4種殺菌劑對葡萄霜霉病菌的毒力及田間防效

吉沐祥，吳祥，陳宏州，楊敬輝，莊義慶，姚克兵，李國平（江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇句容212400）

4種殺菌劑對葡萄霜霉病菌的毒力及田間防效

吉沐祥，吳祥，陳宏州，楊敬輝，莊義慶，姚克兵，李國平
（江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇句容212400）

摘要：為探明黃麻鏈霉菌NF0919菌株和枯草芽孢桿菌DJ-6對葡萄霜霉病的生防活性，采用葉盤法分別測定黃麻鏈霉菌NF0919發(fā)酵上清液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP、代森錳鋅和烯酰嗎啉對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)毒力，并進行防治葡萄霜霉病的田間試驗。結(jié)果表明：NF0919菌株發(fā)酵上清液、1.0× 1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP、代森錳鋅和烯酰嗎啉對葡萄霜霉病菌孢子萌發(fā)抑制的EC50值分別為96.2859、86.6038、69.9472、7.2636 μg/mL。NF0919菌株發(fā)酵20倍液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP1000倍液對葡萄霜霉病做預防性施藥時，2次藥后7天的防效分別為71.55%和70.71%，2次藥后14天的防效分別為67.54%和68.19%；當做治療性施藥時，2次藥后7天的防效分別為59.72%和56.07%，2次藥后14天的防效分別為56.88%和57.46%。2種供試生防菌劑的防效相當，且保護效果與50%代森錳鋅WP 300倍液均差異不顯著，而治療效果與40%烯酰嗎啉SC 200倍液均差異顯著?？梢姡S麻鏈霉菌NF0919菌株和枯草芽孢桿菌DJ-6 WP對葡萄霜霉病具有一定的生防潛力與開發(fā)的價值。

關(guān)鍵詞：黃麻鏈霉菌NF0919菌株；枯草芽孢桿菌DJ-6；葡萄霜霉??；生防活性

0　引言

由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的葡萄霜霉病(grape downy mildew)是葡萄生產(chǎn)中的第一大病害[1-2]，可造成大面積減產(chǎn)，是現(xiàn)階段制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大瓶頸[3]。目前，該病害主要為化學藥劑，常用的藥劑有波爾多液、百菌清、甲霜靈、霜脲氰、代森錳鋅、嘧菌酯、霜霉威、烯酰嗎啉、吡唑醚菌酯和68.75%氟吡菌胺·霜霉威鹽酸鹽（商品名為銀法利）等藥劑單劑或復配劑[4-7]。國內(nèi)最初引進甲霜靈防治卵菌病害時，忽視了該藥屬于高抗藥風險藥劑，未與多作用位點的保護性殺菌劑混用，導致甲霜靈使用2～3年后葡萄霜霉菌對其普遍產(chǎn)生抗藥性[8]。當前，多種化學藥劑的抗藥性風險不能忽視[9-12]，特別是近幾年，化學農(nóng)藥造成的食品安全事件、農(nóng)藥殘留超標事件時有發(fā)生，人們對生物農(nóng)藥的期盼越來越高。生物農(nóng)藥具有安全、有效、容易降解、不易產(chǎn)生抗性以及對人畜環(huán)境毒性小等特點，與保護生態(tài)環(huán)境和食品安全生產(chǎn)要求相吻合。因此，果品生產(chǎn)中也迫切需要以生物防治為主的病蟲害綠色防控技術(shù)。

筆者采用葉盤法分別測定了黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清液、枯草芽孢桿菌DJ-6 WP、代森錳鋅和烯酰嗎啉對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)毒力，并進行防治葡萄霜霉病的田間試驗，旨在研發(fā)葡萄霜霉病的生物防控技術(shù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

黃麻鏈霉菌(Streptomyces corchorusii)NF0919菌株（菌株保藏號為CGMCC No.3968，菌株專利號為ZL 201010236886.1），由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室提供[13]。

1.2供試藥劑

黃麻鏈霉菌NF0919菌株經(jīng)發(fā)酵后，收集發(fā)酵上清液，置于4℃冰箱中備用[14]。1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP（農(nóng)藥試驗證號SY201200899），江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所研制，江蘇綠盾植保農(nóng)藥實驗有限公司加工。將該藥劑用無菌水配制成10000 μg/mL的母液置于4℃冰箱中備用。

