TLC—HPLC檢測(cè)三黃連合劑的有效成分

楊劍 牛曉藝 黃明 梁萬(wàn)文 胡庭俊

摘要：【目的】以薄層色譜法—高效液相色譜法（TLC-HPLC）檢測(cè)三黃連合劑的有效成分，為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及后期臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肨LC對(duì)三黃連合劑中的主要組分黃連、黃芩和連翹進(jìn)行定性鑒別，并以HPLC對(duì)其主要有效成分黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷進(jìn)行含量測(cè)定?！窘Y(jié)果】三黃連合劑TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照斑點(diǎn)對(duì)齊，顏色一致。HPLC測(cè)定三黃連合劑中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿分別在75.00～1200.00 μg/mL（r=0.9997）、4.17～66.67 μg/mL（r=0.9998）、9.38～150.00 μg/mL（r=0.9999）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為113.92%、100.18%和100.40%，其含量分別為5.03、0.25和0.27 mg/mL。【結(jié)論】TLC-HPLC可作為三黃連合劑的質(zhì)量控制方法，且操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性良好。

關(guān)鍵詞： 三黃連合劑；有效成分；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法（TLC）；高效液相色譜法（HPLC）

中圖分類號(hào)： S853.73 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）02-0312-07

0 引言

【研究意義】中藥復(fù)方制劑的安全、有效、質(zhì)量可控是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與制定的主要目的之一，但中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，主要成分鑒別與含量測(cè)定是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵，也可為后期的藥理藥效學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。因此，開(kāi)展中藥復(fù)方制劑主要成分的鑒別與含量測(cè)定，實(shí)現(xiàn)其質(zhì)量可控的目的，對(duì)進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制及安全性和有效性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，中藥復(fù)方制劑成分的鑒別、測(cè)定與分析多采用薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）等。蒲曉輝等（2007）采用TLC-HPLC分別建立了肝寧顆粒中川芎的鑒別與阿魏酸（FA）含量測(cè)定的方法。隨后，葛建華等（2009）采用HPLC建立了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定茵陳蒿湯中綠原酸和梔子苷含量的方法；謝薇等（2010）針對(duì)肝康顆粒中黃芪等成分進(jìn)行TLC鑒別，同時(shí)對(duì)大黃素等進(jìn)行HPLC含量測(cè)定；王靜等（2011）同時(shí)對(duì)芪參益氣滴丸中迷迭香酸等5個(gè)丹參活性成分含量進(jìn)行分析，建立了準(zhǔn)確、重復(fù)性好的HPLC和超高效液相色譜法（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）；劉必旺等（2011）成功建立了HPLC和TLC測(cè)定復(fù)方葛根膠囊中葛根素含量的方法；陳鵬等（2014）分別采用HPLC和TLC對(duì)藏藥十味消食散中桂皮醛、胡椒堿進(jìn)行定性鑒別及含量測(cè)定，成功建立了藏藥十味消食散的質(zhì)量控制方法；Fu等（2015）采用TLC和HPLC分別鑒定了山楂顆粒中大黃酚等3種生物活性物質(zhì)；于燕莉等（2015）建立HPLC測(cè)定復(fù)方葛根片中延胡索乙素含量的方法。國(guó)外也有不少學(xué)者對(duì)中藥及其復(fù)方制劑的主要成分進(jìn)行鑒定、檢測(cè)與分析，Gnoatto等（2005）首次采用HPLC-UV對(duì)巴拉圭茶水提物中總皂苷進(jìn)行檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)該方法可用于其他中藥三萜式皂苷的檢測(cè)；Pandith等（2013）成功采用HPLC對(duì)香澤蘭葉子提取物中的有效活性成分——黃芩素甲基醚進(jìn)行鑒定、測(cè)定及分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】三黃連合劑是廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室自主研制的中獸藥復(fù)方制劑，其組成藥物為黃芩、黃連、連翹等，具有抗菌消炎的作用，主要用于羅非魚(yú)鏈球菌病治療，但目前尚無(wú)相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以針對(duì)三黃連合劑建立的TLC定性鑒別方法對(duì)處方中的主要組分（黃連、黃芩和連翹）進(jìn)行定性鑒別，并建立HPLC測(cè)定該復(fù)方中主要有效成分（黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿）的含量，以期為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及后期臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

