青天葵組織培養(yǎng)球莖誘導(dǎo)的研究

覃劍峰，林 楊，楊美純，韋璐陽(yáng)，金 剛，施麗雅，蒙 瑤，羅 清

(1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004 ；3.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023)

青天葵組織培養(yǎng)球莖誘導(dǎo)的研究

覃劍峰1,2，林 楊3，楊美純2，韋璐陽(yáng)1，金 剛1，施麗雅1，蒙 瑤1，羅 清1

(1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004 ；3.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023)

【目的】研究蔗糖、大量元素和激素等濃度因素對(duì)青天葵(Nerviliaefordii)組培球莖誘導(dǎo)形成的影響?！痉椒ā恳郧嗵炜蚯o誘導(dǎo)形成的走莖，并切取生長(zhǎng)端長(zhǎng)度約為3 cm帶節(jié)的莖段為試驗(yàn)材料。分別在以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含不同蔗糖、KNO3、NH4NO3、KH2PO4、6-BA、NAA和PP333濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)形成球莖的數(shù)量、直徑和鮮重等指標(biāo)?！窘Y(jié)果】蔗糖濃度為40～50 g/L時(shí)球莖誘導(dǎo)效果較好；MS培養(yǎng)基中的大量元素，當(dāng)KNO3、NH4NO3、KH2PO4濃度分別為2800～2600、1650～1980和230～272 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果較好。在MS培養(yǎng)基中附加終濃度為0.5～2.5 mg/L NAA和0.4～0.6 mg/L PP333時(shí)，提高了青天葵組培球莖的形成速度且形成的球莖大小均勻；附加6-BA則不利于球莖誘導(dǎo)?！窘Y(jié)論】篩選出的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可有效提高青天葵球莖誘導(dǎo)效率。

青天葵；組織培養(yǎng)；球莖

【研究意義】青天葵(NerviliaeFordii)又名毛唇芋蘭、獨(dú)腳天葵、珍珠草、假天麻，為蘭科芋蘭屬植物[1-3]，多年生宿根小草本。青天葵是長(zhǎng)期以來(lái)較為緊缺和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的中草藥[4,5]。野生青天葵一般以球莖作為繁殖方式，自然繁殖系數(shù)極低，且由于人們的濫采濫挖，導(dǎo)致青天葵資源匱乏。人工引種野生青天葵已獲得成功，但因種球莖的稀缺，一直無(wú)法推廣種植[6]。通過(guò)組織培養(yǎng)的途徑不僅能夠保存青天葵的種質(zhì)資源，同時(shí)也為人工種植提供種源。在組織培養(yǎng)條件中將其走莖直接誘導(dǎo)形成完整植株較困難，而將球莖直接種植則較易形成完整植株，且球莖不必進(jìn)行煉苗即可直接用于大田生產(chǎn)，播種簡(jiǎn)易，從而節(jié)省了時(shí)間，降低了成本。因此，提高青天葵球莖誘導(dǎo)效率對(duì)青天葵規(guī)模化生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今有關(guān)青天葵在組培球莖誘導(dǎo)的研究及相關(guān)報(bào)道不多。研究報(bào)道表明，野生青天葵球莖的大小對(duì)發(fā)芽有較大的影響，小球莖通常發(fā)芽率不高，只有25 %。施肥營(yíng)養(yǎng)方面的研究表明，施用生物有機(jī)肥的地上部分，產(chǎn)量等各項(xiàng)測(cè)定數(shù)據(jù)均高于復(fù)合肥和農(nóng)家肥，而施用復(fù)合肥的植株地下部分母塊莖、子塊莖優(yōu)于生物有機(jī)肥和農(nóng)家肥[7]。在采用青天葵球莖快速繁殖方法研究中，將青天葵球莖接種在H 培養(yǎng)基上繁殖，不僅球莖頂芽萌發(fā)伸長(zhǎng)，并可使根莖上的潛伏芽也同時(shí)萌發(fā)，改變了青天葵正常生長(zhǎng)的形態(tài)模式，由單芽型變?yōu)榫哂?～6 個(gè)芽的叢芽型。分別以葉片、葉柄、球莖、根進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示球莖的誘導(dǎo)效果比較好[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)組織培養(yǎng)的方式有利于青天葵種質(zhì)資源的保存，但目前有關(guān)提高青天葵球莖誘導(dǎo)效率報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)糖、大量元素和激素的濃度等幾個(gè)有可能影響青天葵組培球莖形成的因素進(jìn)行較系統(tǒng)的研究，以期掌握青天葵組培球莖的誘導(dǎo)方法，并篩選出有利于青天葵組培球莖形成的培養(yǎng)基和其它培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青天葵球莖誘導(dǎo)形成的走莖，切取生長(zhǎng)端長(zhǎng)度約為3 cm帶節(jié)的莖段。KNO3、KH2PO4、NH4NO3、蔗糖和萘乙酸(NAA)為中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，其有效成分≥98.0 %。PP333(多效唑)，15 %不濕性粉劑；6-芐基腺嘌呤(6-BA)為中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，有效成分≥98.0 %。凝固劑用合浦瓊脂廠生產(chǎn)的瓊脂粉(700 目/cm2)。基本培養(yǎng)基為MS。