96%代森錳鋅、50%代森錳鋅WP，利民化工股份有限公司；98%烯酰嗎啉，山東盛帝化工銷售有限公司；40%烯酰嗎啉SC，陜西先農(nóng)生物科技有限公司。分別將96%代森錳鋅和98%烯酰嗎啉用適量吡啶和丙酮溶解后再加入無菌水，并加入1%的吐溫-80做乳化劑，均配制成10000 μg/mL的母液置于4℃冰箱中備用。

1.3室內(nèi)毒力活性測定

1.3.1孢子懸浮液的配制2014年5月，從江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所內(nèi)的‘夏黑’葡萄上采集田間自然發(fā)病的葉片，用無菌水沖洗病葉表面的孢子囊后，將病葉置于25℃條件下保濕24 h來培養(yǎng)新鮮的孢子囊，然后收集新孢子囊并將孢子囊濃度調(diào)整至1.0×106個/mL置于4℃冰箱中備用。

1.3.2藥劑濃度設(shè)計分別將黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP、代森錳鋅和烯酰嗎啉的濃度設(shè)計為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625 μg/mL；均為2倍稀釋的8個不同濃度梯度，以無菌水為對照。

1.3.3接種方法采用葉盤法[15-16]，采集‘夏黑’葡萄健康新稍的4～6位葉片，并在葉片的葉脈間用打孔器制取直徑1.5 cm的葉盤，將10μL 1.0×106個/mL的葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液接種于葉盤中央。每處理20個葉盤，重復4次，置于培養(yǎng)箱內(nèi)在25℃，濕度80%，光照12 h/d條件下培養(yǎng)7天后，調(diào)查發(fā)病情況。

1.3.4統(tǒng)計方法病情調(diào)查采用6級記載法[17]，調(diào)查病級后計算病情指數(shù)以及各藥劑不同濃度對葡萄霜霉病菌孢子萌發(fā)的抑制率。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出各藥劑抑制葡萄霜霉病菌孢子萌發(fā)的毒力回歸方程和抑制中濃度(EC50)，并以代森錳鋅的EC50值為對照求出相對毒力指數(shù)。病情指數(shù)和抑制率計算如式(1)～ (2)。

病情指數(shù)=[Σ(各級發(fā)病葉盤數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值)/總?cè)~盤數(shù)×9]×100………………………………………(1)

抑菌率=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100%………………………………………(2)

1.4田間藥效試驗

1.4.1試驗點概況試驗在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所內(nèi)的葡萄園進行。葡萄園內(nèi)地勢平坦，土壤為下蜀馬肝土，pH 6.8左右，有機質(zhì)含量1.45%。供試品種為‘夏黑’。葡萄樹齡7年，為籬架式栽培，栽培管理水平良好，當季內(nèi)未使用其他相關(guān)藥劑。

1.4.2試驗設(shè)計分別設(shè)NF0919菌株發(fā)酵上清20倍液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP 1000倍液、50%代森錳鋅WP 300倍液（推薦劑量）和40%烯酰嗎啉SC 200倍液（推薦劑量）噴霧防治，以清水噴霧為對照，試驗3次重復，小區(qū)面積30 m2，用水量為600 kg/hm2。

表1　供試藥劑對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

表2　供試藥劑對葡萄霜霉病的田間防效

保護性施藥：在田間有極少量葡萄葉片發(fā)病但供試植株無發(fā)病葉片時施藥，2014年5月5日第1次施藥；10天后第2次施藥；分別調(diào)查2次藥后7、14天病指。

治療性施藥：在供試葡萄植株葉片零星發(fā)病時施藥，2014年6月3日調(diào)查藥前病指，并第1次施藥；10天后第2次施藥；分別調(diào)查2次藥后7、14天病指。病情調(diào)查及藥效計算方法參照農(nóng)藥田間試驗準則[17]。

