COM.TEC型血細(xì)胞分離機(jī)采集外周血單個(gè)核細(xì)胞效果分析

范振海,章 濤,余麗梅,魏在榮,彭笳宸,任明強(qiáng),方 寧

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.燒傷整形外科；3.骨科；4.血液科；貴州 遵義 563099)

技術(shù)與方法

COM.TEC型血細(xì)胞分離機(jī)采集外周血單個(gè)核細(xì)胞效果分析

范振海1,章 濤1,余麗梅1,魏在榮2,彭笳宸3,任明強(qiáng)4,方 寧1

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.燒傷整形外科；3.骨科；4.血液科；貴州 遵義 563099)

目的 觀察費(fèi)森尤斯COM.TEC型血細(xì)胞分離機(jī)autoMNC程序采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的效果。方法 粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員后，采用COM.TEC型血細(xì)胞分離機(jī)autoMNC程序采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞百分比，血常規(guī)檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞采集效率與單個(gè)核細(xì)胞采集參數(shù)及采集物質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 28例患者平均處理血量2.34±1.75 L，采集物體積46.63±28.17 mL，白細(xì)胞計(jì)數(shù)(11.40±10.40)×1010個(gè)細(xì)胞/L，單個(gè)核細(xì)胞百分比(83.79%±21.77) %，CD34+細(xì)胞百分比(0.81±1.54) %。MNCs采集效率與外周血處理血量呈正相關(guān)(rs=0.538,P<0.05)，和采集前外周血MNCs計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.379.P<0.05);MNCs采集效率與采集物白細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)呈正相關(guān)(rs=0.866，rs=0.924，P<0.05)，與采集前外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、采集物CD34+細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞百分比之間無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 外周血單個(gè)核細(xì)胞采集效率作為評(píng)價(jià)COM.TEC型血細(xì)胞分離機(jī)autoMNC程序采集效果的指標(biāo)，可綜合反應(yīng)重要的采集參數(shù)與采集物質(zhì)量。

血細(xì)胞分離機(jī)；外周血；單個(gè)核細(xì)胞；CD34+細(xì)胞

經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員，可顯著提高外周血中造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞的含量，通過血細(xì)胞分離機(jī)采集外周血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)可初步富集外周血干細(xì)胞，用于惡性血液病大劑量化療后，促進(jìn)患者造血免疫功能恢復(fù)，或?qū)⒏患耐庵苎杉?xì)胞用于糖尿病足等疾病治療[1-2]，促進(jìn)組織損傷修復(fù)，取得了明顯療效。與骨髓干細(xì)胞采集相比，血細(xì)胞分離機(jī)富集外周血干細(xì)胞具有自動(dòng)化集成度高、無需麻醉、安全、無痛苦及自體粒細(xì)胞和血小板恢復(fù)快等優(yōu)勢(shì)。

外周血MNCs采集過程中，盡管所用廠家與機(jī)型不同，細(xì)胞自動(dòng)化采集水平不相上下，但能否合理使用與科學(xué)設(shè)置采集參數(shù)，最終對(duì)采集物質(zhì)量會(huì)造成明顯影響，一定程度上決定著自體外周血干細(xì)胞移植治療效果[3-5]。COM.TEC是德國Fresenius Kabi公司推出的血細(xì)胞分離機(jī)，國內(nèi)外都是一款外周血MNCs采集、分離和HSCs富集的主流機(jī)型。本文重點(diǎn)分析了COM.TEC型血細(xì)胞分離機(jī)autoMNC程序的外周血MNCs的采集效率(collection efficiency,CE)與白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)、MNCs計(jì)數(shù)等主要采集參數(shù)和采集物質(zhì)量指標(biāo)之間的相關(guān)性，為采集實(shí)施過程中合理設(shè)置參數(shù)，科學(xué)評(píng)價(jià)外周血MNCs采集物質(zhì)量提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年12月至2011年04月在我院進(jìn)行外周血MNCs采集的患者28例，年齡21～72歲，平均41歲，男性19例，女性9例，急性髓系白血病2例，急性淋巴細(xì)胞白血病1例，血栓閉塞性脈管炎5例，糖尿病足1例，股骨頭壞死5例，骨折不愈合14例。采集前患者皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子5 μg/kg/d，動(dòng)員期間監(jiān)測(cè)外周血WBC計(jì)數(shù)，動(dòng)員3 d WBC計(jì)數(shù)>20×109個(gè)細(xì)胞/L后，行外周血MNCs采集。

