miRNA—146的靶基因及其參與的信號通路與骨關(guān)節(jié)炎

郭佩　葉志中　尹志華　何偉珍

【摘 要】 骨關(guān)節(jié)炎對個人健康和社會經(jīng)濟造成重大影響，目前仍缺乏相對有效的預(yù)防和治療措施。了解骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的分子機制，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)機制，有助于找到潛在的治療靶點。文章結(jié)合近幾年的國內(nèi)外研究，就miRNA-146的結(jié)構(gòu)特性、靶基因、參與的信號通路及其與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系進行了探討。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；miRNA-146；靶基因；信號通路

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.01.018

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞、消失和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為主要病變特征的慢性進行性疾病，隨著年齡增加，患病率顯著升高。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)及其周圍緩慢進展的腫脹、疼痛，伴功能障礙。由于軟骨組織病變的不可逆性，目前臨床上還未出現(xiàn)一種有效的治療方法。分子機制研究表明，某些miRNAs會影響軟骨細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變、細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)[1]。miRNA有重要的調(diào)控作用，進一步了解其靶基因、信號傳導(dǎo)通路可能促進新藥物的研究進展，調(diào)控miRNA相關(guān)蛋白的表達(dá)可能成為治療OA的新靶點。在OA患者中，可以檢測出多種miRNA的水平發(fā)生改

變[2]；其中miRNA-146直接介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，研究了解miRNA-146在OA中的調(diào)控及作用機制，可能對控制關(guān)節(jié)炎性破壞和刺激修復(fù)具有重要作用[3]。

1 miRNA

21世紀(jì)后，有關(guān)miRNA的研究高速發(fā)展，并取得了一定的成就。研究證實，miRNA不僅在生物體生長發(fā)育如胚胎形成、器官發(fā)育、腫瘤生成等過程中發(fā)揮重要作用，還參與多種人類疾病的進程，如心律失常、心肌肥大、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤等。

1.1 miRNA基本結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征 miRNA廣泛存在于天然基因組中，是內(nèi)源性非蛋白編碼的單鏈小分子，長度在20～24 nt之間，隸屬小RNA家族。其由內(nèi)含子和編碼基因間隔區(qū)的基因共同編碼，5'端為一磷酸基團，3'端為羥基。至2011年，從動植物、微生物、病毒中已經(jīng)預(yù)測出15 000余個miRNA序列，其中與人類相關(guān)的miRNA序列有1900個[4]。盡管在數(shù)量上僅占1%，但能夠調(diào)控人體30%表達(dá)蛋白質(zhì)的基因[5-6]；此外，一個miRNA相應(yīng)的靶基因通常不止一個[7]。

在細(xì)胞核中，miRNA的編碼基因在RNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ的共同作用下轉(zhuǎn)錄形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的原始miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA的發(fā)夾能被Drosha-DGCR8微處理復(fù)合體識別并裂解為前體miRNA （pre-miRNA）；然后，pre-miRNA被Exportin-5轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)Dicer酶處理成為長約21個核苷酸的成熟miRNA，即miRNA二聚

體[8-9]。此二聚體在RNA解旋酶的作用下選擇5'端更不穩(wěn)定的一條鏈作為主要的miRNA保留下來，另一條鏈在多數(shù)情況下被降解[10]。

成熟的miRNA在雙鏈RNA結(jié)合蛋白TRBP和PACT的協(xié)助下被AGO2結(jié)合并形成miRNA，接到靶基因mRNA的降解或者翻譯抑制，因此通常miRNA是負(fù)向調(diào)控基因。當(dāng)miRNA與靶基因mRNA3'端非翻譯區(qū)序列（UTR）的結(jié)合位點完全匹配時，靶mRNA降解，這種情況多見于植物；對于哺乳動物而言，大多數(shù)miRNA與靶基因的結(jié)合為不完全配對，主要引起mRNA翻譯抑制，從而實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[11]。

研究表明，miRNA在人類的唾液、血液、尿液、關(guān)節(jié)液等體液中穩(wěn)定存在，提示其有可能成為疾病診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[12]。miRNA序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式的多樣性，使其有可能以miRNA編碼蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子的身份，調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控乃至影響整個個體發(fā)育。總而言之，miRNA可能在基因表達(dá)調(diào)節(jié)控制領(lǐng)域中起著非常重要的作用，可能會給基因治療、新藥研發(fā)、針對性治療提供一個新的平臺。