1.2 試驗(yàn)方法

分別將直徑約0.3 cm、長(zhǎng)約3 cm、無(wú)側(cè)莖、去掉生長(zhǎng)端的組培走莖接種到MS培養(yǎng)基中。其中含不同蔗糖濃度(20、30、40、50、60、70和80 g/L)，不同KNO3濃度(0、380、760、1140、1520、1900、2280和2660 mg/L)，不同NH4NO3濃度(0、330、660、990、1320、1650、1980和2310 mg/L)，不同KH2PO4濃度(0、34、68、102、136、170和204 mg/L)，不同6-BA濃度 (0、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mg/L) ，不同NAA和PP333濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/L) ，以上處理接種段數(shù)均為60段，每瓶接兩個(gè)莖段，進(jìn)行球莖誘導(dǎo)。觀察球莖開(kāi)始形成的時(shí)間，60 d后統(tǒng)計(jì)形成球莖的數(shù)量、直徑、鮮重。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，隨著蔗糖濃度的增加，青天葵組培走莖形成球莖的速度明顯加快。在糖濃度較低的培養(yǎng)基內(nèi)，其側(cè)莖的生長(zhǎng)時(shí)間比在糖濃度較高的培養(yǎng)基內(nèi)的長(zhǎng)，呈球莖形成速度隨培養(yǎng)基內(nèi)糖濃度的增加而加快的趨勢(shì)。蔗糖濃度對(duì)青天葵組培球莖形成的數(shù)量也有著較大影響，當(dāng)糖濃度為20～50 g/L時(shí)，球莖數(shù)量、直徑和鮮重隨著糖濃度的增加而呈增加趨勢(shì)。當(dāng)糖濃度達(dá)到60 g/L時(shí)，球莖數(shù)量開(kāi)始減少，走莖開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。當(dāng)糖濃度達(dá)到70 g/L時(shí)所接入的莖段開(kāi)始時(shí)同樣能夠形成球莖，但之后走莖和球莖嚴(yán)重萎蔫，甚至死亡。

2.2 KNO3對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

從表2可見(jiàn)，青天葵走莖形成球莖速度隨著KNO3濃度的增加呈增加趨勢(shì)，當(dāng)KNO3的添加量為2660 mg/L時(shí)，接種后第9天時(shí)便可觀測(cè)到側(cè)莖尖端出現(xiàn)乳白色顆粒狀球莖，比對(duì)照組提前6 d。第一個(gè)球莖形成后，側(cè)莖及球莖均隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移而增粗和膨大，且繼續(xù)形成的球莖。接種60 d后，各處理所誘導(dǎo)出的球莖數(shù)量均隨著KNO3添加量增大而增加，但球莖的平均直徑和平均鮮重均隨KNO3增加量的加大而減小，其中，對(duì)照處理球莖最大。添加380和760 mg/L KNO3的處理球莖誘導(dǎo)效果較好，兩處理誘導(dǎo)球莖數(shù)量均顯著多于對(duì)照處理，且球莖平均直徑與對(duì)照處理差異不顯著，而其他處理所誘導(dǎo)的球莖數(shù)量雖多，但球莖質(zhì)量較差。

表1 糖濃度對(duì)球莖誘導(dǎo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(Plt;0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atPlt;0.05 level. The same as below.

表2 KNO3對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響(Ⅰ)

2.3 NH4NO3對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

增加NH4NO3沒(méi)有對(duì)球莖形成的速度產(chǎn)生明顯影響，各處理中開(kāi)始形成球莖的時(shí)間基本一致(表3)。接種60 d后，隨NH4NO3添加量的增加，誘導(dǎo)出的球莖數(shù)量呈下降趨勢(shì)，球莖成熟度呈提高趨勢(shì)，在添加量達(dá)1320 ～1980 mg/L時(shí)，球莖數(shù)量均顯著低于低添加量處理，且主莖開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，2310 mg/L時(shí)主莖與球莖均呈死亡狀態(tài)。

隨著培養(yǎng)基中NH4NO3的含量的增加，各處理中大部分球莖的平均直徑均呈先增加后減少的趨勢(shì)，原因可能為，原培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分不能滿足青天葵組培球莖生長(zhǎng)的需要，添加NH4NO3后，球莖誘導(dǎo)效果更好，但當(dāng)NH4NO3增加的量繼續(xù)加大時(shí)，不利于青天葵組培球莖糖分的均衡積累，使大球莖和小球莖的比例不斷增加，中等球莖比例逐漸減少。兼顧球莖誘導(dǎo)率和球莖品質(zhì)來(lái)看，NH4NO3的增加量為330 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果較好。

