非小細(xì)胞肺癌組織中BRCA1和MDM2表達(dá)意義

葛　華，丁　敏，王　虹，王　秦，李長(zhǎng)江，張美英,4，王建英,4

(1. 中煤一公司嶺北職工醫(yī)院，河北 邯鄲 056003,2. 河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056001，3. 河北省邯鋼職工醫(yī)院，河北 邯鄲 056000;4. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

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臨床研究

非小細(xì)胞肺癌組織中BRCA1和MDM2表達(dá)意義

葛華1，丁敏2，王虹3，王秦1，李長(zhǎng)江1，張美英1,4，王建英1,4

(1. 中煤一公司嶺北職工醫(yī)院，河北 邯鄲 056003,2. 河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056001，3. 河北省邯鋼職工醫(yī)院，河北 邯鄲 056000;4. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

[摘要]目的探討非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)組織中乳腺癌易感基因(BRCA1)和鼠雙微體基因2(MDM2)的表達(dá)情況及臨床意義。方法收集NSCLC組織標(biāo)本48例和癌旁組織20例，采用免疫組化SP法檢測(cè)各組中BRCA1和MDM2的表達(dá)，分析 BRCA1 與臨床病理指標(biāo)及MDM2的關(guān)系。結(jié)果NSCLC組織中BRCA1異常表達(dá)和MDM2陽性率明顯高于癌旁組織(P<0.05)；BRCA1異常表達(dá)與NSCLC的腫瘤分期(TNM)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，與年齡、性別、組織類型、分化程度無顯著性相關(guān)(P均>0.05)。MDM2陽性表達(dá)與NSCLC的分化程度、腫瘤分期(TNM)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，與年齡、性別無顯著性相關(guān)(P均>0.05)。 相關(guān)性分析得出BRCA1和MDM2的表達(dá)存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論BRCA1和MDM2在NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能起重要作用，BRCA1和MDM2與NSCLC的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為預(yù)后的判斷指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]非小細(xì)胞肺癌；BRCA1蛋白；MDM2蛋白；免疫組織化學(xué)

在我國(guó)肺癌發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì)，是目前威脅我國(guó)居民生命和健康的重要疾病之一，由于多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已是中晚期，放射治療成為主要的治療手段之一，這也是肺癌總生存率低的主要原因。乳腺癌易感基因(BRCA1)在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等組織中研究較多，屬于和女性腫瘤相關(guān)的易感基因，在女性腫瘤組織中研究較多。鼠雙微染色體2(MDM2)生物學(xué)功能是干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng)，參與到組織細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等過程，能在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖方面發(fā)揮作用。目前BRCA1及MDM2在肺癌中表達(dá)情況的報(bào)道少見。本研究通過免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)BRCA1及MDM2在NSCLC組織中的表達(dá)情況，分析其在NSCLC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，以期幫助臨床對(duì)NSCLC的早期診斷和治療提高依據(jù)和理論支持，并產(chǎn)生一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1臨床資料

1.1一般資料選取NSCLC標(biāo)本48例作為NSCLC組，男36例，女12例;年齡31～75歲，中位年齡57.21歲，其中>50歲40例，≤50歲8例；腫瘤高分化22例，中分化23例，低分化3例；肺鱗癌36例，肺腺癌9例，大細(xì)胞癌3例；TNM分期Ⅰa期5例、Ⅰb 期9例、Ⅱa期10例、Ⅱb期6例、 Ⅲa期7例、Ⅲb期9例、Ⅳ期2例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。選取取自腫瘤遠(yuǎn)端3 cm 以外或手術(shù)切緣經(jīng)病理檢查證實(shí)未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞正常組織作為對(duì)照組。

1.2方法BRCA1和MDM2表達(dá)檢測(cè)采用SP免疫組化法，按試劑盒說明書操作，取已知乳腺癌組織切片作為陽性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。具體操作步驟為：常規(guī)切片處理后，進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶滅活，加雙氧水孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次；進(jìn)行抗原修復(fù)，把切片放入枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸(95 ℃)孵育15～20 min，自然冷卻后PBS緩沖液沖洗3次；正常血清工作液封閉10 min，傾去勿洗；滴加一抗4 ℃過夜，PBS緩沖液沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次；滴加辣根過氧化物酶工作液，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次；DAB反應(yīng)顯色，自來水沖洗；蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。鏡下觀察以每張切片均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～50%為()，>50%為()。+～為陽性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12組BRCA1陽性率比較NSCLC組和對(duì)照組BRCA1陽性率分別為58%(28/48)、35%(7/20),MDM2陽性率分別為81%(39/48)和25%(5/20)。2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2NSCLC不同臨床病理參數(shù)BRCA1和MDM2陽性表達(dá)情況比較TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者的BRCA1陽性率顯著低于Ⅲ+Ⅳ期(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者BRCA1陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，高分化者M(jìn)DM2陽性率顯著高于中分化者(P<0.05)，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者M(jìn)DM2陽性率顯著高于Ⅲ+Ⅳ期(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)DM2陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表1。

