內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性間歇低氧幼鼠腦損害中的作用*

李秀翠， 方 勵， 李志潔， POONIT Neha Devi， 陳 帆， 蔡曉紅△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 1兒童神經(jīng)科， 2兒童呼吸科，浙江 溫州 325027)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性間歇低氧幼鼠腦損害中的作用*

李秀翠1， 方 勵2， 李志潔2， POONIT Neha Devi2， 陳 帆2， 蔡曉紅2△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院1兒童神經(jīng)科，2兒童呼吸科，浙江 溫州 325027)

目的： 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性間歇低氧幼鼠腦損害中的作用機制及salubrinal的干預(yù)作用。方法: 取SPF級健康雄性SD幼鼠64只，隨機分為8組：間歇低氧(intermittent hypoxia，IH)2、4周組(2IH、4IH)，對照(control, C)2、4周組(2C、4C)，Salubrinal (SAL)干預(yù)2、4周組(2SAL、4SAL)，二甲基亞砜(DMSO)溶劑對照2、4周組(2DMSO、4DMSO)，每組8只。八臂迷宮測試各組幼鼠參考記憶錯誤(RME)、工作記憶錯誤(WME)及總錯誤(TE)次數(shù)，觀察海馬神經(jīng)元凋亡變化，測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物C/EBP 同源蛋白(CHOP)、磷酸化真核翻譯起始因子2α(p-eIF2α)和磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(p-PERK)的蛋白水平。結(jié)果: 與相應(yīng)對照2C、4C組比較，間歇低氧2IH、4IH組幼鼠的RME、WME和TE升高(P<0.01)，海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)(AI)升高(P<0.01)，SOD活性下降(P<0.01)，p-PERK和CHOP蛋白水平升高(P<0.01)，p-eIF2α蛋白水平下降(P<0.05)，4周組最明顯；與對應(yīng)間歇性低氧2IH、4IH組比較，藥物干預(yù)組2SAL、4SAL組RME、WME和TE次數(shù)下降(P<0.05)，AI下降(P<0.01)，SOD活性升高(P<0.01)，p-eIF2α的蛋白水平升高(P<0.01)，CHOP表達下降(P<0.01)。結(jié)論: 慢性間歇低氧可上調(diào)記憶相關(guān)腦區(qū)p-PERK表達，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而誘導(dǎo)CHOP所介導(dǎo)的細胞凋亡，可能在慢性間歇低氧所致腦損傷中起重要作用。Salubrinal選擇性抑制eIF2α去磷酸化，下調(diào)CHOP蛋白的水平，提高SOD活性，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕氧化應(yīng)激，減少細胞凋亡。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 氧化應(yīng)激； 細胞凋亡； Salubrinal

兒童阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)的發(fā)病率約1%～3%[1]，多見于學(xué)齡前兒童，嚴重危害兒童健康及成長發(fā)育，相關(guān)文獻表明神經(jīng)系統(tǒng)損傷在兒童較常見[2]。我們前期的臨床研究也證實神經(jīng)系統(tǒng)損害所致的認知功能障礙[3]。目前OSAHS導(dǎo)致認知功能障礙的具體機制尚不明確。

近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)也可啟動細胞凋亡，它是一條新的細胞凋亡通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡在神經(jīng)變性疾病中備受關(guān)注，然而是否參與OSAHS認知損傷過程，尚無相關(guān)研究。本研究在前期建立慢性間歇低氧(intermittent hypoxia，IH)幼鼠模型的基礎(chǔ)上，試圖揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性間歇低氧幼鼠記憶損害機制中的作用，進而闡明OSAHS兒童認知功能損害機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

選擇健康SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)幼鼠(3～4周齡)64只，體重為100～120 g，做好標記，按隨機數(shù)字表法分為8組：慢性間歇低氧2周(2IH)和4周組(4IH)、空氣模擬對照(control, C)2周 (2C)和4周組(4C)、藥物salubrinal (SAL)干預(yù) 2周(2SAL)和4周組(4SAL)、DMSO溶劑對照2周(2DMSO)和4周組(4DMSO)，各組8只。

