白芨內(nèi)生細菌組成及多樣性分析

陳澤斌 李冰 王定康 徐勝光 劉佳妮 余磊 張永福 任禛 靳松

摘要：【目的】調(diào)查白芨內(nèi)生細菌種類及多樣性，為更好地保護和開發(fā)利用白芨資源提供科學依據(jù)?！痉椒ā繎肐llumina MiSeq高通量測序技術(shù)測定白芨內(nèi)生細菌的16S rDNA-V4變異區(qū)序列，應用Qiime和Mothur等軟件整理和統(tǒng)計樣品序列數(shù)目和操作分類單元（OTUs）數(shù)量，分析物種豐度及分布的差異?！窘Y(jié)果】獲得用于分析的有效序列和OTU數(shù)為49550/48；稀釋曲線表明測序深度充分，OTU的數(shù)量接近于飽和。白芨內(nèi)生細菌主要分布于鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，32.26%）、地桿菌屬（Pedobacter，16.13%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，16.13%）、土壤桿菌屬（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter屬（6.45%）、希瓦氏菌屬（Shewanella， 6.45%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，6.45%）和短波單胞菌屬（Brevundimonas，3.23%）8個屬?！窘Y(jié)論】鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬是白芨內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群。Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)能準確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和真實比例，在植物內(nèi)生微生物研究中具有明顯的優(yōu)勢和可行性。

關(guān)鍵詞： 高通量測序；白芨；內(nèi)生細菌；多樣性

中圖分類號： Q939.5 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0227-07

0 引言

【研究意義】白芨（Bletilla striata）又名連及草、甘根、白給、箬蘭、朱蘭、紫蘭、紫蕙、百笠，為多年生草本球根植物（塊根），株高18～60 cm，主要分布于我國、日本及緬甸北部（趙杰和毛曉健，2008）。白芨具有廣泛的藥用價值和園林價值，藥用主要用于收斂止血、消腫生?。ê椭緥傻?，2008）。白芨的種子自然萌發(fā)率極低，繁殖困難，野生資源稀少，由于需求量大，野生資源已瀕臨枯竭，現(xiàn)已列入《瀕危動植物種國際貿(mào)易公約》予以保護（林福林等，2013）。內(nèi)生菌是指其生活史中的某一段時期生活在健康植物組織內(nèi)部，不引起植物組織明顯侵染及癥狀改變的一類菌（Schulz et al.，2006）。關(guān)于植物內(nèi)生細菌，現(xiàn)已從多種健康植物的根、莖、葉、果實和種子中分離出包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共計達219種（隸屬于71個屬）植物內(nèi)生細菌（Schulz et al.，2006）。目前比較系統(tǒng)研究的植物有棉花、小麥、水稻和花生（胡桂萍等，2010），發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢種類主要分布于假單胞屬（Pseudommonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和土壤桿菌屬（Agrobacterium）4個屬，且尚未發(fā)現(xiàn)不存在內(nèi)生細菌的植物種類或器官（徐亞軍，2011）。已有研究表明，內(nèi)生細菌在植物種子萌發(fā)（候曉強和郭順星，2014）、抵御病原菌侵染（何勁等，2014）、促進幼苗生長中起著重要作用（徐文婷等，2014），同時內(nèi)生細菌也是生物活性物質(zhì)篩選的重要來源（童文君等，2014）。研究植物內(nèi)生細菌多樣性，對揭示植物內(nèi)生細菌的相互作用機制，有效利用內(nèi)生細菌資源具有重要意義。白芨是溫帶地生蘭科植物中最具經(jīng)濟價值的類群之一，因此有必要對白芨內(nèi)生細菌的種類組成進行研究?！厩叭搜芯窟M展】近年來，植物內(nèi)生菌作為生物活性物質(zhì)篩選的重要來源已引起人們的廣泛關(guān)注（郭良棟，2001；任愛梅等，2010；Sun and Guo，2012）。在藥用植物內(nèi)生真菌研究方面，自Stierle等（1993）從短葉紅豆杉的樹皮中分離得到一株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，藥用植物內(nèi)生真菌成為研究熱點（楊顯志等，2003；樊有賦等，2008；杜少康等，2009），研究發(fā)現(xiàn)藥用植物內(nèi)生真菌多以雙核菌門子囊菌亞門中的核菌綱、盤菌綱和腔菌綱及其無性態(tài)型組成，也包括一些擔子菌和接合菌（Petrini et al.，1991；Sinclair and Cerkauskas，1996）。在藥用植物內(nèi)生細菌研究方面，發(fā)現(xiàn)藥用植物內(nèi)生細菌優(yōu)勢類群多為芽孢桿菌屬細菌。魏娟等（2015）對云南重樓的內(nèi)生細菌分別進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬是其優(yōu)勢內(nèi)生細菌群；童文君等（2014）對美花石斛內(nèi)生細菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、微桿菌屬和腸桿菌屬為優(yōu)勢屬；楊夢莉等（2014）對巖白菜中內(nèi)生細菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和假單孢屬為其優(yōu)勢屬；李淑彬等（2015）對高良姜內(nèi)生細菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、甲基桿菌分別為其最、次優(yōu)勢種群；杜曉寧等（2015）對寧夏枸杞中內(nèi)生細菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬為枸杞優(yōu)勢內(nèi)生菌群。但是現(xiàn)有研究表明，分離培養(yǎng)方法分析的細菌僅限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長的細菌，這些可培養(yǎng)細菌僅占環(huán)境生物總數(shù)的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），因此有必要采用非培養(yǎng)方法對植物內(nèi)生細菌種類組成進行研究?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于白芨的研究主要集中在人工繁殖、化學成分分析和藥理作用等方面（劉瑩等，2008；袁寧等，2009；孫達鋒等，2009），有關(guān)白芨內(nèi)生細菌多樣性的研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用近年來新興起的個人型高通量DNA測序系統(tǒng)（Illumina MiSeq）對白芨內(nèi)生細菌種類組成進行研究，以檢測采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度植物內(nèi)生細菌種類，探究白芨內(nèi)生細菌種類多樣性，為更好地保護和開發(fā)利用白芨資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2014年8月于云南盛南白芨種植基地采集20株無明顯病害的白芨，取白芨假鱗莖塊根部分為分析樣品，均勻混合后放入無菌樣品袋中，低溫保鮮，于24 h內(nèi)進行表面消毒處理，樣品名為BJ。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 表面消毒 將新鮮白芨假鱗莖塊根部分用自來水沖洗干凈，再用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分。表面消毒效果檢驗參照陳澤斌等（2014）的方法。

