外泌體及其在腫瘤微環(huán)境中的作用與腫瘤診療應(yīng)用

楊 蕾，吳明松,2，李學(xué)英

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

綜 述

外泌體及其在腫瘤微環(huán)境中的作用與腫瘤診療應(yīng)用

楊 蕾1，吳明松1,2，李學(xué)英1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

外泌體(exosomes)是一種微小的囊泡樣小體，起源于細(xì)胞內(nèi)吞產(chǎn)生的胞內(nèi)體，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均可分泌。外泌體中含有蛋白質(zhì)、脂類、mRNAs和miRNAs等多種成分，能夠靶向運(yùn)輸?shù)狡渌M織或細(xì)胞，通過細(xì)胞間的物質(zhì)交換或信息交流，參與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、免疫應(yīng)答等過程，可作為多種腫瘤診斷的潛在生物標(biāo)志物，在腫瘤發(fā)生發(fā)展和防治研究中意義深遠(yuǎn)。本文就外泌體的生物學(xué)特性、在腫瘤微環(huán)境中的作用和腫瘤診療中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

外泌體；腫瘤微環(huán)境；生物標(biāo)志物；腫瘤診斷

惡性腫瘤是由腫瘤細(xì)胞和周圍腫瘤基質(zhì)組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。腫瘤細(xì)胞可以通過與自身微環(huán)境的物質(zhì)交換和信息交流促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。外泌體在外周血、尿液、唾液、腹水及羊水等體液中具有很高的豐度。不同組織來源的外泌體在化學(xué)組成和生物學(xué)功能上均存在差異，這種差異受到細(xì)胞外基質(zhì)和微環(huán)境的動(dòng)態(tài)調(diào)控。腫瘤來源或與腫瘤相關(guān)的外泌體是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。

外泌體是一種新發(fā)現(xiàn)的信息載體，不僅在腫瘤細(xì)胞與機(jī)體細(xì)胞間物質(zhì)交換和信息交流中扮演著重要角色[1]，在腫瘤生物標(biāo)志物及腫瘤診斷治療中也發(fā)揮著舉足輕重的作用。

1 外泌體的生物學(xué)特征

1.1 外泌體的生物發(fā)生 “外泌體”一詞于1981年首次提出，當(dāng)時(shí)定義為從腫瘤細(xì)胞系中釋放出來的、具有5′核苷酸酶活性的物質(zhì)[2]，1987年Johnstone等[3]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，外泌體是細(xì)胞膜功能調(diào)整而釋放出來的"冗余的"質(zhì)膜蛋白，并將其命名為“Exosomes”。后續(xù)研究不斷完善對外泌體的認(rèn)識，研究表明其具有一定生物功能活性，如促進(jìn)細(xì)胞遷移、促進(jìn)血管生成、參與免疫應(yīng)答和細(xì)胞間的信息傳遞等[1]。陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種類型的細(xì)胞均可分泌exosomes，如T細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等，在多種類型體液中也檢測到了exosomes的存在，如血液、唾液及腦脊液[4-5]等。

外泌體又稱為胞外體，是直徑為30～150 nm[5]的被膜囊泡。電鏡下由完整的磷脂雙分子層所包圍，大小均一、形態(tài)呈球形、扁圓形或杯狀。外泌體的形成過程與其它微泡不同，大致過程如下：細(xì)胞膜接受胞外信號后發(fā)生細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成胞內(nèi)小泡；胞內(nèi)小泡被轉(zhuǎn)運(yùn)至早期胞內(nèi)體，同時(shí)接受了相應(yīng)的蛋白質(zhì)或RNA；早期胞內(nèi)體在內(nèi)吞體分選復(fù)合物調(diào)控下內(nèi)出芽形成多個(gè)小囊泡構(gòu)成晚期胞內(nèi)體(multivesicular body,MVB)；降解型晚期胞內(nèi)體可以與溶酶體融合，分泌型晚期胞內(nèi)體在GTP酶及可溶性NSF偶聯(lián)蛋白受體的調(diào)節(jié)下，與細(xì)胞膜融合并向胞外分泌囊泡，這些膜性小囊泡即為外泌體。