2 模型制備

按照此前的方法[4]，建立OSAHS慢性間歇性低氧動物模型。調(diào)控復(fù)合模擬艙內(nèi)氧氣濃度，模擬IH環(huán)境：0.3 kPa壓力通氮氣30 s，停30 s，25 L/min流量通氧氣12 s，停18 s，為一個循環(huán)，艙內(nèi)低氧時氧濃度為10.0%±1.5%，復(fù)氧時氧濃度為21.0%±0.5%，CO2濃度<0.01%，每天7.5 h(8:00～15:30)，每周7 d。SAL組和DMSO組進氧艙前0.5 h分別腹腔注射20.8 mL·kg-1·d-1的100 μmol/L salubrinal和1% DMSO[5]，然后和IH組放入動物實驗復(fù)合模擬艙內(nèi)，模擬間歇性低氧環(huán)境。空氣模擬對照組置于動物模擬對照艙內(nèi)，向艙內(nèi)輸送壓縮空氣，氧濃度保持在21.0%±0.5%。前期研究[6]已對間歇性低氧模型進行驗證，整個實驗過程中保證艙內(nèi)溫度和室內(nèi)溫度22～24℃，濕度40%～50%。

3 實驗方法

3.1 八臂迷宮行為學(xué)檢測 參照本課題組前期實驗方法[4, 7]，對大鼠進行八臂迷宮訓(xùn)練，迷宮訓(xùn)練于造模結(jié)束前10 d開始進行，每日出氧艙后訓(xùn)練，造模結(jié)束當(dāng)日行八臂迷宮測試。記錄工作記憶錯誤(working memory error，WME)次數(shù)：重復(fù)進入已吃過食物臂的次數(shù)；參考記憶錯誤(reference memory error, RME)次數(shù)：進入不放餌臂的次數(shù);總錯誤(total error，TE)次數(shù)：工作記憶錯誤和參考記憶錯誤之和。

3.2 取材 實驗結(jié)束后，每組隨機取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，抽取腹主動脈血3 mL，離心后取血清，-20 ℃冰箱保存；迅速斷頭處死，剝離顱骨快速分離左、右海馬，置液氮保存。取每組剩下的2只幼鼠，暴露心臟，將輸液針管刺入左心室，剖開右心耳排液，快速灌入0～4 ℃ 100 mL左右生理鹽水，再用0～4 ℃ 200 mL左右的多聚甲醛緩慢灌注后迅速取腦，在視交叉后1 mm及4 mm處冠狀切面切開，取中間腦塊，浸入4%多聚甲醛固定12～24 h，依次濃度梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。

3.3 各組幼鼠認知相關(guān)腦區(qū)海馬超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定及神經(jīng)元凋亡的檢測 將液氮保存的左側(cè)海馬組織稱重后勻漿，用生理鹽水稀釋成1%的組織勻漿，黃嘌呤氧化酶法測定勻漿組織中及血清的SOD活性。包埋后的石蠟組織塊常規(guī)切片(厚度為3 μm)用于TUNEL檢測，檢測過程按照TUNEL試劑盒說明書進行。TUNEL凋亡陽性細胞主要表現(xiàn)為染色質(zhì)濃集，細胞核體積變小，呈現(xiàn)棕色，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性。每個樣本隨機選擇5個高倍視野(×400)，計算凋亡指數(shù)(apoptoic index，AI)，AI=凋亡細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)×100%。

3.4 Western印跡法檢測海馬磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, p-PERK)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和磷酸化真核翻譯起始因子2α(phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2 alpha, p-eIF2α)蛋白水平的變化 各組幼鼠右側(cè)海馬組織采用RIPA緩沖液裂解，提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白含量。取100 μg蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，I抗4 ℃孵育過夜，II抗室溫下孵育2 h，ECL顯影，Gel-Pro凝膠分析軟件分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參照(β-actin)條帶累積吸光度(IA)之比作為反映蛋白表達水平的相對指標。 I抗稀釋度p-PERK、CHOP和p-eIF2α分別為1∶500、1∶1 000和1∶1 000，β-actin單克隆抗體稀釋度為1∶1 000。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