2.4 KH2PO4對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

增加KH2PO4可提高青天葵球莖的形成速度，但相比對(duì)照處理提高并不明顯(表5)，當(dāng)KH2PO4添加量到達(dá)136 mg/L后不再對(duì)球莖形成速度產(chǎn)生影響。接種后60 d，KH2PO4增加量為0～102 mg/L時(shí)，球莖數(shù)量隨KH2PO4添加量增大而緩慢增加；102～204 mg/L時(shí)，球莖數(shù)量隨KH2PO4添加量增大而緩慢減少。隨著KH2PO4添加量增加，各處理球莖平均直徑呈緩慢增加趨勢(shì)，當(dāng)KH2PO4的增加量達(dá)到136 mg/L時(shí)，球莖平均直徑增幅最大，大部分球莖直徑在1.00 cm以上，最大為1.25 cm。綜合球莖誘導(dǎo)率、大小和品質(zhì)等方面來(lái)看，當(dāng)KH2PO4的增加量在68～102 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)效果最好。

表3 NH4NO3對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響(Ⅰ)

表4 NH4NO3對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響(Ⅱ)

表5 KH2PO4對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

2.5 不同PP333濃度對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

從表5可見(jiàn)，PP333能夠明顯加快青天葵組培球莖的形成，PP333濃度達(dá)到0.8～1.2 mg/L時(shí)，一周內(nèi)即有約0.1 cm大小的乳白色顆粒狀球莖形成，且肉眼基本上觀察不到側(cè)莖的生長(zhǎng)。當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg/L時(shí)，所形成的球莖開(kāi)始扭曲，隨PP333濃度增加，在較早形成的球莖上會(huì)長(zhǎng)出新的小球莖，且數(shù)量不斷增加。當(dāng)PP333濃度達(dá)0.8 mg/L及以上時(shí)，最初接入的主莖莖段開(kāi)始出現(xiàn)老化，甚至死亡現(xiàn)象，部分球莖也開(kāi)始老化。球莖節(jié)間隨著PP333濃度的增加而明顯縮短，導(dǎo)致畸形球莖的產(chǎn)生。綜合考慮， PP333濃度為0.4～0.6 mg/L時(shí)較好。

表6 PP333對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

表7 6-BA 對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

2.6 6-BA濃度對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

從表6可見(jiàn)，6-BA對(duì)青天葵球莖的形成有著明顯的延緩作用。附加6-BA培養(yǎng)基中球莖形成所需的時(shí)間明顯大于對(duì)照處理。隨著6-BA的濃度增加，球莖形成的速度減緩，同時(shí)速度減緩的幅度也隨之加大。所有添加 6-BA處理的球莖數(shù)量均顯著高于對(duì)照處理，球莖數(shù)量隨6-BA濃度增大而增多，但增長(zhǎng)幅度呈減緩趨勢(shì)。6-BA的濃度為0.3～0.6 mg/L時(shí)，球莖數(shù)量呈增加趨勢(shì)，而球莖直徑則相反，原因可能為由于形成球莖數(shù)量過(guò)多，以及走莖生長(zhǎng)量過(guò)大，使得球莖生長(zhǎng)不能獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)。

2.7 NAA濃度對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

從表7可以看出，青天葵組培球莖的形成速度隨著培養(yǎng)基中NAA的濃度加大而加快，但NAA對(duì)形成的球莖數(shù)量影響不顯著，球莖直徑則隨著附加NAA濃度的增大而出現(xiàn)明顯增大的趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度達(dá)到2.5 mg/L，球莖平均直徑達(dá)到1.64 cm，其中最大球莖直徑達(dá)到2.18 cm。雖然球莖的鮮重也隨NAA的濃度加大而加大，但增大幅度相對(duì)較小。

3 討 論

青天葵組培球莖的形成本質(zhì)上是糖分的動(dòng)態(tài)積累過(guò)程，故培養(yǎng)基內(nèi)糖分的含量對(duì)球莖的誘導(dǎo)效果有較大影響。本研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)糖濃度為40～50 g/L時(shí)，基本能夠滿足球莖誘導(dǎo)的需求。培養(yǎng)基中部分大量元素的含量以及附加的植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)青天葵組培球莖的誘導(dǎo)效果具有一定影響。KNO3能夠相對(duì)均衡的促進(jìn)球莖糖分的積累，提高了球莖形成的數(shù)量。但是，因?yàn)槭茏咔o對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)吸收速率的限制，所以在提高了結(jié)球數(shù)量的同時(shí)，也限制了球莖個(gè)體的增大。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中KNO3濃度為2280～2660 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果是最好的。NH4NO3有助于促進(jìn)青天葵組培球莖個(gè)體的膨大，但同時(shí)也不利于球莖數(shù)量的增加，且不能加快球莖的形成的速度。過(guò)量的NH4NO3在促進(jìn)球莖增大的同時(shí)也降低了球莖的充實(shí)度。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中NH4NO3濃度為1650～1980 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果較好。KH2PO4有利于碳水化合物的代謝和運(yùn)輸，從而使球莖在形成過(guò)程中較有效地積累糖分，從而使球莖的體積和充實(shí)度增加，當(dāng)培養(yǎng)基中KH2PO4濃度為230～272 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果最好。