1.2 miRNA與OA miRNA可以在正常人及OA患者的關(guān)節(jié)液中穩(wěn)定表達(dá)[12-13]，提示miRNA在OA領(lǐng)域的研究可行性。Iliopoulos等[2]調(diào)查365例

關(guān)節(jié)軟骨受損者的miRNA后發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，有16種miRNA存在差異表達(dá)；Jones等[13]檢測157人的miRNA后發(fā)現(xiàn)，某些miRNA在OA患者中存在差異表達(dá)。我們可以通過檢測關(guān)節(jié)液中miRNA的表達(dá)水平變化來進一步了解OA的臨床進展，有可能識別與關(guān)節(jié)軟骨病變相關(guān)的關(guān)鍵miRNA，從而找到OA治療的新靶點。

2 miRNA-146

現(xiàn)階段，miRNA家族中關(guān)于miRNA-146研究最為廣泛。miRNA-146是一個典型的多功能基因，參與眾多生理、病理進程，如炎癥、造血和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。數(shù)據(jù)顯示，miRNA-146在肺、腎、皮膚、甲狀腺、胸腺的免疫及炎癥反應(yīng)中表達(dá)的水平都很高，這種廣泛的表達(dá)說明miRNA-146在病理、生理過程中極可能起著重要作用。

2.1 miRNA-146基本結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征 miRNA-146家族由miRNA-146a和miRNA-146b兩個

成員構(gòu)成，其中miRNA-146a定位于第5號（5q33）

染色體loc285 628基因的第2個外顯子區(qū)，miRNA-

146b定位于第10號（10q24）染色體上；這兩個miRNA只有3'末端的2個核苷酸不同，其余序列一模一樣[15]。然而，它們在生物活性方面有很大差異：脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺

激后，通常僅表達(dá)成熟的miRNA-146a，而無miRNA-146b產(chǎn)生。此外，不同物種之間miRNA-

146的結(jié)構(gòu)高度一致。

2.2 miRNA-146與免疫反應(yīng) miRNA-146是首個被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用的miRNA，尤其是在固有免疫系統(tǒng)中。Taganov等[16]檢測200多個人類單核細(xì)胞中的表達(dá)miRNAs后得出，miRNA-146可被LPS、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）等促炎癥因子所誘導(dǎo)，是一種內(nèi)毒素響應(yīng)性基因。

目前研究顯示，miRNA-146一方面可以通過作用于TLR4/MYD88/NF-κB通路和RIG-I通路中的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor6，TRAF6）、IL-1受體相關(guān)激酶-1（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）和IL-1受體相關(guān)激酶-2（IL-1 receptor associated kinase 2，IRAK2）負(fù)向調(diào)控固有免疫反應(yīng)的強度[17]；另一方面可以通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性而降低IL-2的表達(dá)，抑制T細(xì)胞增殖，并通過抑制Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD）的合成阻止T細(xì)胞發(fā)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（activation-induced cell death，AICD）過程[18]；同時miRNA-146還可以作用于IFN信號通路IRF5和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及轉(zhuǎn)錄激活物（STATI），抑制IFN的產(chǎn)生[19]。

2.3 miRNA-146與IRAKI/TRAF6、TNF-α/IL-β通路信號通路 Jones等[13]研究顯示，在OA早期階段，miRNA-146a與NF-κB途徑中多個基因密切關(guān)聯(lián)，但在中、晚期OA患者軟骨細(xì)胞中miRNA-146a的表達(dá)受抑制。miRNA-146a的表達(dá)減少可能是促進OA發(fā)展的影響因素。Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是新近發(fā)現(xiàn)的存在于哺乳動物細(xì)胞表面，在天然免疫中發(fā)揮重要作用的一種細(xì)胞跨膜蛋白受體，亦是病原模式識別受體之一，可以有效識別各種入侵的病原體并通過與配體結(jié)合的方式啟動天然免疫反應(yīng)。研究表明，當(dāng)受到LPS、TNF-α和IL-β等刺激時，單核細(xì)胞中的miRNA-146表達(dá)會顯著增加。miRNA-146啟動子區(qū)有NF-κB結(jié)合位點，LPS、TNF-α和IL-β等刺激使miRNA-146表達(dá)增加是NF-κB依賴的?，F(xiàn)有資料證明，TNF-α和IL-β通路中2個重要的銜接分子IRAKI和TRAF6，是miRNA-146的重要靶基因[1，20]。miRNA-146通過NF-κB與miRNA的3'-UTR結(jié)合，可以抑制編碼IRAK1基因和TRAF6基因的表達(dá)，也就是說當(dāng)miRNA-146表達(dá)升高時，IRAKI和TRAF6表達(dá)均下調(diào)。因此，Taganov等[16]認(rèn)為，miRNA-146通過負(fù)向反饋的方式調(diào)控TLR信號通路的表達(dá)，從而應(yīng)對外來病原體的感染入侵。