1. 2. 2 總DNA提取 按陳澤斌等（2012）的方法提取白芨假鱗莖塊根總DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的純度和濃度。取適量樣品于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1. 2. 3 16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴增 以稀釋后的基因組DNA為模板，用帶Barcode的16S rDNA-V4區(qū)特異引物515F（5'-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGT

AA-3'）和806R（5'-AGTTCCGGACTACHVGGGTWTC

TAAT-3'），使用高效和高保真酶（New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）進行PCR，確保擴增效率和準確性。

1. 2. 4 PCR產(chǎn)物的混樣和純化 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用Thermo Scientific公司的Gene JET膠回收試劑盒切膠回收產(chǎn)物。

1. 2. 5 文庫構(gòu)建和上機測序 用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用Miseq進行上機測序（Youssef et al.，2009；Caporaso et al.，2011；Hess et al.，2011；Luo et al.，2012）。測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1. 3 生物信息學分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、過濾、去嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)（Edgar et al.，2011），剔除宿主葉綠體和線粒體序列，然后對有效數(shù)據(jù)在97%水平上進行OUT聚類，并利用Greengene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋（Edgar，2013）。通過對OTUs進行豐度、Alpha多樣性及物種在各分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計分析，可以得到微生物群落組成（Wang et al.，2007）；再通過Beta多樣性分析，研究環(huán)境樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異（DeSantis et al.，2006）。

1. 4 數(shù)據(jù)分析

利用Uparse（version 7.1 http：//qiime.org/）軟件平臺進行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成；利用Mothur軟件進行稀釋曲線分析；分別利用香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）和物種豐富度指數(shù)（ACE）公式計算細菌生態(tài)多樣性指數(shù)；利用Fasttree軟件+R語言制作熱圖；利用諾禾致源自主開發(fā)的SVG軟件制作特定物種分類樹圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 序列長度分布

