì)胞周期的變化

4 SGC-7901細(xì)胞中Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB mRNA表達(dá)的變化

與對(duì)照組相比，ATRA組、6 Gy組和ATRA+6 Gy組Bcl-2與survivin的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)，Bax與NF-κB的mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.05)；其中ATRA+6 Gy組的變化幅度顯著大于ATRA組和6 Gy組，見圖4。

討 論

放射治療是一種局部或區(qū)域治療的手段，臨床適應(yīng)范圍更廣，對(duì)于晚期患者選擇合理的放療可獲得良好的姑息性治療效果。但由于臨床胃癌晚期患者放療的治療效果差，復(fù)發(fā)率高，并出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，為了提高放療的療效，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性具有非常重要的意義。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)全反式維甲酸胃癌細(xì)胞SGC-7901的放射敏感性及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

隨著全反式維甲酸濃度增加，對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)抑制作用越顯著，并與8 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合組的D0、Dq及N值均低于單純照射組，且其存活曲線整體下移。提示，聯(lián)合細(xì)胞的亞致死損傷修復(fù)能力降低，全反式維甲酸在一定程度上提高了細(xì)胞的放射敏感性。大量研究數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞的放射敏感性隨細(xì)胞周期時(shí)相的變化而改變。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G2期與M期時(shí)，放射敏感性會(huì)增高。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到射線照射引起DNA損傷后，細(xì)胞周期會(huì)出現(xiàn)阻滯于G1/S期或G2/M期，進(jìn)行DNA損傷的修復(fù)[10]，未能成功修復(fù)則啟動(dòng)凋亡信號(hào)使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[11]。同時(shí)給予全反式維甲酸與放射處理后，SGC-7901細(xì)胞的G2/M期阻滯時(shí)間相對(duì)于給予單純放射時(shí)縮短，推測(cè)全反式維甲酸破壞腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加，從而增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。

Figure 4.The mRNA expression of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB in the SGC-7901 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 SGC-7901細(xì)胞中Bax、Bcl-2、survivin與NF-κB的mRNA表達(dá)

NF-κB是腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，普遍認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的放射抵抗性與NF-κB的激活有關(guān)，激活NF-κB可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，特定條件下發(fā)揮促凋亡作用[12]。給予全反式維甲酸聯(lián)合放射處理后，SGC-7901細(xì)胞中NF-κB的mRNA表達(dá)顯著上升，提示全反式維甲酸增加SGC-7901細(xì)胞的放射敏感性可能與NF-κB的激活有關(guān)。Survivin是凋亡抑制蛋白的成員之一，具有調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)血管生成的作用，與腫瘤細(xì)胞的放射敏感性有密切關(guān)系[13]。NF-κB上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，進(jìn)一步下調(diào)IκBα的表達(dá)，從而增強(qiáng)NF-κB的活化，形成一個(gè)正反饋循環(huán)。Bcl-2與Bax是一對(duì)凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予全反式維甲酸聯(lián)合放射處理后， Bcl-2與survivin的mRNA表達(dá)明顯下降，Bax的mRNA表達(dá)明顯上升。綜上所述，全反式維甲酸具有提高胃癌細(xì)胞SGC-7901的放射敏感性，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2與survivin mRNA表達(dá)以及上調(diào)NF-κB與Bax mRNA表達(dá)有關(guān)。

本文首次采用全反式維甲酸聯(lián)合X射線治療，對(duì)胃癌細(xì)胞的放射敏感性進(jìn)行研究。與傳統(tǒng)單獨(dú)采用放射治療相比，發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸確實(shí)能提高放射治療的療效。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of all-transretinoic acid on sensitivity of gastric cancer cells to radiotherapy

WANG Yan-ping1, ZHAO Xian-qun1, ZHANG Xiang-dong1, XU Wei2, XIANG Xiao-hui2

(1DepartmentofGastroenterology,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China;2CenterofHepatobiliary,Pan-creaticandSplenicDiseases,AffiliatedHospitalofLogisticalCollege,CPLA,Tianjin300162,China.E-mail:docnany@126.com)

AIM: To investigate the effect of all-transretinoic acid (ATRA) on the viability of gastric cancer cell SGC-7901 and the sensitivity to radiotherapy. METHODS: MTT assay was used to examine the cell viability. Radio-sensitivity and cell cycle were determined by colony formation assay and flow cytometry, respectively. The mRNA levels of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB in the cells were measured by RT-qPCR. RESULTS: ATRA inhibited the viability of SGC-7901 cells in a concentration-dependent manner. The maximal inhibition was at concentration of 8 μmol/L. Colony formation assay revealed that the combination of ATRA with X-ray treatment significantly reduced the values of D0 and Dq, and shifted down the fitting survival curve, as compared with radiotherapy alone. Moreover, ATAR markedly decreased the percentage of G2/M phase in the SGC-7901 cells (P<0.05). In addition, following ATRA treatment, the mRNA levels of Bcl-2 and survivin were decreased (P<0.05), whereas the mRNA levels of Bax and NF-κB were increased (P<0.05). CONCLUSION: ATRA enhances the sensitivity of SGC-7901 cells to radiotherapy, inhibits G2/M arrest and regulates the mRNA expression of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB.

All-transretinoic acid; Radiotherapy; Gastric cancer cell SGC-7901; Sensitivity

1000- 4718(2016)08- 1440- 05

2016- 04- 07

2016- 06- 28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. 81500489)

R811.5; R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.017

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