象耳豆根結(jié)線蟲Me—mapk1基因的克隆及RNAi分析

魏麗莎子 龍海波 陳綿才 趙志祥

摘 要 促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是線蟲體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組分，在生長發(fā)育過程中具有重要作用。本研究從象耳豆根結(jié)線蟲中克隆了1個(gè)促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1 cDNA序列，該序列全長1 369 bp，包含1個(gè)1 185 bp的完整開放閱讀框，推導(dǎo)編碼394個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為45. 39 ku。同源性搜索比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白序列與南方根結(jié)線蟲MI-MAPK1具有99%的一致性。通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-MAPK，在IPTG的誘導(dǎo)下得到70 ku左右的特異融合蛋白（包括大小約26 ku的標(biāo)簽序列）。利用RNAi技術(shù)對象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲Me-mapk1基因進(jìn)行沉默，線蟲誘導(dǎo)番茄根結(jié)形成的數(shù)量顯著減少，推測Me-mapk1基因的下調(diào)表達(dá)有可能影響象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞 象耳豆根結(jié)線蟲；促分裂原活化蛋白激酶；基因克?。辉吮磉_(dá)；RNA干擾

中圖分類號(hào) R532.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Mitogen-activated protein kinases（MAPKs）are important components in signal transduction pathway involving in the process of nematode growth and development. In this study， a MAPK gene（Me-mapk1）from the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii was cloned. The Me-mapk1 cDNA sequence consisted of a 1 185 bp open reading frame（ORF）encoding 394 amino acid residues that were franked by a 27 bp 5′-untranslated region（UTR）and a 157 bp 3′-UTR. The protein molecular mass was 45.39 ku. Homology analysis showed that the identity was 99% between Me-mapk1 deduced protein ME-MAPK1 and MI-MAPK1 protein of M. incognita. The recombinant protein ME-MAPK1 with a molecular mass of 70 ku which included tag protein sequence of 26 ku was produced by prokaryotic expression. The number of nematode-induced galls on tomato was significantly reduced after knocking-down Me-mapk1 gene by RNA interference， indicating an important role of the gene to nematode development.

Key words Meloidogyne enterolobii； Mitogen activated protein kinase； Gene cloning； Prokaryotic expression； RNAi

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.022

象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）是中國熱帶、亞熱帶地區(qū)作物上廣泛發(fā)生的一種重要的植物病原線蟲，也是世界上公認(rèn)的危害最大的根結(jié)線蟲種類之一[1-2]。該線蟲最早在海南儋州象耳豆樹上被發(fā)現(xiàn)，隨后在歐洲、美洲和非洲等報(bào)道發(fā)生，造成的產(chǎn)量損失可達(dá)65%以上[3-5]。近年來，象耳豆根結(jié)線蟲在海南島迅速蔓延擴(kuò)散，目前已在海南全島發(fā)生危害，受害作物包括瓜果蔬菜、南藥、熱帶果樹等多種農(nóng)作物，并造成重大經(jīng)濟(jì)損失[6]。越來越多的調(diào)查結(jié)果表明，象耳豆根結(jié)線蟲正逐漸取代南方根結(jié)線蟲（M. incognita），成為海南熱帶水果和反季節(jié)蔬菜上的優(yōu)勢根結(jié)線蟲種類[6-7]。

促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）是一種真核生物體內(nèi)普遍存在且高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK與促分裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase， MAPKK）、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）組成MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，接受外界信號(hào)刺激并將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞生存與凋亡等多種生命活動(dòng)[8-9]。MAPK還被證實(shí)與多種植物病原物包括真菌、細(xì)菌及類病毒的致病性密切相關(guān)[10-12]。迄今，有國內(nèi)外研究人員已從真菌、哺乳動(dòng)物和植物中分離克隆了多種MAPK基因，如在擬南芥基因組中鑒定出20余種MAPK基因[13-14]。目前植物病原線蟲中關(guān)于MAPK的研究較少，僅在南方根結(jié)線蟲、甘藍(lán)根結(jié)線蟲和松材線蟲中克隆了少量地MAPK基因，其具體功能和作用機(jī)制均未開展深入研究。本研究從象耳豆根結(jié)線蟲中克隆并鑒定出一個(gè)新的促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1。同時(shí)，利用RANi技術(shù)對Me-mapk1進(jìn)行誘導(dǎo)沉默，分析MAPK在象耳豆根結(jié)線蟲生長發(fā)育過程中的功能地位，旨在為防治該線蟲提供新的理論依據(jù)和防治策略。