外泌體形成分泌過程受多種因素調(diào)節(jié)，如鈣離子和鈣離子載體或結(jié)合蛋白質(zhì)的濃度、磷脂酰肌醇3激酶的活性以及細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)等。在外泌體形成過程中，其接納和包涵蛋白質(zhì)等各類復(fù)雜活性物質(zhì)的機(jī)制在其它綜述中已有重點(diǎn)闡述，在此不再贅述。

1.2 外泌體的化學(xué)組成 外泌體的成分較為復(fù)雜，包括蛋白質(zhì)、脂類和各類RNA，其中大部分是蛋白質(zhì)。據(jù)國際數(shù)據(jù)資源庫ExoCarta統(tǒng)計(jì),截止到2016年3月30日,外泌體中已被發(fā)現(xiàn)存在9 769種蛋白質(zhì)、1 116種脂類結(jié)構(gòu)、3 408種mRNA，以及2 838種miRNA[6]。

外泌體中的蛋白質(zhì)主要分為兩大類：一類是非特異性蛋白，在所有的外泌體內(nèi)均有分布。如抗原結(jié)合或抗原遞呈相關(guān)蛋白質(zhì)(MHC-I、Heat-shock[1]等)；膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)蛋白(Rab家族、Annexins、Flotillin、GTPases、Alix[7]和TSG101等)；細(xì)胞骨架蛋白(肌動(dòng)蛋白、微管蛋白等)；某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白(膜聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白等)；另一類是特異性蛋白，這類蛋白質(zhì)只存在于特殊的細(xì)胞外泌體中，具有其來源細(xì)胞的某些特定功能，例如，樹突細(xì)胞來源的外泌體，其表面含有MHCⅠ型和Ⅱ型抗原呈遞分子；上皮腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體，其攜帶有上皮細(xì)胞粘附分子[8]。

外泌體的脂質(zhì)成分主要有膽固醇、鞘磷脂、卵磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、甘油二酯、磷脂酰肌醇等[9]。外泌體的脂質(zhì)成分與其細(xì)胞來源也有很大關(guān)系。

外泌體mRNA和miRNAs等成分由Valadi等[10]在小鼠和人肥大細(xì)胞(MC/9 、HMC-1)中發(fā)現(xiàn)，并通過微陣列分析確定了兩者的存在。miRNAs參與了血管再生、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化及胞吐作用等[11]，尤其是在腫瘤自身的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，例如，骨髓細(xì)胞來源的外泌體通過特殊配體，可與樹突受體細(xì)胞發(fā)生相互作用釋放miRNA，促進(jìn)細(xì)胞間的信息交流[12]。

2014年，Thakur等[13]首次研究表明，人類慢性粒細(xì)胞白血病k-562細(xì)胞、人類大腸癌HCT116細(xì)胞、小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞等的外泌體中還含有穩(wěn)定的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，稱為exosomal DNA(exoDNA)，可以借以識別親代腫瘤細(xì)胞的突變情況。

2016年，Ahadi等[14]通過研究PC3、VCaP、LNCaP、DU145 4個(gè)前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體發(fā)現(xiàn)，4種前列腺癌細(xì)胞外泌體中均含有長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)。熱點(diǎn)圖分析可知前列腺正常細(xì)胞與這些癌細(xì)胞外泌體中的lncRNAs表達(dá)明顯不同。