各組正態(tài)計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用Bonferroni校正的t檢驗，方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗。所有資料經(jīng)SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 間歇低氧對各組幼鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

八臂迷宮測試結(jié)果顯示，2IH組和4IH組RME、WME和TE值與相應(yīng)對照2C和4C組比較明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。4IH與2IH組比較，各項錯誤次數(shù)亦明顯增加(P<0.05)；2SAL組和4SAL組RME、WME和TE與相應(yīng)2IH組和4IH組比較明顯減少(P<0.05)，2SAL組與對照2C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，4SAL組與4C組比較明顯減少(P<0.01)，2DMSO組和4DMSO組RME、WME和TE與相應(yīng)2IH組和4IH組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。

2 各組幼鼠海馬神經(jīng)元凋亡的檢測結(jié)果

TUNEL染色顯示， 與相應(yīng)對照2C和4C組比較，2IH和4IH組的海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)AI升高(P<0.01)，4IH組AI高于2IH組(P<0.01)；2C組與4C組的海馬可見少許凋亡細胞，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與相應(yīng)2IH和4IH組比較，2SAL和4SAL組的AI降低(P<0.01)，比相應(yīng)的2C和4C組升高(P<0.01)；2DMSO和4DMSO組的細胞凋亡與相應(yīng)的2IH和4IH組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2、表1。

Figure 1.Working memory error (WME), reference memory (RME) and total error (TE) in different groups in an 8-arm radial maze test. Mean±SD.n=8.**P<0.01vs2C group;##P<0.01vs4C group;□P<0.05，□□P<0.01vs2IH group;&P<0.05，&&P<0.01vs4IH group.

圖1 八臂迷宮測試各組幼鼠工作記憶錯誤、參考記憶錯誤和總錯誤數(shù)

3 各組幼鼠海馬組織SOD活性的測定

與相應(yīng)對照2C和4C組比較，2IH和4IH組海馬和血清的SOD活性降低(P<0.01)，4IH組明顯低于2IH組(P<0.01)。2C與4C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與相應(yīng)4IH組比較，4SAL組的SOD活性明顯升高(P<0.01)，4SAL組SOD活性低于4C組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。2DMSO和4DMSO組與相應(yīng)的2IH和4IH組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表1。

4 Western blot法檢測各組幼鼠海馬p-PERK、CHOP和p-eIF2α蛋白含量的變化

與相應(yīng)對照2C和4C組比較，2IH和4IH組幼鼠海馬的p-PERK和CHOP蛋白水平升高(P<0.01)，p-eIF2α蛋白水平降低(P<0.05)；4IH組p-PERK和CHOP的蛋白水平比2IH組明顯升高(P<0.01)；與相應(yīng)2IH和4IH組比較，2SAL和4SAL組的CHOP表達明顯降低，p-eIF2α的蛋白水平升高(P<0.01)；DMSO組與對應(yīng)IH組比較，CHOP和p-eIF2α的蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 2.The changes of neuronal apoptosis in the hippocampus CA1 region by TUNEL-DAB staining (×400). TUNEL-positive staining neurons with condensed nuclei (arrow) in the hippocampus CA1 region were evident in CIH groups, especially in 4IH group. Treatment with SAL significantly decreased the number of TUNEL-positive cells, while normal nuclei were seen in control groups.

圖2 海馬CA1區(qū)TUNEL-DAB染色海馬神經(jīng)元凋亡變化

表1 各組幼鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)及SOD活性的測定

Table 1.Neuronal apoptotic index (AI) and the activity of SOD in the hippocampus in the rats with different treatments (Mean±SD.n=4)

GroupAI(%)SOD(103U/gprotein)HippocampusSerum2IH14.94±1.59**97.07±12.98**196.15±23.45**2C2.68±0.24130.02±11.49263.04±22.682SAL9.74±1.74**■■106.07±13.65214.64±26.622DMSO15.85±2.21100.50±6.59203.51±11.184IH20.78±2.63##■■56.27±9.57##■■112.54±19.14##■■4C3.12±0.43125.37±0.82250.24±19.634SAL13.25±2.11##&&99.78±10.04#&&200.55±18.51#&&4DMSO19.81±2.5263.21±11.75123.41±18.55