2.4 miRNA-146與Smad4、TGF-β/Smad信號通

路 Zhang等[21-22]通過分析Smad4潛在靶點的miRNA

發(fā)現(xiàn)，miRNA-146b、miRNA-199a和miRNA-633有調(diào)節(jié)Smad4表達(dá)和TGF-β/SMad信號通路的潛力。Jing[3]首次證實Smad4是miRNA-146a的直接靶基因，推測在OA發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA-146a表達(dá)水平的升高引起其靶基因Smad4的表達(dá)下調(diào)，進而通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)增加，抑制TGF-β/Smad信號通路以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，軟骨細(xì)胞中合成與分解之間的代謝平衡關(guān)系被打破。因此miRNA-146a可以作為OA的治療靶點，對miRNA-146a的水平進行適當(dāng)?shù)母深A(yù)將有助于控制OA的發(fā)生和發(fā)展。

2.5 miRNA-146與OA OA的基本病理特征是軟骨的破壞消失和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。分解代謝和合成代謝的失衡是導(dǎo)致OA的重要原因，但是目前其分子機制尚未完全清楚[23]。與正常的軟骨組織相比，在OA病變組織的軟骨細(xì)胞中，分解型因

子[24]如IL-1、TNF-α表達(dá)水平顯著升高，并伴隨著轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta，

TGF-β）水平的下降。許多細(xì)胞因子參與這一過程。在OA中，TGF-β超家族成員起合成代謝或者保護作用。而促炎癥因子如IL-1β和TNF-α起分解代謝作用，加重了軟骨破壞。miRNA-146a在OA患者的軟骨組織合成分解代謝平衡中扮演著重要角色，但機制尚未完全清楚。Nakasa等[15]對OA患者軟骨細(xì)胞miRNA-146a基因表達(dá)譜的研究表明，OA輕度患者的軟骨細(xì)胞中miRNA-146a呈高表達(dá)，且miRNA-146a的表達(dá)受IL-1的影響，該研究表明，miRNA-146a是OA涉及軟骨病變的基因作用靶點。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146與OA導(dǎo)致的慢性疼痛有關(guān)，在大鼠OA模型中可以通過調(diào)控miRNA-146的表達(dá)有效減輕疼痛。另有資料顯示，miRNA-146a參與軟骨細(xì)胞的凋亡進程[26]。靶基因Smad4的表達(dá)能夠抑制軟骨細(xì)胞肥大化及細(xì)胞進一步凋亡，然而miRNA-146a可以負(fù)向調(diào)控軟骨細(xì)胞的Smad4的基因表達(dá)從而促進軟骨細(xì)胞凋亡。

3 展 望

總之，miRNA可能在基因表達(dá)領(lǐng)域中起著重要的調(diào)控作用，隨著科技不斷發(fā)展，miRNA和靶基因檢測技術(shù)愈加成熟，可能為基因治療、藥物研究、針對性治療提供一個新的平臺。miRNA-146可以通過多條信號通路調(diào)控基因表達(dá)，而在同一條信號通路中可以有多個靶點同時存在。miRNA-146在OA中的差異性表達(dá)有可能揭示新的重要調(diào)控途徑，并為OA的發(fā)病機制和治療干預(yù)提供一個新的思路。

4 參考文獻

[1] Miyaki S，Asahara H.Macro view of microRNA function in osteoarthritis[J].Nat Rev Rheumatol，2012，8（9）：543-552.

[2] Iliopoulos D，Malizos KN，Oikonomou P，et al.Integrative MicroRNA and Proteomic Approaches Identify Novel Osteoarthritis Genes and Their Collaborative Metabolic and Inflammatory Networks[J].Plos One，2008，3（11）：e3740.

[3] Jing Li.The role of micro-146a in osteoarthritis and the underlying mechanism[D].Shanghai：Institute of Health Sciences for Chinese Academy of Science，2012.

[4] Kozomara A，Griffiths-Jones S.miRBase：integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J].Nucleic Acids Res，2010，39（1）：D152-157.

[5] Olena AF，Patton JG.Genomic organization of microRNAs[J].J Cell Physiol，2010，222（3）：540-545.