2 外泌體在腫瘤微環(huán)境中的作用

腫瘤細(xì)胞來源的外泌體，被稱為Texosome(TEX)，是腫瘤微環(huán)境中的一個(gè)重要部分。TEX中的細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等分子主要通過3種方式完成腫瘤細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息交流。一是通過抗原遞呈和受體-配體的相互作用，激活細(xì)胞表面的受體蛋白質(zhì)分子和生物活性脂質(zhì)配體，從而與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，進(jìn)而激活特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將蛋白質(zhì)和RNA等內(nèi)容物釋放到靶細(xì)胞中。二是TEX自身攜帶的膜蛋白與靶細(xì)胞的胞膜直接融合，使內(nèi)容物釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。三是TEX還可以通過靶細(xì)胞的胞飲、吞噬作用或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等內(nèi)化機(jī)制來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸。研究表明，TEX參與了許多重要的腫瘤促進(jìn)過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用。

2.1 腫瘤發(fā)生與細(xì)胞增殖 在腫瘤微環(huán)境中，TEX釋放的內(nèi)容物可以影響受體細(xì)胞和遠(yuǎn)端細(xì)胞的增殖分化。例如，肺癌A549細(xì)胞外泌體中的miRNA可以結(jié)合、激活周圍免疫細(xì)胞中的toll樣受體，引起炎性反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長[15]。纖維母細(xì)胞外泌體中含有Wnt-11自分泌蛋白，Wnt-11蛋白通過激活Wnt-planar cell polarity(PCP)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源的TEX能包裝編碼RNA或非編碼RNA，從而改變受體細(xì)胞中的基因表達(dá)[17]。結(jié)腸癌細(xì)胞TEX可以將突變型Kras蛋白轉(zhuǎn)移至表達(dá)野生型的細(xì)胞中，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和致癌性的提高[18]。

2.2 腫瘤轉(zhuǎn)移 TEX中含有多種細(xì)胞生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor，TGF)等。這些細(xì)胞生長因子以不同的方式促進(jìn)血管生成，以此為腫瘤生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到其促進(jìn)腫瘤發(fā)展、提高腫瘤侵襲力和轉(zhuǎn)移力的目的。例如，乳腺癌細(xì)胞來源的TEX中VEGF和TGF-β的高表達(dá)可激活TGF-β受體介導(dǎo)的信號通路，從而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞的分化[19]。成肌纖維細(xì)胞能夠支持腫瘤細(xì)胞的生長和血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞來源的TEX可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成[20]。

2.3 腫瘤免疫 腫瘤所處的免疫狀態(tài)也可以影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。TEX中攜帶有CEA、Silv和間皮素等腫瘤特異性抗原，這些特異性抗原通過DC等抗原遞呈細(xì)胞可以引起T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。有研究表明，舌鱗狀細(xì)胞癌來源的TEX中含有熱休克蛋白gp96，通過向MHC I類分子遞呈細(xì)胞，與抗原肽形成復(fù)合物，進(jìn)而激活CD 8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)并抑制腫瘤生長[21]。另外，TEX膜表面的Fasl分子，可以通過誘導(dǎo)CD 4+/CD 8+T細(xì)胞凋亡，引起免疫逃逸反應(yīng)以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。TEX中的MICA(major histocompatibility complex class I chain-related protein A )、MICB(major histocompatibility complex class I chain-related gene B )等配體，通過與免疫細(xì)胞中的NKG2D(natural-killer group 2,member D)受體分子結(jié)合，使NKG2D配體表達(dá)下調(diào)，IL-5等炎癥因子表達(dá)上調(diào)，從而抑制了淋巴細(xì)胞的功能，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[22]。人膽管癌RBE細(xì)胞來源的TEX通過下調(diào)CD3+、CD8 +、TNF-α等的分泌，抑制CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，引起膽管癌細(xì)胞的免疫逃逸[23]。

