蜘蛛香中總環(huán)烯醚萜及2個(gè)指標(biāo)性成分baldrinal和11—ethoxyviburtinal含量測(cè)定

李萍 閆興麗 高增平 施金鈸 楊貝貝 季文琴 孟慶卿 王寶華

摘要：目的 建立蜘蛛香藥材中總環(huán)烯醚萜類成分及2種環(huán)烯醚萜類成分baldrinal（纈草醛）和11-ethoxyviburtinal（環(huán)戊烷-吡喃-7-甲醛，4-乙氧基甲基）的含量測(cè)定方法，并測(cè)定3個(gè)產(chǎn)地蜘蛛香藥材中的成分含量。方法 采用紫外分光光度法，以11-ethoxyviburtinal為對(duì)照品，在波長(zhǎng)288 nm處測(cè)定總環(huán)烯醚萜的含量；采用高效液相色譜法測(cè)定baldrinal和11-ethoxyviburtinal的含量，采用Phenomenex Luna C18色譜柱，以乙腈-磷酸水為流動(dòng)相，流速為0.95 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果 蜘蛛香中總環(huán)烯醚萜類成分的濃度在2.088～14.616 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，baldrinal、11-ethoxyviburtinal分別在74.88～224.64 μg、41.6～249.60 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率均良好。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，可用于蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蜘蛛香；紫外分光光度法；高效液相色譜法；環(huán)烯醚萜類成分；含量測(cè)定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.023

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）06-0088-04

Abstract： Objective To establish a method for content determination of total iridoid compounds and baldrinal and 11-ethoxyviburtinal from Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix； To determine the contents of total iridoid compounds and baldrinal and 11-ethoxyviburtinal in Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix from three medicinal origins. Methods UV spectrophotometry was applied， 11-ethoxyviburtinal （cyclopentane-pyran-7-formaldehyde， 4-ethoxy methyl） was set as the reference substance， and the content of total iridoid compounds was determined at 288 nm. HPLC method was used to simultaneously determine the contents of baldrinal and 11-ethoxyviburtinal. The HPLC analysis was performed on a Phenomenex Luna C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was composed of acetonitrile-water in gradient elution at a flow rate of 0.95 mL/min. The detection wavelength was 288 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The total iridoid compounds， baldrinal and 11-ethoxyviburtinal were in good linearity within the ranges of 2.088–14.616 μg/μL， 74.88–224.64 μg， and 41.6–249.6 μg， respectively. This method was precise， and with good repeatability， stability and recovery rate. Conclusion The method is accurate， simple， rapid， which can be used for the quality control of Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix.

Key words： Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix； UV； HPLC； total iridoid compounds； content determination

蜘蛛香為敗醬科纈草屬植物Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖及根，主產(chǎn)于四川、貴陽(yáng)等地，始載于《本草綱目》，具有理氣止痛、消食止瀉、祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)驚安神功效，用于脘腹脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、失眠[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蜘蛛香中含有許多化學(xué)成分，其中環(huán)烯醚萜類化合物為蜘蛛香的主要有效成分。藥理研究表明，蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分具有抑制胃腸功能亢進(jìn)、降低內(nèi)臟敏感性、改善精神狀態(tài)的作用，并具有良好的鎮(zhèn)痛作用[2-3]。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》將纈草三酯和乙酰纈草三酯作為其含測(cè)指標(biāo)[1]，但此類化合物不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)中有許多活潑的官能團(tuán)，在酸、熱、光的影響下，易發(fā)生開(kāi)環(huán)、斷鍵和某些重排反應(yīng)而降解[4]，而經(jīng)過(guò)乙醇回流提取可將纈草素類成分轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的降解產(chǎn)物baldrinal（纈草醛）和11-ethoxyviburtinal（環(huán)戊烷-吡喃-7-甲醛，4-乙氧基甲基）。有關(guān)蜘蛛香總環(huán)烯醚萜類成分的含量測(cè)定至今未見(jiàn)報(bào)道，為深入研究蜘蛛香的藥理活性成分及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，首先需建立該類化合物的含量測(cè)定方法。本研究采用紫外分光光度法檢測(cè)蜘蛛香總環(huán)烯醚萜類成分，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定2個(gè)指標(biāo)性成分baldrinal、11-ethoxyviburtinal的含量，為進(jìn)一步完善蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）：SPD-20A二級(jí)陣列檢測(cè)器（PDA），SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20A5在線脫氣機(jī)，CTO-10ASvp柱溫箱和島津LC-solution工作站；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DJ-04型粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限司）；Sartorious BT 25S型1/100000電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