三黃連合劑由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院委托廣西某獸藥公司生產(chǎn)（批號(hào)20130629、20130702和20130705）；連翹苷對(duì)照品（批號(hào)110821-201112）、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110713-201212）和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110715-201117）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。黃連對(duì)照藥材、連翹對(duì)照藥材、黃芩對(duì)照藥材由廣西獸藥監(jiān)察所提供；乙腈（TEDIA）、磷酸（Fisher）為色譜純，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：Waters 2695分離單元、Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司），Empower色譜工作站，硅膠H板（100 mm×100 mm，青島海洋化工廠分廠）和硅膠G板（100 mm×100 mm，青島海洋化工廠分廠）。

1. 2 主要組分的TLC鑒別

1. 2. 1 供試品溶液制備 分別取3個(gè)批次的三黃連合劑10.0 mL，蒸發(fā)濃縮至1.0 mL，后加入9.0 mL甲醇，通過(guò)無(wú)水中性氧化鋁過(guò)濾除雜后，作供試品溶液備用。

1. 2. 2 黃芩定性鑒別 取黃芩對(duì)照藥材1.0 g，加醋酸乙酯—甲醇（3∶1）混合溶液30.0 mL，加熱回流30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.0 mL溶解，上清液即為黃芩對(duì)照藥材溶液。取黃芩苷對(duì)照品0.500 mg，加入甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即為黃芩苷對(duì)照品溶液。然后參照《中國(guó)獸藥典（二部）》中的TLC，分別吸取供試品溶液3.0 μL、黃芩對(duì)照藥材溶液4.0 μL和黃芩苷對(duì)照品溶液4.0 μL，點(diǎn)于同一硅膠H板上，以乙酸乙酯—丁酮—甲酸—水（5∶3∶1∶1）為展開(kāi)劑展開(kāi)，約40 min后取出晾干，噴2%三氯化鐵乙醇顯色。

1. 2. 3 連翹定性鑒別 取連翹對(duì)照藥材，加石油醚20.0 mL，密塞，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.0 mL溶解，即為連翹對(duì)照藥材溶液。取連翹苷對(duì)照品0.500 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即為連翹苷對(duì)照品溶液。然后參照《中國(guó)獸藥典（二部）》中的TLC，分別吸取供試品溶液3.0 μL、連翹對(duì)照藥材溶液5.0 μL和連翹苷對(duì)照品溶液3.0 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷—甲醇（8∶1）為展開(kāi)劑展開(kāi)，約40 min后取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1. 2. 4 黃連定性鑒別 取黃連對(duì)照藥材，加甲醇25.0 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，即為黃連對(duì)照藥材溶液。取黃連小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品0.500 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即為鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。然后參照《中國(guó)獸藥典（二部）》中的TLC，分別吸取供試品溶液2.0 μL、黃連對(duì)照藥材溶液及鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液各3.0 μL，點(diǎn)于同一硅膠H板上，以苯—乙酸乙酯—甲醇—異丙醇—濃氨試劑（6.0∶3.0∶1.5∶1.5∶0.5）為展開(kāi)劑，置于以濃氨試劑預(yù)飽和20 min的展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi)，約30 min后取出晾干，置于紫外燈（365 nm）下檢視。

1. 3 主要有效成分的HPLC測(cè)定

1. 3. 1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取22.5 mg鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，適量甲醇溶解并定容至50.0 mL，即為450.0 μg/mL鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密稱取10.0 mg連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品，適量甲醇溶解并定容至50.0 mL，即為200.0 μg/mL連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密稱取36.0 mg黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，適量甲醇溶解并定容至10.0 mL，即為3.6 mg/mL黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將以上3種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液等量混合，即獲得含黃芩苷1.2 mg/mL、連翹苷66.7 μg/mL和鹽酸小檗堿150.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1. 3. 2 樣品溶液制備 任取三黃連合劑5.0 mL，甲醇定容至50.0 mL，即制成樣品溶液。按照三黃連合劑的制備方法分別配制缺少黃芩、黃連、連翹的陰性對(duì)照藥品。取陰性對(duì)照藥品5.0 mL，甲醇定容至50.0 mL，即為陰性對(duì)照樣品溶液。

1. 3. 3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；洗脫方式：等度洗脫；流動(dòng)相：0.4%磷酸（A）∶乙腈（B）=75∶25；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；柱溫：30 ℃；檢測(cè)時(shí)間：25 min。

2 結(jié)果與分析

2. 1 三黃連合劑中3種主要組分的定性鑒別結(jié)果

2. 1. 1 黃芩定性鑒別結(jié)果 如圖1所示，三黃連合劑供試品TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰，供試品斑點(diǎn)與黃芩標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊，顏色一致，顯示相同的斑點(diǎn)。

2. 1. 2 連翹定性鑒別結(jié)果 如圖2所示，三黃連合劑供試品TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰，供試品斑點(diǎn)與連翹標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊，顏色一致，顯示相同的斑點(diǎn)。