1.2 儀器 德國Fresenius Kabi公司生產(chǎn)的COM.TEC型血細(xì)胞分離機(jī)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀和ProCOUNTCD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒均為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 方法 采集前行血常規(guī)檢測(cè)，采用autoMNC程序，依據(jù)患者身高、體重、紅細(xì)胞壓積、WBC、血小板計(jì)數(shù)、外周血MNCs計(jì)數(shù)等設(shè)置參數(shù)，程序?qū)⒏鶕?jù)輸入資料自動(dòng)預(yù)測(cè)CD34+細(xì)胞采集數(shù)，也可根據(jù)患者自身情況稍作調(diào)整，處理血量1.24～8.96 L，平均2.34 L，抗凝劑枸櫞酸葡萄糖與全血的比例設(shè)置1∶9～1∶11。

1.4 采集物處理 采集物終體積因不同疾病治療需要設(shè)置在26～123 mL，平均體積為46 mL，并將采集物行血常規(guī)檢查，CD34+細(xì)胞百分比及MNCs百分比分別采用絕對(duì)計(jì)數(shù)微球與CD45+CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD45+細(xì)胞標(biāo)記，經(jīng)FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析獲得。

1.5 MNCs采集效率計(jì)算[6-7]MNCs-CE的計(jì)算公式：MNCs的CE=(采集物MNCs總數(shù)×100)÷(采集前外周血MNCs計(jì)數(shù)×總循環(huán)血量)，采集前外周血MNCs計(jì)數(shù)=采前外周血WBC計(jì)數(shù)×采前外周血MNCs百分比；采集前外周血MNCs百分比=外周血淋巴細(xì)胞百分比+外周血單核細(xì)胞百分比，采集物MNCs總數(shù)=采集物WBC計(jì)數(shù)×采集物MNCs百分比×采集物體積，采集物中CD34+細(xì)胞總數(shù)=采集物WBC計(jì)數(shù)×采集物CD34+細(xì)胞百分率×采集物體積。

2 結(jié)果

2.1 采集參數(shù)和外周血MNCs的CE MNCs的CE是評(píng)價(jià)外周血HSCs采集質(zhì)量的重要指標(biāo)，由MNCs的CE計(jì)算公式可知，采集物中MNCs總數(shù)越高，MNCs的CE越高，而采集前外周血MNCs計(jì)數(shù)和總循環(huán)血量越高，則MNCs的CE越低。 根據(jù)COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)采集參數(shù)(見表1)與采集物中重要細(xì)胞數(shù)量和比例檢測(cè)(見表2)，按照上述公式計(jì)算，采集物MNCs總數(shù)為(4.62±7.78)×109個(gè)細(xì)胞，MNCs的CE為(44.13±80.61)%。

2.2 采集物MNCs和CD34+細(xì)胞總數(shù) 采集物中CD45+細(xì)胞為MNCs的標(biāo)志，CD45+細(xì)胞中CD34+細(xì)胞則是公認(rèn)的HSCs表面標(biāo)志，CD34+細(xì)胞含量的高低與CD34+細(xì)胞總數(shù)決定著采集物質(zhì)量的好壞和自體外周血干細(xì)胞移植的療效。根據(jù)公式計(jì)算，采集物CD34+細(xì)胞總數(shù)(5.26±11.8)×107個(gè)細(xì)胞。其中惡性血液病患者采集物中MNCs總數(shù)為(2.08±1.77)×1010個(gè)細(xì)胞，CD34+細(xì)胞總數(shù)(3.73±1.00)×108個(gè)細(xì)胞，每例患者所采CD34+細(xì)胞總數(shù)均大于2×106個(gè)細(xì)胞/kg，顯著高于HSCs移植的基本質(zhì)量要求。

供者血容量(L)處理血量(L)采集前外周血WBC計(jì)數(shù)(1010個(gè)細(xì)胞/L)紅細(xì)胞壓積(%)MNCs計(jì)數(shù)(×109個(gè)細(xì)胞/L)MNCs百分比(%)398±060234±175264±0963768±594367±2221375±005

指標(biāo)采集物體積(mL)4663±2817WBC計(jì)數(shù)(1010個(gè)細(xì)胞/L)1140±1040紅細(xì)胞(1012個(gè)細(xì)胞/L)087±052MNCs(%)8379±2177CD34+細(xì)胞(%)083±154