1.4.3安全性調(diào)查安全性調(diào)查方法參照農(nóng)藥田間試驗準則[17]。

2　結(jié)果與分析

2.1室內(nèi)毒力測定結(jié)果

室內(nèi)毒力測定得出，NF0919菌株發(fā)酵上清液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP、代森錳鋅和烯酰嗎啉對葡萄霜霉病菌孢子萌發(fā)抑制的EC50值分別為96.2859、86.6038、69.9472、7.2636 μg/mL。以代森錳鋅的EC50值為對照得出，NF0919菌株發(fā)酵上清液、1.0× 1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP和烯酰嗎啉的相對毒力指數(shù)分別為1.3766、1.2381、0.1038。烯酰嗎啉對霜霉病菌孢子萌發(fā)的抑制活性最強，NF0919菌株發(fā)酵上清液的抑制活性最低。NF0919菌株發(fā)酵上清液以及枯草芽孢桿菌DJ-6 WP對霜霉病菌孢子萌發(fā)的抑制的EC50值和代森錳鋅的EC50值分別相差約為1.4、1.2倍（表1）。這表明，2種供試的生防菌劑對葡萄霜霉病菌孢子的萌發(fā)具有一定的抑制活性，但抑制活性均略低于代森錳鋅，而明顯低于烯酰嗎啉。

2.2田間藥效試驗結(jié)果

田間試驗結(jié)果得出：當在田間有零星發(fā)?。ㄔ囼炛仓隉o發(fā)病葉片）做保護性施藥時，2次藥后7、14天，黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清20倍液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP 1000倍液對葡萄霜霉病的防效相當，且均略低于50%代森錳鋅WP 300倍液的防效，但差異不顯著；2次藥后7、14天，NF0919發(fā)酵上清液20倍液和枯草芽孢桿菌DJ-6 WP1000倍液對葡萄霜霉病的防效均低于40%烯酰嗎啉SC 200倍液的防效，且差異顯著。當在田間普遍開始發(fā)病做治療性施藥時，2次藥后7、14天，NF0919發(fā)酵上清液20倍液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP 1000倍液的防效相當，但防效均低于50%代森錳鋅WP 300倍液和40%烯酰嗎啉SC 200倍液的防效，且差異顯著（表2）。這表明，NF0919菌株發(fā)酵上清液和枯草芽孢桿菌DJ-6 WP在防治葡萄霜霉病均有一定的效果，且保護效果與保護性殺菌劑代森錳鋅相當，而治療效果較差。

2.3安全性調(diào)查

經(jīng)目測觀察，試驗區(qū)域內(nèi)葡萄生長發(fā)育正常，沒有發(fā)生藥害，表明供試藥劑在試驗劑量范圍內(nèi)對葡萄安全。

3　結(jié)論

本研究得出，自主研發(fā)的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清液和枯草芽孢桿菌DJ-6 WP對葡萄霜霉病菌孢子萌發(fā)均具有一定的抑制活性，且抑制活性均略低于保護性殺菌劑代森錳鋅，但明顯低于治療性殺菌劑烯酰嗎啉。NF0919菌株發(fā)酵上清20倍液和1.0× 1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP 1000倍液對葡萄霜霉病的防效相當，且保護效果與保護性殺菌劑代森錳鋅在推薦劑量下噴施時的防效無顯著差異，但治療效果較差，并且明顯低于代森錳鋅和治療性殺菌劑烯酰嗎啉的防效。因此，筆者認為黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清液和枯草芽孢桿菌DJ-6 WP在防治葡萄霜霉病時，可作預防性的噴霧防治。

4　討論

目前葡萄霜霉病的防治主要依賴化學防治[18]，由于化學防治的昂貴投入及其導致的環(huán)境公害迫使人們尋求新的防治途徑[19]。近年來，葡萄霜霉病的生物防治是研究熱點之一。陳浩等[20]報道，枯草芽孢桿菌B-FS01無論在室內(nèi)還是在田間，對葡萄霜霉病菌均具有優(yōu)良的防效。岳憲化等[21]報道，哈茨木霉菌可濕性粉劑對葡萄霜霉病具有較好的防效。扈進冬等[22]報道，多粘類芽孢桿菌PB-2對葡萄霜霉病具有較好的防效，有希望開發(fā)成為一種可有效防治葡萄霜霉病的生防制劑。藏超群等[23]報道，生防細菌SY286對葡萄霜霉病菌具有較強的抑菌作用，并有望使其在葡萄霜霉病的生物防治中發(fā)揮更大潛能。楊泓威等[24]報道，植物源農(nóng)藥丁子香酚是防治黃瓜疫霉病的優(yōu)良殺菌劑。李寶燕等[25]報道，丁子香酚、苦參堿、多抗霉素和小檗堿可作為防控葡萄霜霉病的有效生物藥劑使用。但在當前葡萄生產(chǎn)實際中，對霜霉病具有高效穩(wěn)定防效的生防制劑還鮮有報道。