2. 1. 3 黃連定性鑒別結(jié)果 如圖3所示，三黃連合劑供試品TLC色譜中的圖像斑點(diǎn)清晰，供試品斑點(diǎn)與黃連標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊，顏色一致，顯示相同的黃色斑點(diǎn)。

2. 2 三黃連合劑中黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷的含量測(cè)定結(jié)果

2. 2. 1 線性關(guān)系考察 分別取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液及不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10.0 μL，按照1.3.3的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，記錄不同濃度下各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別求得黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，結(jié)果如表1所示。

3 討論

近年來(lái)，在中獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中TLC和HPLC因其快速、開(kāi)放性、靈活性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，如對(duì)黃連藥材、飲片及中成藥（康純等，2000）、疏糖瘀膠囊（楊小月和申欣，2007）、黃連供試品溶液（劉占厚等，2012）中的黃連進(jìn)行TLC鑒定，也有對(duì)連翹原料藥進(jìn)行TLC鑒定（張貞麗等，2007；鐘永康，2007）。一些中藥復(fù)方制劑如一清顆粒（陳巧華和林期重，2004）、更年寧心膠囊（周頌東，2009）、止咳化痰丸（孫景等，2014）中黃芩的TLC鑒別也相繼被報(bào)道。同時(shí)，有學(xué)者建立了檢測(cè)不同中藥復(fù)方制劑中黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿含量的HPLC測(cè)定方法，其中有單獨(dú)檢測(cè)蒲地藍(lán)消炎片中黃芩苷（邵禮梅等，2012）、清熱化毒丸中黃芩苷（劉匯等，2013）及勝紅清熱片中連翹苷（曾嶸等，2006）、柴連口服液中連翹苷（李銳和陳國(guó)彪，2010）；也有同時(shí)測(cè)定安宮牛黃丸中黃芩苷、鹽酸小檗堿和梔子苷（韓鳳梅等，2007），十味龍膽花顆粒中鹽酸小檗堿和龍膽苦苷（徐遠(yuǎn)金等，2007），雙黃消炎片中黃芩苷和鹽酸小檗堿（許國(guó)兵和劉志武，2008），大衛(wèi)顆粒中黃芩苷和連翹苷（姚帥等，2012），二妙丸中鹽酸小檗堿和黃柏堿（張莉和潘超，2011）的研究報(bào)道。上述研究結(jié)果均表明，以TLC和HPLC檢測(cè)中獸藥及其合劑有效成分具有準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于中獸藥質(zhì)量控制。

三黃連合劑藥味多、成分復(fù)雜，其主要有效成分的紫外吸收差異很明顯，通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，得知黃芩苷在214.4、277.0和315.1 nm處有最大吸收值，連翹苷在228.5和277.0 nm處有最大吸收值，鹽酸小檗堿在228.5、264.0和346.1 nm處有最大吸收值。由于樣品中連翹苷含量相對(duì)較少，因此在HPLC定量分析時(shí)選取277.0 nm波長(zhǎng)。此外，本研究通過(guò)參考前人（張成志，2008；石瑤等，2009；劉阿靜等，2012）的相關(guān)研究結(jié)果，分別采用乙腈—水、乙腈—磷酸溶液體系等作為流動(dòng)相，以不同體積比進(jìn)樣測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.4%磷酸（25∶75）作為流動(dòng)相的峰型更優(yōu)，分離效果良好（R>1.5%），洗脫時(shí)間最短。

安全、有效、質(zhì)量可控是對(duì)藥品生產(chǎn)的基本要求，而質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究是藥品質(zhì)量可控的必需過(guò)程。本研究采用TLC-HPLC聯(lián)用的方法對(duì)三黃連合劑進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果表明，經(jīng)TLC鑒別獲得的藥材薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)齊，顏色一致，說(shuō)明3個(gè)批次三黃連合劑中均含有黃芩、黃連和連翹，即這3味中藥的TLC色譜鑒別可作為制定該中藥合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)；采用HPLC對(duì)三黃連合劑的主要有效成分黃芩苷、鹽酸小檗堿和連翹苷進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為中藥合劑的質(zhì)量控制方法?？梢?jiàn)，TLC-HPLC可作為對(duì)三黃連合劑鑒別及質(zhì)量控制的檢測(cè)方法。

4 結(jié)論

采用建立的TLC-HPLC可對(duì)三黃連合劑的主要組分黃芩、黃連和連翹進(jìn)行定性鑒別及對(duì)黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定，能較全面地反映出復(fù)方合劑的質(zhì)量，操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性良好，可作為三黃連合劑的質(zhì)量控制方法。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）