2.3 外周血MNCs的CE與采集參數(shù)的相關(guān)性分析 MNCs的CE和采集前外周血MNCs計(jì)數(shù)呈非線性負(fù)相關(guān)，Spearmen’s相關(guān)系數(shù)(rs)=-0.379(P<0.05)，而與外周血處理血量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.538(P<0.05，見圖1)。但與采集前外周血WBC計(jì)數(shù)和MNCs百分比無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

圖1 外周血MNCs的CE與采集物關(guān)鍵指標(biāo)的相關(guān)性分析。

2.4 外周血MNCs的CE與采集物質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性分析 外周血MNCs的CE與采集物WBC和MNCs總數(shù)呈正相關(guān)，rs分別為0.866和0.924(P<0.05)，而與采集物中CD34+細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞百分比和MNCs百分比無明顯相關(guān)性(P>0.05，見圖2)。

圖2 外周血MNCs的CE與采集物質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.5 外周血MNCs采集中的不良反應(yīng) 28例患者采集過程中有9人出現(xiàn)輕度口唇或手足麻木的低血鈣癥狀，該不良反應(yīng)發(fā)生率為32.14%，給予口服或緩慢靜脈推注10%葡萄糖酸鈣對(duì)癥處理后癥狀消失，未見其它明顯不良反應(yīng)。

3 討論

自體外周血干細(xì)胞移植已逐漸成為常用的臨床治療技術(shù)[8]，但外周血干細(xì)胞含量很少，約占MNCs的0.01%～0.1%，相當(dāng)于骨髓干細(xì)胞含量的1%～10%，因此能否采集、富集到足夠的外周血干細(xì)胞是移植治療成功的前提和關(guān)鍵[9]。

除安全、有效的干細(xì)胞動(dòng)員劑使用外，血細(xì)胞分離機(jī)的合理使用對(duì)干細(xì)胞的采集能力是保障短時(shí)間高效率獲取HSCs的重要因素之一。盡管目前臨床上常以計(jì)算CD34+HSCs采集量占流經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)的CD34+細(xì)胞總數(shù)的比例來進(jìn)行HSCs采集效果的評(píng)價(jià)，CD34+細(xì)胞總數(shù)則由采集前CD34+細(xì)胞的比例與總循環(huán)血量的乘積表示[6,10-11]。采集的外周血MNCs中，富集了CD34+的HSCs，因此采集物中MNCs總數(shù)很大程度上影響了CD34+細(xì)胞總數(shù)，而采集物中的WBC計(jì)數(shù)則是決定采集物中MNCs總數(shù)的關(guān)鍵因素。

盡管因所用血細(xì)胞分離機(jī)廠家、型號(hào)存在差異，外周血MNCs或HSCs采集性能也不盡相同[12-15]，但CE仍是常用的外周血細(xì)胞采集效果的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。與文獻(xiàn)報(bào)道的其他型號(hào)血細(xì)胞分離機(jī)相比[16-17]，本研究所選COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)autoMNC程序采集外周血MNCs的采集參數(shù)及采集物質(zhì)量指標(biāo)的結(jié)果來看，在采集前外周血的一定WBC計(jì)數(shù)和MNCs計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，采集所需處理血量較少，采集物體積也較小，而采集物中WBC計(jì)數(shù)、MNCs百分比、CD34+細(xì)胞百分比及CD34+細(xì)胞總數(shù)均較高，不但可以滿足研究所涉及病種對(duì)自體干細(xì)胞移植所需的要求，且外周血MNCs的CE也較高。

