龍牙百合快速繁殖與脫毒分析

袁從兵

摘 要 龍牙百合以球莖的無性繁殖為主，此繁殖方式雖可保證龍牙百合的順利繁衍，卻使品種出現(xiàn)了明顯的退化，抗病性也隨之降低。目前，龍牙百合的脫毒主要以莖尖脫毒為主，研究其快速繁殖及脫毒技術(shù)意義重大。

關(guān)鍵詞 快速繁殖；莖尖脫毒；龍牙百合；組培快繁；球莖

中圖分類號(hào)：S567.239；S644.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1673-890X（2016）01-00-02

在百合的諸多分支中，龍牙百合是最為名貴的一支，這種百合既在食用方面具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，又在藥用方面有著無可比擬的療效，經(jīng)人工所制成的龍牙百合干片暢銷于港臺(tái)及東南亞。其種植位置以湖南省隆回縣（2009年國家工商總局認(rèn)定為地理標(biāo)志證明）為中心，遍及周邊多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，當(dāng)?shù)胤N植面積穩(wěn)定在6.67 hm2左右，產(chǎn)量高達(dá)1萬余t，即使排除每667 m2數(shù)十萬元的生產(chǎn)成本，其生產(chǎn)總值依然高達(dá)2.2億元左右[1]。當(dāng)?shù)胤N植模式以多年連栽、根莖無性繁殖為主，盡管農(nóng)民種植的積極性很高，但品種的退化卻無可避免，危及根莖的病害逐年增加，種植成本不斷提高，產(chǎn)量也因此而明顯下降。目前，龍牙百合在繁殖與脫毒上面臨著許多難題，亟待解決。

1 快速繁殖

1.1 外植體處理

龍牙百合可以無性繁殖，故其鱗片、莖葉、根尖、花瓣、子房、花絲、頂芽、胚及花梗均能夠作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。據(jù)相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，龍牙百合以鱗片切塊進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，分化率最好。也就是說，龍牙百合若要快速繁殖，鱗片是最佳外植體，大部分繁殖者都選擇鱗片實(shí)施初代培養(yǎng)。

而外植體在進(jìn)行組織培養(yǎng)之前，需要進(jìn)行滅菌處理，常規(guī)滅菌用品主要有升汞、酒精及漂白粉。其操作流程為：先對(duì)外植體進(jìn)行流線形沖洗，沖洗時(shí)間少則15 min，多則1 d；然后以70%～75%的酒精進(jìn)行預(yù)殺菌，殺菌時(shí)間從15 s到30 s不等；之后以0.1%的升汞進(jìn)行10 min左右的滅菌操作；最后用無菌水為龍牙百合鱗片進(jìn)行5次沖洗，徹底清除掉殘余的滅菌藥劑。注：以上滅菌操作主要針對(duì)鱗片這一外植體[2]。若選擇頂芽或葉片作為外植體，則要使用10%的漂白粉進(jìn)行消毒，時(shí)間不得超過10 min。

1.2 組織培養(yǎng)

1.2.1 植株再生

龍牙百合的組織培養(yǎng)可以經(jīng)3條途徑實(shí)現(xiàn)植株的再生。其一為器官型，即外植體在誘導(dǎo)下產(chǎn)生不定芽或發(fā)育出腋芽，最終形成了叢生芽；其二為胚狀體型，即經(jīng)外植體作直接誘導(dǎo)、由胚狀體直接產(chǎn)生，或是外植體的愈傷組織在誘導(dǎo)下形成了胚狀體，并且胚狀體完全經(jīng)歷了球形、心形、魚雷形多個(gè)階段，發(fā)展為成熟胚，在形態(tài)學(xué)上與合子胚即為相似；其三為器官發(fā)生型，這種類型與器官型有所不同的是，先經(jīng)外植體誘導(dǎo)，形成一種愈傷組織，再分化為不定芽。

1.2.2 培養(yǎng)基選擇

除了植株再生，培養(yǎng)基類型的選擇也是非常重要的。一般來說，龍牙百合所用培養(yǎng)基均是固體培養(yǎng)基。就目前的研究結(jié)果來看，MS是使用最為廣泛的培養(yǎng)基類型。有關(guān)研究人員對(duì)MS、White3及B5這3種培養(yǎng)基進(jìn)行了分化效果試驗(yàn)，通過對(duì)比可知，MS培養(yǎng)基的分化效果最好，B5培養(yǎng)基次之，White3培養(yǎng)基再次之。