1 材料與方法

1.1 材料

象耳豆根結(jié)線蟲Meloidogyne enterolobii由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，在室內(nèi)用改進(jìn)的貝爾曼漏斗法分離得到。培養(yǎng)和接種象耳豆根結(jié)線蟲的番茄品種均為“特級(jí)大明星”。

1.2 方法

1.2.1 第一鏈cDNA的合成 采用Trizol法提取M. enterolobii總RNA，其RNA沉淀用30 μL無RNase 水溶解。取5 μL總RNA為模板，以oligo dT為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。

1.2.2 Me-mapk1 cDNA末端的序列擴(kuò)增 以M. enterolobii總RNA為模板，利用GeneRacerTM RACE 試劑盒（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成獲得帶3′接頭和5′接頭的cDNA第一鏈（RACE模板）。同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的象耳豆根結(jié)線蟲cDNA文庫序列信息，設(shè)計(jì)Me-mapk1基因末端擴(kuò)增特異引物，結(jié)合RACE接頭引物，采用巢式PCR分別擴(kuò)增基因的5′及3′末端序列。其中，5′末端序列擴(kuò)增第1輪所用引物為GeneRacer5′ primer和M-S1（表1），第2輪PCR以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，所用引物為GeneRacer5′ nested primer和M-S2（表1）；3′末端序列的擴(kuò)增第1輪PCR所用引物為GeneRacer3′primer和M-A1（表1），第2輪PCR所用引物為GeneRacer3′ nested primer和M-A2（表1）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、純化、連接、轉(zhuǎn)化并送諾賽基因測序。

1.2.3 Me-mapk1原核表達(dá) 以第1鏈cDNA為模板，用引物M1-Bam HI和M1-Not I擴(kuò)增Me-mapk1基因的開放閱讀框區(qū)域。PCR 產(chǎn)物經(jīng)TA克隆，挑取單克隆，搖菌并進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆送諾賽公司測序，并進(jìn)行序列分析。同時(shí)，提取陽性克隆和pET-32a質(zhì)粒，分別經(jīng)Bam HI和Not I雙酶切后，連接，構(gòu)建表達(dá)重組子pET-32a-MAPK。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，涂板培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子接種于含氨芐青霉素的培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至菌液OD值約為0.6時(shí)，加入100 mmol/L IPTG使終濃度為0.8 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h后離心收集菌體，向收集的菌體中加入50 μL蛋白上樣緩沖液，沸水加熱5 min，將樣品取出冷卻至室溫，離心后取8 μL上清于12%分離膠和5%濃縮膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。以pET-32a空載體誘導(dǎo)表達(dá)物作為對照。

1.2.4 Me-mapk1 dsRNA合成 設(shè)計(jì)在5′端引用T7啟動(dòng)子序列的dsRNA特異引物M-I1和M-I2（表1），以第一鏈cDNA為模板PCR擴(kuò)增獲得Me-mapk1特異靶標(biāo)序列。將獲得的PCR產(chǎn)物純化后，隨后以該片段為模板結(jié)合反轉(zhuǎn)錄酶合成Me-mapk1特異的dsRNA序列。反應(yīng)體系：DNA模板1 μg，10× T7 Reaction Buffer 2 μL，ATP Solution 2 μL，CTP Solution 2 μL，GTP Solution 2 μL，UTP Solution 2 μL， T7 Enzyme Mix 2 μL，補(bǔ)充Nuclease-free Water至總體積20 μL。具體反應(yīng)步驟參照MEGAascript RNAi kit（Life Technologies）說明書進(jìn)行。獲得的dsRNA產(chǎn)物用微量核酸蛋白檢測儀（NanoUV-3000）檢測濃度和質(zhì)量。