進(jìn)一步分析外周血MNCs的CE與采集參數(shù)及采集物質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，外周血MNCs的CE與采集前外周血MNCs計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,18]，即血細(xì)胞分離機(jī)梯度離心過程中，外周血MNCs所形成的白膜層是主要采集目標(biāo)，當(dāng)外周血MNCs過高時(shí)，白膜層過厚，可導(dǎo)致采集不完全，而降低CE，這可能是在影響外周血MNCs的CE因素中，COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)與Cobe Spectra、Fenwal CS 3000 Plus血細(xì)胞分離機(jī)明顯的不同[2]。但外周血MNCs的CE與處理血量成正相關(guān)，因此采集時(shí)，應(yīng)根據(jù)外周血MNCs計(jì)數(shù)，即采集前外周血WBC計(jì)數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比，適當(dāng)調(diào)整每循環(huán)周期白膜采集體積的大小，從而提高CE。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)外周血MNCs的CE與采集物WBC計(jì)數(shù)和MNCs總數(shù)呈正相關(guān)，而與采集物的CD34+細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞百分比和MNCs百分比無明顯相關(guān)性，表明采集物WBC計(jì)數(shù)、MNCs總數(shù)是評(píng)價(jià)采集物質(zhì)量和采集CE的重要指標(biāo)，而不能只是簡(jiǎn)單地以采集物中MNCs和CD34+細(xì)胞百分比來進(jìn)行判斷。反之，根據(jù)臨床疾病治療對(duì)CD34+HSCs數(shù)量的需要，也可根據(jù)采集前外周血WBC計(jì)數(shù)、MNCs計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比推算需處理血量及每循環(huán)中白膜采集體積。由此可見，外周血MNCs的CE作為COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)autoMNC程序采集MNCs的評(píng)價(jià)指標(biāo)，不但受采集前多個(gè)采集參數(shù)的影響，即可通過提高處理血量和采集前有效的升高患者外周血WBC數(shù)，及調(diào)整適宜的白膜采集體積來提高CE，也能很好地提高采集物質(zhì)量。外周血MNCs的CE與采集物MNCs總數(shù)的正相關(guān)，也提示CE的上述影響因素及有關(guān)采集參數(shù)的調(diào)整，可能對(duì)免疫細(xì)胞治療中的外周血MNCs采集也具有重要指導(dǎo)意義。

此外，需引起注意的是外周血MNCs采集中抗凝劑枸櫞酸鹽與血液中鈣離子螯合，可引起口唇或手足麻木等低血鈣癥狀[19]，這一較高的不良反應(yīng)發(fā)生率仍需采取積極措施，在不影響外周血MNC的CE基礎(chǔ)上，適當(dāng)減低抗凝劑枸櫞酸葡萄糖的用量和比例，不失為一種可以考慮的防治策略。

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收稿2016-09-10;修回2016-11-12〗

(編輯：譚秀榮)

Efficiency of collecting peripheral blood mononuclear cells by COM.TEC blood cell separator

FanZhenhai1,ZhangTao1,YuLimei1,WeiZairong2,PengJiachen3,RenMingqiang4,FangNing1

(1.Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province; 2.Department of Burn and Plastic Surgery; 3.Department of Orthopaedics; 4.Hematology department;Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the efficiency of Fresenius COM.TEC blood cell separator autoMNC program on collection of peripheral blood mononuclear cells (MNCs).Methods After mobilization with granulocyte colony-stimulating factor,the peripheral blood MNCs were collected by autoMNC program of Fresenius COM.TEC blood cell separator.The percentage of MNCs and CD34+cells were detected by flow cytometry.The white blood cells (WBC) were counted by blood routine.The correlation analysis were performed between collection efficiency (CE) of MNCs and the count of MNCs and WBC in peripheral blood,total WBC,the percentage of MNCs and CD34+cells in collection.Results The processed mean blood volumes were 2.34 ± 1.75 L in 28 patients.Collection volume was 46.63 ± 28.17 ml.The count of WBC was (11.40±10.40) ×1010cells/L in collection.The percentage of MNCs and CD34+cell were (83.79±21.77)% and (0.81±1.54)% in collection,respectively.There was a positive correlation between the CE of MNCs and prcessed blood volume (rs=0.538,P<0.05).ButanegativecorrelationbetweentheCEofMNCsandthecountofMNCsinperipheralbloodbeforecollection(rs=-0.379,P<0.05).A positive correlation between the CE of MNCs and the count of WBC and MNCs in collection (rswas 0.866 and 0.924,P<0.05).TherewerenocorrelationsbetweentheCEofMNCsandcountofWBCinperipheralbloodbeforecollection,percentageofCD34+cellsandMNCsincollection(P>0.05).Conclusion Collection efficacy of peripheral blood MNCs using COM.TE blood cell separator autoMNC program could reflect the important collection parameters and the quality of the collection.

blood cell separator; peripheral blood; mononuclear cell; CD34+cell

貴州省省長(zhǎng)資金臨床應(yīng)用課題專項(xiàng)(NO：黔省專合字[2012]107)；貴州省科技廳資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字[2010]2182)。

余麗梅，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:ylm720@sina.com。

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1000-2715(2016)06-0627-04