[6] Jayaswal V，Lutherborrow M，Ma DD，et al.Identification of microRNA-mRNA modules using microarray

data[J].BMC Genomics，2011，12（3）：344-348.

[7] Rajewsky N，Socci ND.Computational identification of microRNA targets[J].Dev Bio1，2004（2）：529-535.

[8] Djuranovic S，Nahvi A，Green R.A Parsimonious Model for Gene Regulation by miRNAs[J].Science，2011，

331（6017）：550-553.

[9] Barter MJ，Bui C，Young DA.Epigenetic mechanisms in cartilage and osteoarthritis：DNA methvlation，histone modifications and microRNAs[J].Osteoarthritis

Cartilage，2012，20（5）：339-349.

[10] Kertesz M，Iovino N，Unnerstall U，et al.The role of site

（下轉(zhuǎn)第74頁）

（上接第66頁）

accessihility in microRNA target recognition[J].Nat Genet，2007，39（10）：1278-1284.

[11] Wienholds E，Plasterk RHA.MicroRNA function in animal development[J].Febs Letters，2005，579（26）：5911-5922.

[12] Chakraborty S，Baine MJ，Sasson AR，et al.Current status of molecular markers for early detection of sporadic pancreatic cancer[J].Biochim Biophys Acta，2011，1815（1）：44-64.

[13] Jones SW，Watkins G，Le Good N，et al.The identification of differentially expressed microRNA in osteoarthritic tissue that modulate the production of TNF-alpha and MMP13[J].Osteoarthritis Cartilage，2009，17（4）：464-472.

[14] Lu LF，Boldin MP，Chaudhry A，et al.Function of miRNA-146a in controlling Treg cell-mediated regulation of Th1 response[J].Cell，2010，142（6）：914-929.

[15] Nakasa T，Miyaki S，Okubo A，et al.Expression of microRNA-146 in rheumatoid arthritis Synovial tissue[J].Arthritis Rheum，2008，58（5）：1284-1292.

[16] Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF-κappaB dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J].Proc Nati Acad Sci U S A，2006，103（33）：12481-12486.

[17] Hou J，Wang P，Lin L，et al.MicroRNA-146a feedback inhibits RIG-I-dependent type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6，IRAK1，and IRAK2[J].J Immunol，2009，183（3）：2150-2158.

[18] Curtale G，Citarella F，Carissimi C，et al.An emerging player in the adaptive immune response：micro-

RNA-146a is a modulator of IL-2 expression and

activation-induced cell death in T lymphocyte[J].Blood，2010，115（2）：265-273.

[19] Tang Y，Luo X，Cui H，et al.MicroRNA-146a Contributes to Abnormal Activation of the Type I Interferon Pathway in Human Lupus by Targeting the Key Signaling Proteins[J].Arthritis Rheum，2009，60（4）：1065-1075.

[20] Pauley KM，Chan EK.MicroRNAs and their emerging roles in immunology[J].Ann NY Acad Sci，2008，1143（1）：226-239.

[21] Zhang Y，F(xiàn)an K J，Sun Q，et al.Functional screening for miRNAs targeting Smad4 identified miR-199a as a negative regulator of TGF-β signalling pathway[J].Nucleic Acids Research，2012，40（18）：9286-9297.

[22] Liu Z，Lu CL，Cui LP，et al.MicroRNA-146a modulates TGF-β1-induced phenotypic differentiation in human dermal fibroblasts by targeting SMAD4[J].Arch Dermatol Res，2012，304（3）：195-202.

[23] Kapoor M，Martel-Pelletier J，Lajeunesse D，et al.Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis[J].Nat Rev Rheumatol，2011，7（1）：33-42.

[24] Aigner T，Soeder S，Haag J.IL-1 beta and BMPs-interactive players of cartilage matrix degradation and degeneration[J].Eur Cell Mater，2006，12（7）：49-56.

[25] Li X，Kroin JS，Kc R，et al.Altered spinal microRNA-146a

and the microRNA-183 cluster contribute to osteoarthritic pain in knee joints[J].J Bone Miner Res，2013，28（12）：2512-2522.

[26] Li J，Huang J，Dai L，et al.miRNA-146a，an IL-1β responsive miRNA，induces vascular endothelial growth factor and chondrocyte apoptosis by targeting Smad4[J].Arthritis Res Ther，2012，14（2）：R75.

收稿日期：2015-09-18；修回日期：2015-10-26