潤燥靈對干燥綜合征模型小鼠脾臟干預初探

曾蘋 侯雷 和秀麗 王瑩 馬武開

【摘 要】目的：探討潤燥靈對干燥綜合征模型小鼠脾臟的影響。方法：將90只C57bl/6j小鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，醋酸潑尼松組和潤燥靈高、中、低劑量組，每組15只?？瞻讓φ战M正常飼養(yǎng)，其余各組采用免疫誘導法建立干燥綜合征模型小鼠，各治療組予潤燥靈高、中、低劑量中藥及醋酸潑尼松灌胃治療，用藥4周后眼球取血，處死小鼠后無菌取出脾臟，HE染色，觀察病理切片，并采用MTT法檢測脾T淋巴細胞增殖轉化能力。結果：脾臟病理切片觀察顯示，模型對照組脾臟較空白對照組脾臟結構廣泛破壞，白髓廣泛增生，紅髓萎縮，脾血竇結構不清。潤燥靈高劑量組及醋酸潑尼松組與空白對照組比較，未見明顯病理改變。潤燥靈中、低劑量組脾臟白髓呈不同程度增生，紅髓呈不同程度萎縮。MTT法檢測結果顯示，模型對照組OD值明顯高于空白對照組，2組比較，差異有統(tǒng)計學差異（P < 0.01）；除潤燥靈低劑量組外，其余3個治療組均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。結論：潤燥靈能夠抑制干燥綜合征模型小鼠ConA誘導的脾T淋巴細胞的增殖，修復干燥綜合征模型小鼠脾臟的免疫損害。

【關鍵詞】 干燥綜合征；潤燥靈；T細胞；涎腺；動物模型；脾臟

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.03.002

Study on the Effect of Runzao Ling（潤燥靈）on the Spleen of Mouse with Sj?gren's Syndrome

ZENG Ping，HOU Lei，HE Xiu-li，WANG Ying，MA Wu-kai

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect of Runzao Ling（潤燥靈）on the spleen of mouse with sj?gren's

syndrome.Methods：Ninety C57bl/6j mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，a prednisone acetate group and the high，medium and low dose groups of Runzao Ling，15 mice in each group.The blank control group was fed normally.The rest groups were used to establish Sjogren's syndrome models by immune induction.All the treatment groups were given high，medium and low doses of Runzao Ling and prednisone by gavages.After

4 weeks of medication，blood of them was drawn from their eyeballs.Then killed the mice，took out their spleen sterilely and did HE staining to observe the pathological sections.MTT was used to detect proliferation transformation ability of the splenic T lymphocytes.Results：According to the spleen pathological sections，spleens of the model control group were more destroyed than those of the blank control group.Their white pulp had hyperplasia，red pulp had atrophy，and splenic sinusoid structure was not clear.The Runzao Ling high dose group and the prednisone group had no significant pathological changes compared with the blank control group.The white pulp of the spleens in the medium and Runzao Ling low dose groups had hyperplasia in different degrees，and their red pulp showed different degrees of atrophy.MTT assay showed that the OD value of the model control group was higher than that of the control group，with significant difference between them（P < 0.01）.Except for the low dose group，the OD value of the other three treatment groups was lower than that in the model control group，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.

Conclusion：Runzao Ling can inhibit the proliferation of splenic T lymphocytes induced by ConA in the mice of sj?gren's syndrome and repair the immune damage of their spleens.

【Keywords】 sj?gren's syndrome；

Runzao Ling（潤燥靈）；T lymphocyte；salivary

gland；animal model；spleen

干燥綜合征（sj?gren's syndrome，SS）是一種以侵犯涎腺、淚腺等外分泌腺為主，具有高度淋巴細胞浸潤的自身免疫性疾病，可見于任何年齡，最常見于40～60歲的女性，其發(fā)病率在風濕免疫病中居第2位，僅次于類風濕關節(jié)炎[1]。本病病理為淋巴及漿細胞浸潤，脾臟是機體最大的外周淋巴器官，當機體受到抗原刺激或機體免疫紊亂時，脾臟中T細胞便會克隆增殖。本病屬中醫(yī)學“燥證”“燥毒”“燥痹”等范疇。筆者認為，津虧、血瘀、燥毒是其發(fā)病特點，采用潤燥解毒、養(yǎng)陰生津、化瘀通絡的治療方法，辨證與辨病相結合，組成潤燥靈方，經(jīng)臨床驗證取得良好治療效果[2]。筆者建立SS模型小鼠，探討潤燥靈方對SS模型小鼠脾臟的修復作用及對脾臟中T細胞的干預作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選擇C57bl/6j小鼠90只，SPF級，雌性，8周齡，體質量約20 g，購自重慶騰鑫生物技術有限公司，許可證號：SCXK（軍）2012-0011。Lewis大鼠20只，SPF級，雌性，8周齡，體質量約150 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 實驗藥物 潤燥靈為本科室經(jīng)驗方，由腫節(jié)風10 g、姜黃10 g、白花蛇舌草10 g、生地黃15 g、玄參15 g、紫草10 g、當歸10 g、赤芍15 g、金銀花10 g等組成。生藥購自本院藥房。上藥加水浸泡10 min，煎煮2次，每次30 min，合并濾液，濃縮成每毫升含生藥5 g液體，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。醋酸潑尼松（浙江仙琚制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號140746）。

