運動訓練和減量訓練對心肌哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和下游信號通路的影響

張 軍，曾凡星，王大鵬(.燕山大學 體育學院，河北 秦皇島 066004；.北京體育大學 運動人體科學學院，北京 00084)

?運動人體科學

運動訓練和減量訓練對心肌哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和下游信號通路的影響

張 軍1，曾凡星2，王大鵬1
(1.燕山大學 體育學院，河北 秦皇島 066004；2.北京體育大學 運動人體科學學院，北京 100084)

研究顯示運動訓練能激活mTOR信號通路，mTOR信號通路能影響心臟的結構和功能。那么，運動訓練和減量訓練對心肌哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和下游信號通路有何影響？值得深入研究。研究方法：72只雄性SD大鼠隨機分為8組： 3周大運動量訓練組和3周安靜對照組、3 d、6 d和2周減量訓練組及相應的安靜對照組。3周大運動量訓練采用上坡跑、坡度10%、速度20 m/min的中等強度運動和26 m/min的大強度運動。然后進行減量訓練，運動強度保持不變，運動時間由60 min減少到20 min。持續(xù)進行3 d、6 d和2周的減量訓練。末次運動后12 h麻醉取血，取左心室肌。Western blotting測mTOR、p70S6激酶(p70S6K)的蛋白表達和磷酸化。心肌組織的形態(tài)學利用HE染色光鏡觀察。研究結果：3周大運動量訓練和2周減量訓練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。3 d減量訓練組與安靜對照組相比，mTOR(Ser2448)磷酸化有顯著差異(P<0.05)。大運動量訓練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加(P<0.05)。減量訓練后，心肌p70S6K顯著減少(P<0.05)。S6K磷酸化和激活40S核糖體S6蛋白，有利于蛋白質(zhì)生物合成。結論：減量訓練造成心肌mTOR激活，對心臟有利。3周大運動量訓練和2周減量訓練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。3周大運動量訓練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加，促進蛋白質(zhì)翻譯，合成蛋白質(zhì)。然而，減量訓練后心肌p70S6K顯著減少。S6K脫磷酸減少蛋白質(zhì)翻譯成分的合成，蛋白質(zhì)合成顯著下降。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；p70S6激酶；減量訓練

科學訓練中的減量訓練很重要。關于減量訓練對心臟的影響尚不清楚。研究顯示運動訓練能激活mTOR信號通路，mTOR信號通路能影響心臟的結構和功能。筆者探討運動訓練和減量訓練對心肌mTOR的下游信號通路的影響，分析對心臟結構和功能的影響，為科學訓練提供實驗依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

72只雄性SD大鼠，7周齡，北體大實驗動物房中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，溫度保持在(24±1)℃，相對濕度(50±10)%。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組 大鼠1周適應性訓練后，隨機分為8組：3周大運動量訓練組(E3)和3周安靜對照組(C3)、3d(E4)、6d(E5)和2周減量訓練組(E6)，以及相應的安靜對照組(C4、C5和C6)。

1.2.2 實驗動物訓練方案 運動分為大運動量和減量訓練。運動訓練采用上坡跑、坡度10%、速度20 m/min的中等強度運動和26 m/min的大強度運動，3周內(nèi)運動時間逐漸增加。然后進行減量訓練，運動強度保持不變，運動時間逐漸減少。持續(xù)進行3 d、6 d和2周的減量訓練。

1.2.3 主要試劑和方法 用Western blotting方法測定mTOR、p70S6激酶(p70S6K)蛋白和磷酸化。Western blotting過程包括樣品準備、制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、化學發(fā)光和結果計算等?？贵w購自Cell Signaling公司。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，獨立樣本T檢驗，顯著性檢驗水平用P<0.05表示。運動訓練組與各自的安靜對照組相比，P<0.05表明具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 運動訓練和減量訓練對大鼠心肌組織形態(tài)的影響

HE染色可見各組心肌細胞著色為紅色，排列規(guī)則，染色均勻，輪廓清晰，縱切面心肌呈長圓柱狀。3周大運動量訓練和2周減量訓練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷的形態(tài)學改變(圖1)。

注：A 3周安靜對照組；B 3周大運動量訓練組；C 2周減量對照組；D 2周減量訓練組。圖1 大鼠心肌組織HE染色結果(×200)