白芨樣品所測得的49580條PE Reads長度分布在191～351 bp范圍內(nèi)，其中以長度為251 bp的序列最多，有48987條（圖1）。從序列長度的分布來看，與16S rDNA-V4區(qū)序列長度大致吻合。

2. 2 樣品復雜度分析

從稀釋曲線（圖2）可以看出，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平坦但未進入平臺期，說明再增加測序數(shù)量也只會產(chǎn)生少量新的OTUs；從Chao1指數(shù)曲線（圖3）可以看出，Chao1指數(shù)在0～5000的測序數(shù)量范圍內(nèi)增幅最大，在5000以后曲線斜率下降；從Shannon指數(shù)曲線（圖4）可以看出，Shannon指數(shù)在0～5000的測序數(shù)量范圍內(nèi)增幅最大，在5000以后曲線斜率下降。3條多樣性指數(shù)曲線在測序數(shù)量超過一定數(shù)量后均趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

2. 3 OTUs數(shù)目統(tǒng)計及物種注釋分析

白芨樣品共獲得49550條Tags（過濾后得到的拼接序列數(shù)），可分為48個OTUs（97%的序列相似性，下同），包括941條低頻Tags和48609條可以獲得注釋的Tags（圖5）。圖6為白芨樣品中相對豐度排名前8個屬細菌所對應的OTUs的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系數(shù)據(jù)，表明白芨內(nèi)生細菌主要分布于8個屬：地桿菌屬（Pedobacter）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、Kaistobacter屬、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、鹽單胞菌屬（Halomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。從OTUs豐度聚類圖（圖7）可以看出，在屬的分類水平上相對豐度由大到小依次為：鞘脂單胞菌屬>地桿菌屬=鹽單胞菌屬>土壤桿菌屬>Kaistobacter屬=希瓦氏菌屬=假單胞菌屬>短波單胞菌屬。

2. 4 多樣品中特定物種分類樹

從門的分類水平來看，白芨內(nèi)生細菌分布在擬桿菌門（Bacteroidetes，16.13%）和變形菌門（Proteobacteria，83.87%）；從綱的分類水平來看，白芨內(nèi)生細菌在Sphingobacteriia綱（16.13%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，54.84%）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，29.03%）中均有分布；從目的分類水平來看，白芨內(nèi)生細菌在鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales，16.13%）、柄桿菌目（Caulobacterales，3.23%）、根瘤菌目（Rhizobiales，12.90%）、根瘤菌目（Sphingomonadales，38.71%）、交替單胞菌目（Alteromonadales，6.45%）、海洋螺菌目（Oceanospirillales，16.13%）和假單胞菌目（Pseudomonadales，6.45%）中均有分布；從科的分類水平來看，白芨內(nèi)生細菌在鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae，16.13%）、柄桿菌科（Caulobacteraceae，12.90%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，38.71%）、希萬氏菌科（Shewanellaceae，6.45%）、鹽單胞菌科（Halomonadaceae，16.13%）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae，6.45%）中均有分布；從屬的分類水平來看，白芨內(nèi)生細菌在地桿菌屬（Pedobacter，16.13%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas，3.23%）、土壤桿菌屬（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter屬（6.45%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，32.26%）、希瓦氏菌屬（Shewanella， 6.45%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，16.13%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，6.45%）中均有分布（圖8）。由此可見，鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬為白芨內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群。