本研究中筆者采用葉盤法分別測定了自主研發(fā)的生防菌劑——黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP以及生產(chǎn)中常用的殺菌劑——代森錳鋅和烯酰嗎啉對葡萄霜霉病菌孢子萌發(fā)的抑制活性，結(jié)果表明4種供試殺菌劑的毒力大小順序為烯酰嗎啉>代森錳鋅>枯草芽孢桿菌DJ-6 WP>NF0919菌株發(fā)酵上清液，內(nèi)吸治療性殺菌劑烯酰嗎啉的毒力最強，2種供試生防菌劑的毒力略低于保護性殺菌劑代森錳鋅，可見2種供試生防菌劑對葡萄霜霉病菌孢子萌發(fā)具有一定的抑制活性。需指出的是，黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清液和枯草芽孢桿菌DJ-6 WP對葡萄霜霉病菌的作用機理還有待進一步研究，因而該方法測定的室內(nèi)毒力僅能作為藥劑效價的參考。

在田間實際應(yīng)用時，黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵上清液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢桿菌DJ-6 WP對葡糖霜霉病均具有一定的防治效果，且保護效果優(yōu)于治療效果。目前上述自主研發(fā)的2種生防菌劑均已初步開發(fā)成為制劑，枯草芽孢桿菌DJ-6 WP已進入農(nóng)藥登記的田間試驗階段。

參考文獻

[1]李海強.石河子地區(qū)葡萄霜霉病的發(fā)生規(guī)律及防治研究[D].新疆:石河子大學,2009:2.

[2]Pal Mieri M C, Perazzolli M, Matafora V, et al. Proteomic Analysis of Grapevine Resistance Induced by Trichoderma harzianurn T39 Reveals specific Defence Pathways Activated against Downy Mildew[J]. J Exp Bot,2012,63(17):6237-6251.

[3]王忠躍.中國葡萄病蟲害與綜合防控技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009:3-4.

[4]張松強,王立如.田間藥劑防治葡萄霜霉病的效果[J].安徽農(nóng)學通報,2007,13(12):169-170.

[5]Cadle-Davidson L.Variation within and between Vitis spp. for foliar resistance to the downy mildew pathogen plasmoparaviticola[J]. Plant disease,2008,92(11):1577-1584.

[6]朱衛(wèi)剛,胡偉群,劉燕君,等.新型殺菌劑嘧菌酯對葡萄霜霉病室內(nèi)生物活性評價[J].中國南方果樹,2011,40(4):80-81.

[7]李艷瓊.5種殺菌劑對葡萄霜霉病的控制效果[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報,2011,46(6):62-65.

[8]畢秋艷,馬志強,韓秀英,等.葡萄霜霉病菌對甲霜靈抗藥性治理及其田間抗藥菌株遺傳穩(wěn)定性分析[J].植物病理學報,2014,44(3): 302-308.

[9]Gisi U,Chin K M,Knapova G,et al.Recent developments in elucidating modes of resistance to phenylamide,DMI and strobilurin fungicides[J].Crop Protection,2000,19:863-872.

[10]Benign M,Bompeix G.Postharvest control of Phytophthora cryptogea of witloof chicory with different fungicides and possible occurrence of resistant strains[J].Crop Protection,2006,25(4):350-355.

[11]羅彥平,王強,劉琳,等.新疆葡萄霜霉病對4種殺菌劑的敏感性研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學,2013,50(5):851-856.

[12]李寶燕,王英姿,劉學卿,等.3種殺菌劑對葡萄霜霉病菌的毒力測定和田間藥效試驗[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(1):98-99.

[13]楊敬輝,文平蘭,陳宏州,等.放線菌NF0919的鑒定及生防活性[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2013,22(4):201-206.

[14]陳宏州,莊義慶,楊敬輝.黃麻鏈霉菌NF0919菌株對草莓枯萎病菌的生防活性初探[J].江西農(nóng)業(yè)學報,2014,26(11):54-57.

[15]Tooly P W,Sweigard J A,Fry w E,et a1.Fitness and virulence of Phytophthora infestans isolates fromsexual populations[J]. Phytopathology,1986,76:1209-1212.

[16]方中達.植病研究方法(第3版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998:60.

[17]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.農(nóng)藥田間藥效試驗準則(二):殺菌劑防治葡萄霜霉病藥效試驗準則[M].北京:中國標準出版社,2000:234-238.

[18]廉俊平,張引平.淺談葡萄霜霉病的發(fā)生與防治[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備,2011(4):34-35.