2.2 運動訓練和減量訓練對心肌mTOR(Ser2448)磷酸化的影響

3 d減量訓練組與安靜對照組相比，心肌mTOR(Ser2448)的磷酸化有顯著差異(P<0.05)。大運動量訓練組與安靜對照組相比，心肌mTOR(Ser2448)磷酸化無顯著變化(P>0.05)(表1、圖2)。

表1 運動訓練和減量訓練后心肌mTOR(Ser2448)磷酸化的變化

注：#表示與3 d對照組相比，有顯著性差異，P<0.05。

2.3 運動訓練和減量訓練對心肌p70S6K的影響

與各自的對照組相比，3 d、6 d和2周減量訓練后，心肌p70S6K均顯著減少(P<0.05) (表2、圖3)。

表2 運動訓練和減量訓練后心肌p70S6K的變化

注：#△□分別表示與安靜對照組相比，有顯著性差異，P<0.05。

圖2 運動訓練和減量訓練后心肌mTOR(Ser2448)磷酸化的變化

圖3 運動訓練和減量訓練后心肌p70S6K的變化

2.4 運動訓練和減量訓練對心肌p70S6K(Thr389)磷酸化的影響

與3周安靜對照組相比，3周大運動量訓練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加(P<0.05) (表3、圖4)。

表3 運動訓練和減量訓練后心肌p70S6K(Thr389)磷酸化的變化

注：*表示與安靜對照組比較，有顯著性差異，P<0.05。

3 討論

3.1 運動訓練和減量訓練對心肌mTOR的影響

研究發(fā)現(xiàn)運動訓練激活心肌mTOR信號通路[1]。研究發(fā)現(xiàn)間歇性的有氧運動激活大鼠心臟mTOR和下游的信號蛋白[2]。本實驗的前期研究發(fā)現(xiàn)中等強度的運動后mTOR(Ser2448)磷酸化，運動后6 h達到峰值。大強度的運動后mTOR(Ser2448)磷酸化，運動后6 h達到峰值[3]。本研究發(fā)現(xiàn)3周運動訓練后減量訓練3 d，心肌mTOR(Ser2448)的磷酸化也顯著增加，說明運動訓練和減量訓練造成心肌mTOR的激活，對心臟有利。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通過營養(yǎng)素、胰島素、細胞能量和應激等細胞信號調(diào)節(jié)[4]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)3周大運動量訓練和2周減量訓練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。

圖4 運動訓練和減量訓練后心肌p70S6K(Thr389)磷酸化的變化

3.2 運動訓練和減量訓練對心肌p70S6K的影響

本實驗的前期研究發(fā)現(xiàn)中等強度與大強度運動后，大鼠心肌p70S6K蛋白含量不變；中等強度運動后12 h磷酸化的p70S6K (Thr389)達到峰值，運動后24 h仍未恢復；而大強度運動后24 h，磷酸化的p70S6K (Thr389)顯著降低[5]。研究發(fā)現(xiàn)中等強度運動后1 h、6 h和12 h，大鼠骨骼肌S6K(Thr389)磷酸化水平顯著提高，24 h后恢復到安靜水平。運動后S6K(Thr389)磷酸化與mTOR(Ser2448)磷酸化基本同步[3]。Mascher研究受試者在功率自行車上完成有氧耐力運動，結果骨骼肌mTOR(Ser2448)磷酸化，S6K(Ser424/Thr421)磷酸化[6]。Haddad等觀察急性運動后，與對側肌肉相比，p70S6K磷酸化增加2.5倍，然后迅速下降，說明一次運動后p70S6K激活的持續(xù)時間有限，而有規(guī)律地多次運動引起p70S6K持續(xù)激活。在第二次運動后，p70S6K磷酸化增加得到加強，第二次運動后40 h仍有顯著增加[7]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)3周大運動量訓練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加，促進蛋白質(zhì)翻譯，合成蛋白質(zhì)。然而，減量訓練后，心肌p70S6K顯著減少。而在減量訓練過程中，心肌p70S6K逐漸升高，而p70S6K(Thr389)磷酸化和p70S6K(Thr389)磷酸化/p70S6K逐漸降低。