1.2.5 Me-mapk1 RNAi效應(yīng)分析 RNAi采用活體外dsRNA浸泡二齡幼蟲法進(jìn)行，略有修改[15]。浸泡體系為：2 mg/mL dsRNA，0.5%間苯二酚，0.05%明膠，3 mmol/L亞精胺，浸泡溶液用1xPBS緩沖液調(diào)節(jié)。對照處理分2組，一組為不含dsRNA 的1xPBS緩沖液（含0.05%明膠，0.5%間苯二酚，3 mmol/L亞精胺），一組為清水處理。每處理所用新鮮二齡幼蟲數(shù)量約20 000條，浸泡時(shí)間為24 h，溫度為22 ℃，浸泡過程中保持輕微振動(dòng)。浸泡結(jié)束后用滅菌水反復(fù)沖洗蟲體，在清水中恢復(fù)2 h后，每處理取約10 000條二齡幼蟲提取總RNA。分別取等量濃度RNA（200 ng/μL）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR分析沉默效果，所用引物為M-R1和M-R2（表1）。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，2× pfu PCR MasterMix（TIANGEN）10 μL，上下游引物各1 μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積20 μL。同時(shí)選擇內(nèi)參基因β-actin為擴(kuò)增對照，引物為Actin-F1和Actin-R1（表1），反應(yīng)體系不變。將dsRNA浸泡處理（含對照）的二齡幼蟲接種至生長30 d番茄苗（cv. 特級(jí)大明星）根部，每個(gè)處理接種300條線蟲，重復(fù)8次。接種30 d后收集番茄根系，統(tǒng)計(jì)根結(jié)數(shù)。病情級(jí)別和病情指數(shù)依據(jù)《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥田間藥效實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則（二）》中所列方法和公式計(jì)算，具體如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 Me-mapk1 cDNA克隆與序列分析

用RACE技術(shù)分別克隆獲得了象耳豆根結(jié)線蟲Me-mapk1 cDNA的5′末端和3′末端序列，其長度分別為960、505 bp，拼接后全長序列為1 369 bp。Me-mapk1 cDNA全長序列包含長度為27 bp的5′非編碼區(qū)、157 bp的3′非編碼區(qū)（包括24個(gè)堿基polyA尾巴）和1個(gè)1 185 bp的完整開放閱讀框，推導(dǎo)編碼1個(gè)含394 aa的蛋白序列。Me-mapk1 cDNA在NCBI GenBank上提交注冊登錄號(hào)為KT380882。

象耳豆根結(jié)線蟲促分裂原活化蛋白激酶ME-MAPK1蛋白序列由394個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測分子量大小為45.39 ku，等電點(diǎn)pI=6.39。BlastP同源性搜索及多序列比對顯示ME-MAPK1與南方根結(jié)線蟲M. incognita（ABI96897）促分裂原活化蛋白激酶MI-MPK1有99%的一致性，與甘藍(lán)根結(jié)線蟲M. artiellia（CAD56894）、松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus（ACT46908）及馬來絲線蟲Brugia malayi（XP_001900759）等其它線蟲促分裂原活化蛋白激酶具有86%～93%的一致性（圖1）。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，ME-MAPK1第43～331位氨基酸包含11個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶亞結(jié)構(gòu)域，并且在第VII和第VIII亞結(jié)構(gòu)域間具有胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶保守的TEY基序序列（圖1）。

2.2 ME-MAPK1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a-MAPK轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，在IPTG的誘導(dǎo)下ME-MAPK1融合蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大小約為70 ku的特異條帶，與預(yù)測大小相符（包括大小約26 ku的標(biāo)簽序列）；而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組子及空載體對照無ME-MAPK1融合蛋白條帶（圖2）。

2.3 dsRNA對Me-mapk1基因的沉默效果

通過引入T7啟動(dòng)子序列的Me-mapk1基因特異引物M-I1/M-I2擴(kuò)增獲得Me-mapk1靶標(biāo)片段，隨后在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成了長度為332 bp的dsRNA（圖3）。分別提取Me-mapk1 dsRNA、不含dsRNA的緩沖液和清水浸泡處理24 h的二齡幼蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增Me-mapk1和對照基因β-actin。電泳檢測結(jié)果顯示，經(jīng)Me-mapk1 dsRNA浸泡處理后的二齡幼蟲Me-mapk1轉(zhuǎn)錄豐度明顯低于無dsRNA 和清水浸泡處理后的Me-mapk1轉(zhuǎn)錄水平（圖4-A），而非靶標(biāo)基因β-actin經(jīng)以上3個(gè)處理后其轉(zhuǎn)錄豐度未發(fā)生相對變化（圖4-B）。