[19]李興紅,燕繼曄.葡萄病蟲害防治關(guān)鍵技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2012:60.

[20]陳浩,胡梁斌,唐春平,等.枯草芽孢桿菌B-FS01對葡萄霜霉病的防治效果[J].植物保護,2011,37(6):194-197.

[21]岳憲化,胡夫防,段麗峰,等.哈茨木霉菌防治葡萄霜霉病試驗[J].中國果樹,2014(2):54-56.

[22]扈進冬,吳遠征,李紀順,等.拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2及其制劑對葡萄霜霉病的防效測定[J].山東農(nóng)業(yè)科學,2014,27(3):30-33.

[23]藏超群,趙奎華,劉長遠,等.生防菌株SY286對葡萄霜霉病菌的抑菌效果[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(2):221-224.

[24]楊泓威,易圖水,雷穎.丁子香酚對黃瓜疫霉菌的室內(nèi)毒力測定[J].湖南農(nóng)業(yè)科學,2012(3):68-69.

[25]李寶燕,王培松,王英姿.葡萄霜霉病的生物藥劑防治[J].農(nóng)藥,2014, 53(11):853-855.

Toxicity Test and Field Control Effect of 4 Different Fungicides on Grape Downy Mildew

Ji Muxiang, Wu Xiang, Chen Hongzhou, Yang Jinghui, Zhuang Yiqing, Yao Kebing, Li Guoping
(Zhenjiang Institute of Agricultural Science, Jurong 212400, Jiangsu, China)

Abstract:To investigate the biocontrol activity of Streptomyces corchorusii strain NF0919 and Bacillus subtilis DJ-6 WP to grape downy mildew, we determined the indoor toxicity of the supernatant of S. corchorusii strain NF0919, 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP, mancozeb and dimethomorph on Plasmopara viticola by using leaf disc method, respectively, and the field control tests were conducted. The results showed that the EC50values of the supernatant of strain NF0919, 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP, mancozeb and dimethomorph were 96.2859, 86.6038, 69.9472 and 7.2636 μg/mL, respectively. The values of field control effect in preventive experiments on grape downy mildew on the 7th day after 2 times spraying with 20 times liquid of the supernatant of strain NF0919 and 1000 times liquid of 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP were 71.55% and 70.71%, and the values of field control effect on the 14th day after 2 times spraying were 67.54% and 68.19%, respectively. The values of field control effect in curative experiments on the 7th day after 2 times spraying with 20 times liquid of the supernatant of strain NF0919 and 1000 times liquid of 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP were 59.72% and 56.07%, the values of field control effect on 14th day after 2 times spraying were 56.88% and 57.46%, respectively. The field control effect of the two kinds of the tested biocontrol agents was equivalent. The protective effect between each of the tested biocontrol agents and 300 times liquid of 50% mancozeb WPhad no significant difference, but there were significant differences of the efficacy between each of the tested biocontrol agents and 200 times liquid of 40% dimethomorph SC. In conclusion, the S. corchorusii strain NF0919 and B. subtilis DJ- 6 WP had certain biocontrol potential to grape downy mildew and value of development. Key words: Streptomyces corchorusii Strain NF0919; Bacillus subtilis DJ-6; Grape Downy Mildew; Biocontrol Activity

中圖分類號：S482.2

文獻標志碼：A論文編號：cjas15060026

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目“江蘇丘陵地區(qū)葡萄主要病害高效安全防控技術(shù)研究”[CX(14)2056]；鎮(zhèn)江市科技支撐計劃項目“提高蘇南丘陵地區(qū)應(yīng)時鮮果生產(chǎn)市場競爭力的品種和技術(shù)的集成示范”(NY2013024)。

第一作者簡介：吉沐祥，男，1963年出生，江蘇寶應(yīng)人，研究員，本科，主要從事果樹植保與農(nóng)藥研究開發(fā)工作。

通信地址：212400江蘇省句容市弘景路1號江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，Tel：0511-80978086，E-mail：jilvdun2800@163.com。 212400江蘇省句容市弘景路1號江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，Tel：0511-80978006，E-mail：jrlgp@126.com。

通訊作者：李國平，男，1962年出生，江蘇武進人，研究員，推廣碩士，主要從事果樹與丘陵農(nóng)業(yè)資源開發(fā)利用研究。

收稿日期：2015-06-30，修回日期：2015-09-06。