1.2.3 生長調(diào)節(jié)劑的使用

在龍牙百合的培養(yǎng)中，生長調(diào)節(jié)劑也是必不可少的使用要素。以6-BA為例，使用這種生長調(diào)節(jié)劑的不定芽在分化上有明顯的促進(jìn)表現(xiàn)，若將其添加到MS培養(yǎng)基中，外植體上的不定芽將會(huì)直接分化出來。并且，隨著這種生長調(diào)節(jié)劑濃度的不斷上升，分化率也會(huì)不斷增加。需要注意的是，6-BA的濃度上限為2 mg/L，若是超過這一限度，分化率反而會(huì)不斷下降[3]。故組織培養(yǎng)時(shí)6-BA的使用濃度最好在0.5～2.0 mg/L。

除6-BA，NAA也是組織培養(yǎng)中常用的一種生長調(diào)節(jié)劑，這種生長調(diào)節(jié)劑既可以促進(jìn)愈傷組織的形成與分化，也可以誘導(dǎo)生根，更在不定芽的分化上有非常顯著的抑制效果。需要注意的是，NAA的顯著效果要與6-BA聯(lián)用才能顯現(xiàn)出來，單用NAA，不定芽分化率在30%以下，若與6-BA聯(lián)用則愈傷組織在誘導(dǎo)率上將會(huì)攀升到70%以上。此外，NAA在聯(lián)合使用時(shí)，若劑量添加過大將會(huì)導(dǎo)致不定芽顏色變淺，這意味著NAA在與6-BA聯(lián)合使用時(shí)不可添加過多，最好控制在0.1～0.5 mg/L。若單用，則NAA的最佳使用劑量為2 mg/L，這一劑量可以保證100%出根率，且根須潔白而粗壯，量大而效果優(yōu)良。

2 脫毒

就一個(gè)多世紀(jì)以來對(duì)百合壞死條紋的研究而言，可以發(fā)現(xiàn)百合的病毒病原共有14種，其中以潛隱病毒、郁金香碎花病毒、黃瓜花葉病毒、異名百合斑駁病毒以及百合叢簇病毒五種危害最為嚴(yán)重。這5種病毒病原同樣可以危及龍牙百合的繁殖與生長。在我國，初代百合的病毒病發(fā)生率約為50%，二代種球則有高達(dá)90%的帶毒率，這使得百合在產(chǎn)量和治療大打折扣。就龍牙百合的受危害特點(diǎn)而言，有以下幾個(gè)：一是多種病毒對(duì)植株進(jìn)行復(fù)合式侵染，表現(xiàn)復(fù)雜、危害嚴(yán)重；二是病毒傳播速度快，在植株內(nèi)分布極不均勻，初次侵染部位與二次侵染部位有不同的患病表現(xiàn)。一般來說，龍牙百合在受到侵害之后，植株明顯矮化，花葉與葉脈出現(xiàn)畸形，鱗片與根莖也顯著縮小，產(chǎn)量與品質(zhì)都有明顯降低，開花數(shù)目變少，部分植株甚至盲花或枯死。對(duì)于上述情況，可以應(yīng)用如下幾種方法進(jìn)行脫毒處理。

2.1 莖尖培養(yǎng)

通過試驗(yàn)對(duì)比病毒在不同器官、組織中的含量可以發(fā)現(xiàn)，老舊器官內(nèi)的病毒含量比較高，而在未成熟的組織器官及幼嫩的莖尖中，病毒含量則比較低。這是因?yàn)榍o尖通常是整個(gè)植株上細(xì)胞分裂活性最高的部位，組織培養(yǎng)價(jià)值高；且該處不存在纖維管束，細(xì)胞間沒有連絲，病毒無法傳遞過來。利用這一特點(diǎn)，可以通過剝?nèi)∏o尖組織進(jìn)行培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)脫毒目的。對(duì)于龍牙百合來說，可以選擇葉原基有1個(gè)或2個(gè)、長度為0.2 mm或0.3 mm的莖尖進(jìn)行無毒培養(yǎng)。

2.2 愈傷組織培養(yǎng)