**P<0.01vs2C group;#P<0.05，##P<0.01vs4C group;■■P<0.01vs2IH group;&&P<0.01vs4IH group.

討 論

阻塞性睡眠呼吸暫停模式慢性間歇低氧是一種特殊低氧模式，是一種高頻率的低氧，其特點為正常氧和低氧交替出現(xiàn)，平均每2～5 min發(fā)生 1 次，最低血氧飽和度可至20%或更低，低氧解除后都會恢復(fù)到正常氧水平，機體對間歇低氧較持續(xù)低氧難以適應(yīng)，損害更為嚴重。OSAHS可引起學(xué)習(xí)記憶障礙已得到多方證實[8-9]，我們前期的研究[4]也證明了這一點，并指出慢性間歇性低氧在其中發(fā)揮了重要作用。本實驗通過八臂迷宮測試發(fā)現(xiàn)間歇性低氧組工作記憶、參考記憶錯誤和總錯誤數(shù)明顯多于正常組，4IH組較2IH組更明顯，提示間歇性低氧可損害幼鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，且存在時間依賴性。學(xué)習(xí)記憶的主要解剖位置位于海馬和前額葉皮層，認為海馬CAl區(qū)與空間學(xué)習(xí)記憶有關(guān)[10]。本研究用TUNEL法檢測到間歇性低氧組幼鼠海馬CAl區(qū)和神經(jīng)元產(chǎn)生較多凋亡小體，且隨著低氧時間增加，凋亡越明顯，表明慢性間歇低氧引起幼鼠海馬神經(jīng)元的損傷，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損害。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞早期應(yīng)對各種應(yīng)激的一種保護機制，主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種蛋白PERK、IRE-1和ATF-6介導(dǎo)，以上3種蛋白表達上調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)間歇低氧能顯著上調(diào)幼鼠海馬PERK的磷酸化水平，說明間歇低氧誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過強或過久就會啟動死亡程序，主要由未折疊蛋白CHOP、c-Jun氨基末端激酶和caspase-12依賴的信號途徑啟動細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激發(fā)生時，PERK介導(dǎo)的eIF2α磷酸化同時也提高ATF4 mRNA與核糖體的結(jié)合效率[11]，促進

Figure 3.The protein levels of p-PERK (A), p-eIF2α (B), and CHOP (C) in the hippocampus. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs2C group;##P<0.01vs4C group;■P<0.05,■■P<0.01vs2IH group;&&P<0.01vs4IH group.

圖3 各組幼鼠海馬p-PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白含量的變化

ATF4的翻譯，ATF4轉(zhuǎn)入核后，誘導(dǎo)CHOP基因的表達[12]，過量表達的CHOP促進細胞凋亡。本研究用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)間歇性低氧組p-PERK的蛋白水平增加，同時CHOP蛋白表達上調(diào)，并呈時間依賴性。表明間歇低氧因素持續(xù)存在超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我調(diào)節(jié)能力，使間歇性低氧幼鼠神經(jīng)元細胞通過啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白PERK，從而上調(diào)CHOP，進而介導(dǎo)細胞凋亡。

Salubrinal可選擇性地誘導(dǎo)eIF2α磷酸化和抑制其去磷酸化，本實驗通過TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)使用salubrinal 預(yù)處理可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡，減少工作記憶錯誤、參考記憶錯誤和總錯誤數(shù)，同時發(fā)現(xiàn)SAL組的p-eIF2α水平明顯高于IH組，CHOP表達下調(diào)，提示salubrinal在間歇性低氧幼鼠模型中可通過選擇性地誘導(dǎo)eIF2α磷酸化對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡，減少認知功能損害。SOD是體內(nèi)天然的抗氧化物，能清除氧自由基具有抗自由基損傷的作用，SOD的活性能間接反映腦組織中氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強弱，前期研究已表明氧化應(yīng)激可引起間歇性低氧神經(jīng)元凋亡[4]，本實驗進一步發(fā)現(xiàn)間歇性低氧組幼鼠海馬及血清的SOD活性明顯降低，而salubrinal干預(yù)組的SOD活性較間歇性低氧組升高，表明salubrinal可通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解氧化應(yīng)激，從而減少細胞凋亡。這與Cao等[13]的研究是一致的，至于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激如何影響氧化應(yīng)激有待進一步研究。