2.4 Me-mapk1 RNAi效應(yīng)表型分析

由表2可知，象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲經(jīng)Me-mapk1 dsRNA浸泡處理后導(dǎo)致番茄根結(jié)形成數(shù)相比對照明顯減少，30 d 后其平均根結(jié)形成數(shù)為21.5±8.9（平均±SD）。不含dsRNA的PBS緩沖液和清水對照處理形成平均根結(jié)數(shù)分別為61.8±13.5（平均±SD）和63.1±10.6（平均±SD），對照之間差異不顯著（表2）。同時(shí)，二齡幼蟲經(jīng)Me-mapk1 dsRNA浸泡處理接種后的番茄病情指數(shù)為16.7，而不含dsRNA的PBS緩沖液和清水對照處理的番茄病情指數(shù)分別為44.4和47.2（表2）。

3 討論與結(jié)論

本研究從象耳豆根結(jié)線蟲中成功克隆了1個(gè)促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1，其編碼蛋白ME-MAPK與其它線蟲的MAPK具有80%以上的一致性，屬于典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員。結(jié)果表明，各生物體MAPK高度相似，都包含有11個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸亞結(jié)構(gòu)域，并且在第VII和第VIII亞結(jié)構(gòu)域之間的T-loop環(huán)上有1個(gè)由蘇氨酸（T）、酪氨酸（Y）和X氨基酸組成的TXY基序，是決定MAPK活性的關(guān)鍵位點(diǎn)[16-17]。在植物TXY中的X常為E（谷氨酸）或D（天冬氨酸），而動(dòng)物和酵母中是E、P（脯氨酸）或G（甘氨酸）。多序列分析比對結(jié)果顯示象耳豆根結(jié)線蟲ME-MAPK與其它線蟲MAPK的TXY基序均為TEY（圖1），表明線蟲MAPK對底物特異性的選擇上可能具有相似性，而本研究通過原核表達(dá)獲得的ME-MAPK1融合蛋白也為進(jìn)一步研究MAPK的生化特性奠定了基礎(chǔ)。

Kamath等[18]利用RNA干擾技術(shù)對模式秀麗小桿線蟲mapk基因誘導(dǎo)沉默后，秀麗小桿線蟲出現(xiàn)不育和胚致死等表型，表明MAPK在線蟲的生長發(fā)育過程中具有重要作用。而陳國華等[19]用體外合成的南方根結(jié)線蟲mapk-1 dsRNA浸泡卵塊，會(huì)導(dǎo)致孵化的J2成活率顯著降低，同樣表明MAPK對于植物寄生線蟲的重要性。本研究中，通過體外合成與象耳豆根結(jié)線蟲Me-mapk1同源的dsRNA片段并刺激J2吞咽取食，成功誘導(dǎo)了Me-mapk1基因的下調(diào)表達(dá)，表現(xiàn)為Me-mapk1 mRNA的轉(zhuǎn)錄豐度降低（圖4）。而經(jīng)Me-mapk1 dsRNA處理的J2接種后誘導(dǎo)番茄根結(jié)形成的數(shù)量顯著減少，病情指數(shù)下降。由此推測，Me-mapk1基因的下調(diào)表達(dá)對象耳豆根結(jié)線蟲在根內(nèi)的寄生發(fā)育造成了影響。該研究結(jié)果表明Me-mapk1可作為抑制象耳豆根結(jié)線蟲危害的一個(gè)候選靶標(biāo)基因，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。需要注意的是，利用活體外RNA干擾技術(shù)對于基因的沉默具有時(shí)效性，不能完全抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)，在后期靶標(biāo)基因的表達(dá)水平有可能會(huì)恢復(fù)到正常水平，從而一定程度上影響表型的分析。因此，需進(jìn)一步構(gòu)建能在體內(nèi)穩(wěn)定持久表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植株實(shí)現(xiàn)對根結(jié)線蟲靶標(biāo)基因的持續(xù)沉默，深入研究MAPK的作用機(jī)制和功能地位，為最終提出新的防治象耳豆根結(jié)線蟲病害策略奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 符美英， 芮 凱， 肖彤斌，等. 海南島象耳豆根結(jié)線蟲的種類鑒定及其rDNA-ITS序列分析[J]. 生物安全學(xué)報(bào)， 2012， 21（1）： 79-84.