S6K是mTOR下游的重要效應物。PI3K/Akt途徑介導增殖的上游信號后，mTOR磷酸化并激活S6K。隨后，S6K磷酸化和激活40S核糖體S6蛋白，促進40S核糖體亞基募集到有翻譯活性的多核糖體，有5’TOP序列的mRNAs翻譯增加。這些有5’TOP序列的mRNAs編碼核糖體蛋白、延伸因子，如eEF1α和eEF2、poly A結合蛋白和胰島素樣生長因子II，是蛋白質(zhì)生物合成的基礎。S6K脫磷酸減少蛋白質(zhì)翻譯成分的合成，蛋白質(zhì)合成顯著下降[8-10]。S6K通過提高mRNA翻譯控制細胞生長，5’TOP mRNA翻譯需要S6K[11]。rpS6是S6K的下游因子，一般認為rpS6磷酸化是S6K激活的結果。S6K能增加與eIF4B和eEF2激酶的接觸。eEF2激酶通過磷酸化翻譯延長因子eEF2使其受到抑制。S6K能使eEF2激酶磷酸化，抑制其活性，從而提高eEF2的活性[12]。S6K使eIF4B磷酸化，促進其募集到起始復合物。mTOR通過調(diào)節(jié)S6K產(chǎn)生有效的翻譯起始或延長過程[13]。

4 結論

運動訓練和減量訓練能引起心肌mTOR激活，是對心臟有利的因素。3周大運動量訓練和2周減量訓練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。3周大運動量訓練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加，促進蛋白質(zhì)翻譯，合成蛋白質(zhì)。然而，減量訓練后，心肌p70S6K顯著減少。S6K脫磷酸減少蛋白質(zhì)翻譯成分的合成，蛋白質(zhì)合成顯著下降。

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責任編輯：郭長壽

Effects of Training and Tapering on Myocardium mTOR and Backward Position of mTOR Signal Pathway

ZHANG Jun1，ZENG Fanxing2，WANG Dapeng1
(1.Physical Education College，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China；2.Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China)

Researches reveal that training activates mTOR signal pathway.mTOR signal pathway affects the formation and function of the heart.How do the training and tapering influence mTOR and backward position of signal pathway? It deserves further research.Methods：the 72 SD rats are divided into 8 groups randomly；3 weeks rest control group，3 weeks intensive training group，3 days rest control group，3 days tapering training group，6 days rest control group，6 days tapering training group，2 weeks rest control group，and 2 weeks tapering training group.We adopted moderate intensity(20 m/min，grade of 10%)and high intensity(26 m/min，grade of 10%) by turn in 3 weeks intensive training.Training time prolonged gradually from 60 min to 120min.After 3 weeks of intensive training，the process of tapering training followed.This process also adopted moderate intensity(20 m/min，grade of 10%)and high intensity(26 m/min，grade of 10%) by turn.But the training time decreased gradually.Tapering training included 3 kinds：3 days，6 days and 2 weeks tapering training.The left ventricle cardiac muscle has been got，and been tested for mTOR and p70S6K protein expression and protein phosphorylation by Western blotting.The conformation of cardiac muscle organization was observed by HE coloration in the light mirror.Results：The conformation of cardiac muscle organizations weren’t changed significantly after 3 weeks of great volume of training and 2 weeks of tapering.There were not any injuries in the cardiac muscles.MTORSer2448 phosphorylation increased significantly after tapering 3 days.P70S6K (Thr389) phosphorylation increased significantly after 3 weeks intensive training (P<0.05).P70S6K decreased significantly in cardiac muscle after tapering (P<0.05).S6K1 dephosphorylation decreases the synthesis of components of the protein translation system and results in a profound decrease in protein synthesis.Conclusions：Tapering can induce the activation of myocardium mTOR and is good for the heart.The conformation of cardiac muscle organizations wasn’t changed significantly after 3 weeks of great volume of training and 2 weeks of tapering.P70S6K (Thr389) phosphorylation increased significantly after 3 weeks intensive training which resulted in some protein translation increase，and in favor of protein synthesis.P70S6K decreased significantly in cardiac muscle after tapering which resulted in some protein translation decreased，and some protein synthesis decreased.

mTOR；p70S6K；tapering

2016-02-27；

2016-03-21

燕山大學博士基金項目(B920)；燕山大學青年教師自主研究計劃課題(15SKB009)。

張 軍(1981—)，男，講師，博士，主要研究方向為運動與心血管結構和功能。

G804.7

A

1004-0560(2016)02-0082-04