11-ethoxyviburtinal對(duì)照品、baldrinal對(duì)照品，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制藥教研室自制，HPLC測(cè)定含量均≥98%；3批蜘蛛香藥材分別購(gòu)自四川、云南、貴州，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥系石晉麗教授鑒定，均為敗醬科纈草屬植物Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖及根。乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，乙醇、甲醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總環(huán)烯醚萜類成分含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液與供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的11-ethoxyviburtinal對(duì)照品2.60 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。蜘蛛香藥材粉碎，過(guò)24目篩，取粉末5.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加70%乙醇200 mL，浸泡1 h，加熱回流提取12 h，放置冷卻，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液1 mL置100 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白對(duì)照，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液的吸收曲線基本一致，在288 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，且無(wú)干擾，故選擇288 nm為最大吸收波長(zhǎng)。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。以甲醇為空白，在288 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.047 2X+0.028 7，r=0.999 9，表明在2.088～14.616 μg/mL范圍內(nèi)線性內(nèi)關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD=0.06%，結(jié)果表明精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在0、10、20、30、40、50、60 min分別測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD=0.57%（n=7），表明穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批蜘蛛香藥材粉末6份，每份約5.0 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果RSD=1.98%，表明重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批已知含量的蜘蛛香藥材粉末6份，分別精密加入對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，計(jì)算平均回收率及RSD。結(jié)果總環(huán)烯醚萜的平均回收率為101.21%，RSD=1.54%，見(jiàn)表1。表明本方法回收率較好，測(cè)定結(jié)果可靠。

2.2 baldrinal和11-ethoxyviburtinal含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液與供試品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的baldrinal和11-ethoxyviburtinal對(duì)照品2.34、2.60 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，分別取5 mL置于25 mL容量瓶中，定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，baldrinal、11-ethoxyviburtinal的濃度分別為18.72、20.8 μg/mL。蜘蛛香藥材粉碎，過(guò)24目篩，取粉末5.0 g，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，加70%乙醇200 mL，浸泡1 h，加熱回流提取12 h，放置冷卻，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～15 min，35%A；15～30 min，30%A）；流速：0.95 mL/min，柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm。分別精密吸取20 μL對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣， baldrinal和11-ethoxyviburtinal的保留時(shí)間分別約為16、24 min，與其他組分分離較好（R>1.5），色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL依次進(jìn)樣，按“2.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。baldrinal、11-ethoxyviburtinal的回歸方程分別為Y=4 793 006.52X+5375.24（r=0.999 9）、Y=5 247 320.06X-185.80（r=0.999 9）。結(jié)果表明，baldrinal和11-ethoxyviburtinal分別在74.88～224.64 μg、41.60～249.60 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，baldrinal和11-ethoxyviburtinal峰面積的RSD分別為0.62%和0.53%，結(jié)果表明在此條件下儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次蜘蛛香藥材6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣并計(jì)算含量，結(jié)果baldrinal和11-ethoxyviburtinal的RSD分別為1.26%、0.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析并計(jì)算含量，結(jié)果baldrinal和11-ethoxyviburtinal的RSD分別為2.12%、0.20%，表明供試品溶液室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品6份，分別精密加入baldrinal和11-ethoxyviburtinal對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定2種成分的含量，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 樣品含量測(cè)定

取四川、云南、貴州3個(gè)產(chǎn)地的蜘蛛香藥材粉末，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定總環(huán)烯醚萜含量；另取3個(gè)產(chǎn)地的蜘蛛香藥材粉末，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算baldrinal和11-ethoxyviburtinal的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

近年來(lái)，蜘蛛香的相關(guān)報(bào)道很多，纈草素類成分不耐熱、易酸水解[5]，本試驗(yàn)采用加熱回流的方式，使纈草素類成分分解為其穩(wěn)定的降解產(chǎn)物。

本試驗(yàn)對(duì)5%香蘭素冰醋酸法、對(duì)二甲氨基苯甲醛法作了考察，其顯色不明顯且不穩(wěn)定，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～800 nm范圍內(nèi)掃描，2種顯色方法對(duì)照品以及樣品最大吸收均不一致，而在不顯色的情況下，對(duì)照品與樣品在288 nm處有最大吸收，且方法穩(wěn)定可靠。本試驗(yàn)還考察了以甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水和乙腈-磷酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相的色譜行為，甲醇-水系統(tǒng)對(duì)baldrinal和11-ethoxyviburtinal的分離效果較差，而乙腈-磷酸水系統(tǒng)的分離度較好，克服了拖尾現(xiàn)象，故選用乙腈-磷酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，并經(jīng)試驗(yàn)確定采用梯度洗脫法分離效果較好。

本試驗(yàn)對(duì)蜘蛛香中總環(huán)烯醚萜及baldrinal和11-ethoxyviburtinal的含量進(jìn)行測(cè)定，建立了既簡(jiǎn)便、易行，又能同時(shí)測(cè)定該類成分總含量及2個(gè)指標(biāo)性成分的質(zhì)量控制方法，為制定藥材及其制劑相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了可靠的參考。根據(jù)3個(gè)產(chǎn)地蜘蛛香藥材含測(cè)定的數(shù)據(jù)，蜘蛛香中總環(huán)烯醚萜及2種活性成分含量存在一定差異，可能與產(chǎn)地及儲(chǔ)存時(shí)間有關(guān)系，這對(duì)蜘蛛香藥材產(chǎn)地的選擇有一定意義。

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（收稿日期：2015-07-16）

（修回日期：2015-09-14；編輯：陳靜）