3 外泌體在腫瘤診療中的應(yīng)用

2008年的研究表明，外泌體在體外具有良好的穩(wěn)定性，取材方便，對人體傷害較小，且便于跟蹤檢測[24]。自此，TEX的研究受到廣泛的關(guān)注，立足于發(fā)現(xiàn)可作為臨床生物標(biāo)志物的TEX特異性分子的研究成為熱點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了不同類型腫瘤細(xì)胞來源的特異性蛋白質(zhì)或miRNA(見表1)。研究證實(shí)，TEX中由于含有這些特異性活性分子，且含量明顯高于正常人，其分子特征還部分反映其來源腫瘤的表型，因此，所攜帶的特異性蛋白和miRNA在多種惡性腫瘤(如食管癌、結(jié)腸癌等)中均可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物，有望應(yīng)用于輔助癌癥的臨床早期診斷。

表1 不同腫瘤細(xì)胞來源外泌體中潛在的生物標(biāo)志物

腫瘤類型來源外泌體活性分子參考文獻(xiàn)卵巢癌血液miR-126，miR-127，miR-141，miR-155，miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-203，miR-205，miR-21，miR-214，miR-29a，miR-92，miR-93，miR-99b，Claudin-4，CD24[24-26]前列腺癌血清、尿液miRNA-1290，miRNA-141，miRNA-375，TMPRSS2-ERG，PCA-3，β-catenin，[27-30]乳腺癌血液Survivin-2，miR-106a，miR-195，miR-21[31-33]肺癌血液miR-1，miR-17，miR-208a，miR-30d，miR-486，miR-499[34-35]胰腺癌血清miR-17-5p，miR-1246，miR-21，GPC1，EGFR[36-39]結(jié)腸癌血液miR-1229，miR-1246，miR-1290，miR-150，miR-21，miR-223，miR-23a，miR-375，let-7A，CEA[40-41]宮頸癌陰道灌洗液miR-21，miR-146a[42]

續(xù)表

腫瘤類型來源外泌體活性分子參考文獻(xiàn)膀胱癌尿液PCA-3，TMPRSS2，HYMAI，LINC00477，LOC100506688，OTX2-AS1[43-44]食管鱗狀細(xì)胞癌血清miR-21[45]慢性粒細(xì)胞白血病，大腸癌，血液exoDNA[13]黑色素瘤血液MIA，S100B，c-Met，exoDNA[13，46-47]膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血液EGFR-VIII，神經(jīng)膠質(zhì)瘤特有的miRNA和mRNAvariant，CD63[48]

本表參考了張敏等[49]2014年綜述結(jié)果，并補(bǔ)充了近兩年發(fā)現(xiàn)的外泌體活性分子。

外泌體中腫瘤標(biāo)志物除了特異性蛋白分子和miRNA外，2012年Derrien等[50]研究肺癌、卵巢癌等發(fā)現(xiàn)lncRNAs也可作為生物標(biāo)志物，且比protein-coding mRNA更具特異性[14]；HYMAI等lncRNAs對膀胱癌[51]的早期診斷也具有一定臨床意義。另外，2014年Thakur等[13]研究表明，k-562細(xì)胞(人慢性粒細(xì)胞白血病)、HCT116細(xì)胞(人大腸癌)、B16-F10細(xì)胞(小鼠黑色素瘤)中的exoDNA也可能成為潛在的腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。

腫瘤細(xì)胞在增殖過程中會(huì)不斷釋放TEX到周圍環(huán)境。檢測TEX中的活性分子是一種非侵入性的檢測方式，相對于傳統(tǒng)的檢測方式具有一定優(yōu)勢，為腫瘤臨床診斷治療和預(yù)后提供了一條新穎的途徑。由于外泌體幾乎在所有類型的體液中均可有效檢測(見表1)，目前在包括肝癌、胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤臨床病例已開始嘗試應(yīng)用一些腫瘤生物標(biāo)志物如甲胎蛋白(AFP)、糖類抗原199(CA199)等進(jìn)行輔助診斷。但是這些生物標(biāo)志物雖然能特異性地反應(yīng)其來源腫瘤細(xì)胞的表型，但都存在一個(gè)普遍問題，即腫瘤表型與標(biāo)志物的對應(yīng)性還沒有得到明確，也就是說即使發(fā)現(xiàn)了特異性的TEX標(biāo)志物，但并不代表這一標(biāo)志物一定只能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的結(jié)果，也有可能是其他原因?qū)е逻@一外泌體標(biāo)志物表達(dá)增高。所以，外泌體在臨床上應(yīng)用的前景雖然看好，但是還有許多問題有待深入研究。