[2] Castagnone-Sereno P. Meloidogyne enterolobii（M. mayaguensis）： profile of an emerging，highly pathogenic， root-knot nematode species[J]. Nematology， 2012， 14（1）： 133-138.

[3] Yang B， Eisenback J. Meloidogyne enterolobii n. sp. （Meloidogynidae）， a root-knot nematode parasitizing pacara earpod tree in China[J]. Journal of Nematology， 1983， 15（2）： 381-391.

[4] Kiewnick S， Dessimoz M， Franck L. Effects of the Mi-1 and the N root-knot nematode-resistance gene on infection and reproduction of Meloidogyne enterolobii on tomato and pepper cultivars[J]. Journal of Nematology， 2009， 41（1）： 134-139.

[5] Onkendi E M， Moleleki L N. Distribution and genetic diversity of root-knot nematodes（Meloidogyne spp.）in potatoes from South Africa[J]. Plant Pathology， 2013， 62（6）： 1 184-1 192.

[6] 龍海波， 孫燕芳， 白 成，等. 海南省象耳豆根結(jié)線蟲的鑒定研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（2）： 371-376.

[7] 賈本凱， 王會(huì)芳， 陳綿才. 海南島茄果類蔬菜根結(jié)線蟲種類鑒定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 7（1）： 104-106.

[8] Widmann C， Gibson S， Jarpe M B， et al. Mitogen-activated protein kinase：conservation of a three-kinase module from yeast to human[J]. Physiology Review， 1999， 79（1）： 143-180.

[9] Rohila J S， YangY N. Rice mitogen-activated protein kinase gene family and its role in biotic and abiotic stress response[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2007， 49（4）： 751- 759.

[10] 范永山， 劉穎超， 谷守芹， 等. 植物病原真菌的MAPK基因及其功能[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2004， 44（3）： 547-551.

[11] Hamel L P， Nicole M C， Duplessis S， et al. Mitogen-activated protein kinase signaling in plant-interacting fungi：distinct messages from conserved messengers[J]. Plant Cell，2012， 24（7）： 1 327-1 351.

[12] 彭靜靜. 植物病原真菌中MAPK級(jí)聯(lián)通路研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（1）： 11-15.

[13] Ichimura K， Mizoguchi T， Irie K， et al. Isolation of ATMEKK1（a MAP kinase kinase kinase）： interacting proteins and analysis of a MAP kinase cascade in Arabidopsis[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1998， 253（3）： 532-543.

[14] Ren D T， Liu Y D， Yang K Y， et al. A fungal-responsive MAPK cascade regulates phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 105（12）： 5 638-5 643.

[15] Chen Q， Rehman S， Smant G， et al. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2005， 18（3）： 621-625.

[16] Bardwell A J， Abdollahi M， Bardwell L. Docking sites on mitogen-activated protein kinase（MAPK） kinases， MAPK Phosphatases and the Elk-1 transcription factor compete for MAPK binding and are crucial for enzymic activity[J]. Biochemical Journal， 2003， 370（5）： 1 077-1 085.

[17] Colcombet J， Hirt H. Arabidopsis MAPKs： A complex signaling network involved in multiple biological processes[J]. Biochemical Journal， 2008， 413（1）： 217-226.

[18] Kamath R S， Fraser A G， Ahringer J， et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi[J]. Nature， 2003， 421（1）： 231-237.

[19] 陳國華， 肖 羅， 張雙慶，等. 南根結(jié)線蟲促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因的RNAi效應(yīng)分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2008， 38（3）： 509-531.