表8 NAA對(duì)青天葵組培球莖誘導(dǎo)的影響

MS培養(yǎng)基附加6-BA 的濃度為0.1～0.9 mg/L時(shí)，不利于青天葵組培球莖對(duì)糖分的積累，但增加了側(cè)莖形成的數(shù)量。分析其原因認(rèn)為，6-BA能促進(jìn)走莖的細(xì)胞分裂，從而減緩了球莖對(duì)糖分的積累，最終導(dǎo)致球莖的生長(zhǎng)變慢。在今后的試驗(yàn)中可以先利用6-BA誘導(dǎo)出球莖后，再去掉6-BA進(jìn)行球莖培養(yǎng)，從而既可以提高球莖的數(shù)量，也可以保證球莖個(gè)體的質(zhì)量。NAA對(duì)青天葵組培球莖的誘導(dǎo)是有一定促進(jìn)作用的。但是，考慮到球莖的充實(shí)度有可能影響青天葵球莖在種植的生長(zhǎng)狀況，所以在生產(chǎn)上應(yīng)該適當(dāng)控制添加NAA的濃度。

對(duì)青天葵進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，不僅為人工種植青天葵提供種子資源提高了農(nóng)民的收入，同時(shí)也減少了對(duì)野生青天葵的采挖量；運(yùn)用組織培養(yǎng)的方法，可以生產(chǎn)大量作為種源的球莖。

4 結(jié) 論

在青天葵組織培養(yǎng)球莖誘導(dǎo)的過(guò)程中，蔗糖濃度為40～50 g/L時(shí)、KNO3、NH4NO和KH2PO4濃度分別為2800～2600、1650～1980和230～272 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果較好；MS培養(yǎng)基中附加終濃度為0.5～2.5 mg/L NAA和0.4～0.6 mg/L PP333時(shí)，可提高青天葵組培球莖的形成速度且形成的球莖大小均勻；附加6-BA則不利于球莖誘導(dǎo)。本研究結(jié)果可為青天葵的規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 汪羽寧)

StudyonTissueCultureCormsInducingofNerviliafordii

QIN Jian-feng1,2, LIN Yang3, YANG Mei-chun2, WEI Lu-yang1, JIN Gang1, SHI Li-ya1, MENG Yao1, LUO Qing1

(1.Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Guangxi Nanning 530001, China; 2.College of Agriculture, Guangxi University, Guangxi Nanning 530004, China 3.Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Guangxi Nanning 530023, China)

【Objective】To explore the influence of concentration factors of sucrose, macroelements and hormones on the induction of tissue cultured corms，the tissue cultured amphitropous stem ofNerviliaefordiiwas selected as explants and studied.【Methods】The amphitropous stem induced byNerviliaefordiicorms were cut at about 3cm of growing end as experimental materials, and cultured in MS medium with different concentration of sucrose, KNO3, NH4NO3, KH2PO4, 6-BA, NAA and PP333 respectively. 【Result】Sucrose at the concentration of 40-50 g/L performed better induction effect. KNO3performed better induction effect at the concentration of 2800-2600 mg/L. NH4NO3had better induction effect at the concentration of 1650-1980 mg/L. KH2PO4performed better induction effect at the concentration of 230-270 mg/L. MS medium supplemented with 0.5-2.5 mg/L NAA and 0.4-0.6 mg/L PP333 accelerated the formation ofNerviliaefordiitissue cultured corms, with no influence on the quantity and uniformity of size. 6-BA was not conductive to the induction of tissue cultured corms. 【Conclusion】The selected medium and culture conditions can increase the induction efficiency ofNerviliaefordiicorms.

Nerviliaefordii; Tissue culture; Corm

S567.23

A

1001-4829(2017)11-2568-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.031

2017-06-03

廣西科技開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“珍稀瀕危藥用資源保護(hù)與可持續(xù)利用工作站”(桂科AD17129044)；廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(桂熱研201610)

覃劍峰(1979-)，壯族，男，廣西柳江人，碩士，助理研究員，主要從事植物組織培養(yǎng)及栽培研究工作，E-mail:qinjianfengmail@163.com。