表1　NSCLC不同臨床病理參數(shù)BRCA1和MDM2

2.3NSCLC患者中BRCA1和MDM2蛋白相關(guān)性BRCA1和MDM2蛋白表達(dá)具有明顯相關(guān)性(r=0.460,P<0.05)。見表2。

表2　BRCA1和MDM2表達(dá)的相關(guān)性　例

3討論

同大多數(shù)腫瘤一樣，NSCLC的形成過程包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、細(xì)胞的凋亡、異常增生、DNA損傷修復(fù)的缺失異常等。隨著對(duì)NSCLC生物學(xué)治療的重視，從基礎(chǔ)水平對(duì)NSCLC進(jìn)行研究也越來越受到追捧。

BRCAl基因是迄今發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)、重要的、經(jīng)典的易感基因，在臨床應(yīng)用較普遍，如在宮頸癌[1]、卵巢癌[2]等婦科腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)其明顯增高，且受到國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的重視。BRCA1 基因全長(zhǎng) 100 kb，定位于人染色體 17q12—21，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA 損傷的修復(fù)、細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡等多種生物學(xué)途徑[3]，被認(rèn)為是基因組的看護(hù)者，在 DNA 修復(fù)中起重要作用，維持基因組的完整[4]，當(dāng) BRCA1 基因發(fā)生突變后，使其編碼的蛋白質(zhì)功能降低或者缺失，使細(xì)胞分化受阻，失去正常分化對(duì)增殖的作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡變和惡性腫瘤的發(fā)生[5]。BRCA1 蛋白在人的多數(shù)組織中也有不同程度的表達(dá)，在胸腺、睪丸中表達(dá)最高，乳腺和卵巢中表達(dá)中等，通過大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在許多腫瘤中存在著 BRCA1 蛋白的異常高表達(dá)，這種異常高表達(dá)稱為基因突變，BRCA1 異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系[6]。另外臨床研究發(fā)現(xiàn)此基因失活的腫瘤對(duì)順鉑相對(duì)敏感，認(rèn)為BRCA1 的高表達(dá)使細(xì)胞修復(fù)能力增強(qiáng)，從而使細(xì)胞不易被化療藥物殺死，導(dǎo)致耐藥[7]。本研究發(fā)現(xiàn)BRCA1蛋白在NSCLC中的呈異常表達(dá)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期較差的NSCLC組織中BRCA1異常表達(dá)增高，可見其異常表達(dá)在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展起到促進(jìn)作用；而其與NSCLC患者的年齡、性別、組織類型、分化程度沒有明顯相關(guān)性， 考慮到在NSCLC組織中BRCA1異常表達(dá)情況及對(duì)順鉑的敏感性，BRCA1檢測(cè)值得在有條件的臨床上推廣。

癌基因MDM2于1987年被發(fā)現(xiàn)[8]，其作為原癌基因在正常組織中含量非常少，但是在組織內(nèi)發(fā)生突變或者異常表達(dá)時(shí)引起多種腫瘤的發(fā)生，如肝癌、食管癌、胃癌[9-11]等。這些調(diào)控作用通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期來完成的，通過MDM2可以激活E2F-1，E2F-1正常情況下與口袋蛋白(Rb)結(jié)合保持穩(wěn)定性，被激活后E2F-1蛋白與Rb蛋白分離，促使細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期。G1期進(jìn)入S期對(duì)于細(xì)胞周期的運(yùn)行和完成是至關(guān)重要[12]，所以說高表達(dá)MDM2表現(xiàn)出癌基因的功能，MDM2通過調(diào)節(jié)E2F-1對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，形成正反饋環(huán)。許多研究表明在大腸癌、乳腺癌[13-14]等中能檢測(cè)到MDM2表達(dá)增加、失調(diào)，本研究與之一致，并且其表達(dá)能力與腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)情況有密切相關(guān)性，提示腫瘤與 MDM2 的預(yù)后有密切的關(guān)系。本研究的48例NSCLC組織中有39例癌基因MDM2陽性表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)其在NSCLC組織中的表達(dá)隨組織學(xué)分化程度增高陽性表達(dá)率增高，并與淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期有明顯差異性，而與患者年齡、性別、吸煙史及病理類型之間無顯著性差異，說明在NSCLC組織中癌基因MDM2表達(dá)越高腫瘤的惡性度越高。

在對(duì)NSCLC中BRCA1和MDM2異常表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，兩者在NSCLC組中表達(dá)呈正相關(guān)。它們?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展中應(yīng)該存在一定的聯(lián)系，兩者都作用于細(xì)胞周期G1—S期，BRCA1發(fā)生磷酸化異常表達(dá)，而MDM2對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用點(diǎn)恰恰是這一點(diǎn)，兩者共同促進(jìn)細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期，共同對(duì)NSCLC發(fā)生和發(fā)展起促進(jìn)作用。另外，考慮到在臨床上腫瘤化療時(shí)，可以用BRCA1作為耐藥判斷指標(biāo)，BRCA1具有一定的實(shí)用價(jià)值，故應(yīng)該對(duì)其深入開展研究。

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[收稿日期]2015-06-18

[中圖分類號(hào)]R734.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)06-0607-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.011

[基金項(xiàng)目]河北省邯鄲市科技計(jì)劃項(xiàng)目(1423108134)