龍牙百合的最佳外植體為鱗片與莖尖，通過這些外植體對(duì)愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)并分化出無毒苗或鱗莖，同樣可以實(shí)現(xiàn)脫毒目的。這種脫毒方法的有效率為30%～47%。雖然效果不夠理想，卻有很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)室可行性，且其分化率控制起來比較容易，脫毒周期也比較短。最為重要的是，該法在一次性成苗上具有批量性優(yōu)勢(shì)，故該法可以用于首次脫毒，之后再聯(lián)合其他方法進(jìn)行二次脫毒。

2.3 熱處理加莖尖培養(yǎng)

借助高溫令病毒發(fā)生鈍化，使其復(fù)制行為不斷變慢，直到最終停止下來，即是熱處理脫毒技術(shù)。而植株的嫩梢在高溫培養(yǎng)期間并沒有攜帶病毒，故可以將之作為培養(yǎng)對(duì)象進(jìn)行脫毒培養(yǎng)處理。熱處理這種脫毒技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)也非常明顯。不僅脫毒不夠完全、脫毒周期過長，熱處理時(shí)溫度也難以準(zhǔn)確控制。無論是溫度過高（超過37 ℃）還是高溫時(shí)間過長（超過20 d），都會(huì)使植株的存活率大大降低。并且，各種病毒病原各有其溫度敏感性，龍牙百合所感染的病毒可能有多種，熱處理法難以兼顧各方，故效果始終有限。只有在聯(lián)合莖尖培養(yǎng)法之后，其脫毒效果才有顯著提高。

2.4 化學(xué)藥劑加熱處理加與莖尖培養(yǎng)的脫毒方法

此方法主要借助化學(xué)試劑來阻斷病毒的繼續(xù)合成，所用化學(xué)試劑主要有孔雀綠、病毒唑、8-氮鳥嘌呤及硫尿嘧啶等。這些藥物無法使病毒失去活性，僅僅能起到阻斷病毒合成的效果，并對(duì)植株有一定的危害，故應(yīng)在使用上嚴(yán)格控制其劑量。一般來說，單用化學(xué)試劑的脫毒率可以達(dá)到50%～60%，弱與熱處理法及莖尖培養(yǎng)法聯(lián)合應(yīng)用，可以有效提高脫毒率。該方法先以熱處理法使病毒不斷鈍化，同時(shí)輔以化學(xué)試劑阻斷病毒合成，最后借助莖尖培養(yǎng)獲得無毒苗，故在脫毒率上高達(dá)80%。可以說，此法是本文所介紹的脫毒方法中效果最好的一種。相關(guān)研究顯示，培養(yǎng)基中若含有10 mg/L的DHT溶液，則培養(yǎng)基中的不定芽將有非常優(yōu)秀的脫毒效果，病毒檢出率低至0%。

2.5 低溫療法

此方法將植株組織以超低溫度保存，并將莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，是一種誕生時(shí)日尚短的新興脫毒方法，其脫毒率可以與化學(xué)藥劑加熱處理加與莖尖培養(yǎng)方法相媲美，但因誕生不久而應(yīng)有有限。就現(xiàn)有研究結(jié)果來看，將百合的莖尖進(jìn)行1 h的超低溫處理之后再行增殖培養(yǎng)，新苗的脫毒率可以超過90%。若選擇液態(tài)氮對(duì)龍牙百合進(jìn)行超低溫脫毒，應(yīng)將溫度控制在4 ℃左右。若將剝?nèi)￠L度為0.5 mm的莖尖培養(yǎng)20 d，并以液態(tài)氮冷藏24 h，再以40 ℃水解凍，龍牙百合的脫毒率將能達(dá)到88.70%，出芽率也能達(dá)到62.7%左右。

3 結(jié)語

龍牙百合在藥用與食用上均有極為顯著的價(jià)值，這使得經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)對(duì)這種事物產(chǎn)生了較大的需求。而與之矛盾的是，龍牙百合在繁殖上卻出現(xiàn)了許多問題，無性繁殖導(dǎo)致品種退化、品種退化導(dǎo)致病蟲害繁多，這無疑是不利于龍牙百合的健康發(fā)展的。對(duì)此，相關(guān)工作者從龍牙百合的快速繁殖與脫毒2個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)，試圖推動(dòng)品種的進(jìn)化，提高其抗病毒能力，以此來增加產(chǎn)量，帶來更多的經(jīng)濟(jì)利益。本文對(duì)龍牙百合的快速繁殖技術(shù)與脫毒技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的闡述，以供從事此方面工作或此方面研究的人員參考。

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（責(zé)任編輯：趙中正）