本研究證明了慢性間歇低氧可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起幼鼠海馬神經(jīng)元的凋亡；salubrinal藥物可選擇性地誘導(dǎo)eIF2α磷酸化和抑制其去磷酸化對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕氧化應(yīng)激，從而減少細胞凋亡，將來有望被開發(fā)為抗細胞凋亡的治療藥物，該研究為OSAHS兒童認知功能障礙的發(fā)生機制及治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of endoplasmic reticulum stress on brain injury following chronic intermittent hypoxia in growing rats

LI Xiu-cui1, FANG Li2, LI Zhi-jie2, POONIT Neha Devi2, CHEN Fan2, CAI Xiao-hong2

(1DepartmentofPediatricNeurology,2DepartmentofPediatricPulmonology,TheSecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:caixh839@sina.com)

AIM: To explore the role of endoplasmic reticulum stress (ERS) in brain injury following chronic intermittent hypoxia in growing rats and the protective effect of treatment with salubrinal. METHODS: Healthy male SD rats (3～4-week-old, 100～120 g,n=64) were randomly assigned to 8 groups (8 rats in each group): the groups of intermittent hypoxia for 2 and 4 weeks (2IH and 4IH), the groups of control (C) for 2 and 4 weeks (2C and 4C), the groups of dimethylsulfoxide (DMSO) for 2 and 4 weeks (2DMSO and 4DMSO) and the groups of salubrinal for 2 and 4 weeks (2SAL and 4SAL). The 8-arm radial maze was used to assess the working memory error (WME), reference memory error (RME) and total error (TE) of the rats. The changes of neuronal apoptosis in the hippocampus were observed by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining. The activity of superoxide dismutase (SOD), and the protein levels of endoplasmic reticulum stress marker compounds, C/EBP homologous protein (CHOP), phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2 alpha (p-eIF2α) and phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (p-PERK), were analyzed. RESULTS: Chronic intermittent hypoxia (CIH) significantly increased RME, WME, TE and neuronal apoptotic index (AI) (P<0.01), and decreased the activity of SOD in the hippocampus and serum (P<0.01). The protein levels of p-PERK and CHOP progressively increased in hippocampus in IH groups (P<0.01), and p-eIF2α was downregulated (P<0.05). Treatment with salubrinal significantly decreased RME (P<0.05), WME (P<0.05), TE (P<0.01) and AI (P<0.01), and increased the activity of SOD (P<0.01). Salubrinal induced the phosphorylation of eIF2α significantly after CIH in hippocampus and downregulated the level of CHOP (P<0.01). CONCLUSION: Chronic intermittent hypoxia upregulates the protein levels of p-PERK and CHOP in the hippocampus, and decreases p-eIF2α protein and the activity of SOD. Salubrinal, a selective inhibitor of eIF-2α dephosphorylation, increases the activity of SOD and prevents CHOP protein activation throughout CIH exposure. Our findings suggest ERS-mediated cell apoptosis is one of the underlying mechanisms of cognitive dysfunction in OSAHS children. Further, a specific ERS inhibitor salubrinal should be tested for neuroprotection against CIH-induced brain injury.

Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome; Endoplasmic reticulum stress; Oxidative stress; Apoptosis; Salubrinal

1000- 4718(2016)08- 1413- 06

2016- 02- 29

2016- 04- 21

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No. Y2110277)；溫州市科技計劃項目(No. Y20140247)；浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃資助項目(No. 2013C33174)；溫州市科學(xué)技術(shù)局科技合作項目(No. H20130001); 浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃(No. 2014ZDA014; No. 2011RCB027)； 國家衛(wèi)計委國家重點臨床專科開放課題(No. 20130201)；浙江省高校重中之重臨床醫(yī)學(xué)兒科學(xué)開放課題

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.012

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