4 展望

目前，對外泌體生物發(fā)生、化學(xué)組成和生物學(xué)功能已有了一定認(rèn)識。外泌體在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮的物質(zhì)交換和信息交流作用，得到腫瘤研究者的密切關(guān)注，外泌體活性分子作為潛在的腫瘤生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床的思想可能并不局限于某些類型的癌癥，也可能與多種類型的腫瘤或者其他復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。外泌體作為一種全新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，提示了未來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有待深入和誘人的研究走向。外泌體在腫瘤及相關(guān)疾病的診斷中重要的、潛在的臨床應(yīng)用前景被看好。

由于外泌體、細(xì)胞和環(huán)境因素之間存在復(fù)雜的相互作用，腫瘤發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程與機(jī)體免疫狀態(tài)也密切相關(guān)；而且，由于個(gè)體間遺傳多樣性的存在，個(gè)體在生理機(jī)能和代謝水平上的差異化調(diào)控的存在，使得人類對腫瘤及腫瘤發(fā)生發(fā)展中外泌體作用機(jī)制的了解還需要更多的臨床數(shù)據(jù)，遠(yuǎn)沒有獲得足夠具體和深入的機(jī)制解析，并獲得通用的診療標(biāo)準(zhǔn)；其研究結(jié)果所覆蓋的腫瘤類型也有限，且前期研究多來源于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。在體研究結(jié)果提示，即使同一腫瘤來源的外泌體，其作用機(jī)制也并不完全相同，所以，在宏觀和整體水平研究外泌體對機(jī)體生理和病理功能的影響是可能的途徑。這是否也提示基因組學(xué)各層面數(shù)據(jù)綜合研究遺傳與腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的關(guān)系具有可期待的前景?？傊?，腫瘤來源的外泌體多種活性分子作為腫瘤潛在的生物標(biāo)記物，真正應(yīng)用于臨床還需要大量的在體實(shí)驗(yàn)研究，積累更多臨床和基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，并通過對同一腫瘤不同群體和個(gè)體臨床樣本的對比研究，才能距離臨床精準(zhǔn)治療走得更近，才有可能徹底解決腫瘤的診斷和治療問題。

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[收稿2016-10-12;修回2016-10-28]

(編輯：譚秀榮)

Exosomes and its role in the tumor microenvironment and tumor diagnosis and treatment applications

YangLei1,WuMingsong1,2,LiXueying1

(1.Medical Genetics Department of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Special Key Laboratory of Oral Diseases Research,Higher Education Institutions of Guizhou Province,Research Center of Medicine and Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Exosomes are small membrane vesicles of endocytic origin and can be secreted by normal and tumor cells.Exosomes contain a variety of ingredients such as proteins,lipids,mRNAs and miRNAs.Exosomes can be targeted to transport to other tissues or cells,and participate in tumor growth,metastasis and immune response through the exchange of material and information between cells.It may serve as potential biomarkers of tumor diagnosis,and have profound significance in the study of cancer development and treatment.In this review,we describe the biogenesis and characteristics of exosomes,their role in tumor microenvironment and application in the tumor diagnosis and treatment.

exosomes；tumor microenvironment；biomarkers；tumor diagnosis

貴州省科技廳資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字[2013]2319、黔科合LH字[2014]7548)；貴州省教育廳特色藥用資源研發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(NO：黔科合人才團(tuán)隊(duì)字[2013]15)；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO：F-655)；遵義醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)扶持學(xué)科經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(NO：2012-2016)。

李學(xué)英，女，碩士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail：leexueying4722@163.com。

R730.49

A

1000-2715(2016)06-650-06