3 討論

16S rRNA基因很早就應用于微生物種類鑒定，但利用高通量測序進行16S rRNA分析最早出現(xiàn)在2006年，如Sogin等（2006）應用該技術(shù)對深海微生物群落進行了分析，隨后該技術(shù)在腸道微生物領域得到廣泛應用（南春燕等，2013），但將該技術(shù)應用于植物內(nèi)生微生物的研究未見報道。本研究首次將近幾年迅速發(fā)展并成為主流的Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)應用于植物內(nèi)生細菌研究，克服了傳統(tǒng)分子生物學方法通量低的缺陷，從基因組的水平上解析微生物群落結(jié)構(gòu)，突破了很多厭氧內(nèi)生微生物不能被分離培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999）。16S rRNA位于原核細胞核糖體小亞基上，包括 10個保守區(qū)域和9個高變區(qū)域，其中保守區(qū)在細菌間差異不明顯，高變區(qū)具有屬或種的特異性，隨親緣關(guān)系不同有一定的差異，因此，16S rDNA作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適于細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標。16S rDNA擴增子測序，通常是選擇某個或某幾個變異區(qū)域，利用保守區(qū)設計通用引物進行PCR擴增，然后對高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定，成為研究環(huán)境樣品中微生物組成結(jié)構(gòu)的重要手段。但就植物組織而言，葉綠體和線粒體與細菌在系統(tǒng)發(fā)育上具有高度的同源性（胡楷和吳慶書，2002），在對白芨內(nèi)生細菌的16S rDNA-V4變異區(qū)序列進行Illumina MiSeq高通量測序后，確實發(fā)現(xiàn)部分序列歸屬于宿主葉綠體和線粒體，存在一定比例的宿主污染現(xiàn)象，為了使細菌多樣性的分析結(jié)果更加準確、可靠，本研究剔除了宿主葉綠體和線粒體序列。為避開線粒體和葉綠體的干擾，下一步應在不同高通量測序平臺上針對16S rDNA的9個高變區(qū)的選擇及組合做更多嘗試，評估樣本的復雜程度及宿主的污染情況，選擇合理的測序區(qū)域或設計特異性更高的引物，制定更好的測序策略，從而將高通量測序技術(shù)更好地應用于植物內(nèi)生細菌研究。

目前關(guān)于白芨內(nèi)生細菌多樣性的研究尚無報道，但通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)其他植物內(nèi)生細菌的優(yōu)勢類群均為芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌（丁雅迪等，2015），與本研究結(jié)果不一致。這也從側(cè)面反映出植物內(nèi)生細菌中未培養(yǎng)微生物占很大比例，培養(yǎng)方法分析的細菌僅限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長的細菌，一些適合于分離培養(yǎng)基營養(yǎng)條件的菌株在分離過程中大量富集，而不適合于分離培養(yǎng)基營養(yǎng)條件的菌株在分離過程中逐漸衰退。許多研究已經(jīng)證實，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物僅占環(huán)境生物總數(shù)的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），說明通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的結(jié)果并不能真實反映內(nèi)生細菌的多樣性。因此，采用高通量測序的研究方法與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法相比，發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細菌種類不但豐富度可能有差別，而且優(yōu)勢種群也可能不同。已有研究表明，鞘脂單胞菌屬細菌能夠利用的底物廣泛，從多環(huán)芳烴類化合物、聚乙烯醇等高聚物到簡單無機物N2+均能利用，某些種屬還能產(chǎn)生有價值的生物高分子（如β-胡蘿卜素、結(jié)冷膠）（胡杰等，2007），說明白芨內(nèi)生細菌可為復雜有機物的降解提供良好的微生物來源。至今，關(guān)于鹽單胞菌屬和短波單胞菌屬細菌功能、代謝的研究未見報道，其作為內(nèi)生細菌的主要類群尚屬首次報道。

盡管高通量測序技術(shù)可以克服不可培養(yǎng)的困難，但是該技術(shù)也存在弊端，由于測序讀長相比Sanger一代測序短得多，再加上用于序列比對的數(shù)據(jù)庫目前還不夠完善，使得多數(shù)序列均無法被注釋到種的水平，因此，快速、準確及全面的植物內(nèi)生微生物多樣性研究仍需要多種方法結(jié)合來完成。

4 結(jié)論

白芨內(nèi)生細菌主要由地桿菌屬、短波單胞菌屬、土壤桿菌屬、Kaistobacter屬、鞘脂單胞菌屬、希瓦氏菌屬、鹽單胞菌屬和假單胞菌屬等8個屬組成，其中，鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬為優(yōu)勢種群。采用llumina MiSeq高通量測序技術(shù)可以檢測到采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度植物內(nèi)生細菌種類，能準確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和真實比例，在植物內(nèi)生微生物研究中具有的明顯優(yōu)勢和可行性。

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（責任編輯 麻小燕）