1.3 實驗試劑 百白破疫苗（武漢生物制品股份有限公司，批號20140104-2）由貴州省湄潭縣衛(wèi)生防疫站提供；SIGMA弗氏完全佐劑（批號SLBJ2845V）；考馬斯亮蘭試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20140710）；MTT（索萊寶生物科技，批號20150119）；紅細胞裂解液（索萊寶生物科技，貨號R1010）；ConA（SIGMA，貨號C-2010）；異丙醇（富宇試劑，XK13-011-00015）；質量分數(shù)為4%的多聚甲醛（索萊寶生物科技，貨號P1110），PBS緩沖液（HYCLONE，SH30256）。

2 方 法

2.1 動物分組 將90只C57bl/6j小鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，醋酸潑尼松組和潤燥靈高、中、低劑量組，每組15只。

2.2 動物模型的建立 參照Cutler方法加以改進[3]，

在無菌條件下取Lewis大鼠頜下腺，電動勻漿，4 ℃，1000 g，15 min離心，保留上清；向沉淀中加入

2 mL PBS，再次勻漿、離心，將2次上清液混合，4 ℃，10 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存；取上清4 ℃，25 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存；取上清4 ℃，40 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存；取上清4 ℃，100 000 g，15 min離心，保留沉淀加入1 mL PBS，冰浴保存，棄上清；將4次沉淀混合，采用考馬斯亮藍比色法，測定抗原質量分數(shù)為

8.7 mg·mL-1，加入PBS緩沖液稀釋抗原質量分數(shù)至2 mg·mL-1，再加入同體積弗氏完全佐劑，制備成最終抗原質量分數(shù)為1 mg·mL-1。除空白對照組外，其余模型對照組及用藥組首次免疫，每只小鼠背部、腹部注射抗原，總量為每只0.2 mL；第

2天予背部、腹部注射百白破疫苗0.5 mL，此后每隔14 d再加強免疫1次，除空白對照組外，其余模型對照組及用藥組再次加強免疫，每只小鼠背部、腹部注射抗原，總量為每只0.2 mL；第2天予背部、腹部注射百白破疫苗0.5 mL，產(chǎn)生類似于人SS的唾液腺改變及臨床表現(xiàn)特點，連續(xù)免疫4周。

2.3 給藥方法 建立動物模型，第5周開始灌胃給藥。根據(jù)人與小鼠體表面積換算給藥，潤燥靈中劑量組為人的等效劑量（給藥質量分數(shù)為2.5 g·mL-1），

潤燥靈高劑量組為人等效量2倍量（給藥質量分數(shù)為5 g·mL-1），潤燥靈低劑量組為人等效量1/2量（給藥質量分數(shù)為1.25 g·mL-1），醋酸潑尼松組為人的等效劑量（給藥質量分數(shù)為0.5 mg·mL-1），

各組均每日灌服2 mL，連續(xù)灌胃給藥4周。

2.4 病理學檢測 于第8周眼球取血，處死小鼠，立即取出小鼠脾臟。用質量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，由專業(yè)病理人員在光學顯微鏡下閱片。

2.5 小鼠脾臟T細胞增殖檢測 無菌取脾，分離成單個細胞，調(diào)脾淋巴細胞質量分數(shù)為5×106·mL-1，

加入96孔板中，每孔100 μL。用含ConA刺激物的1640完全培養(yǎng)液補足至每孔200 μL，最終質量分數(shù)為5 μg·mL-1，每組設3個平行孔。將培養(yǎng)板放入37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結束前4 h每孔加入MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后培養(yǎng)板3000 r·min-1，離心5 min，棄去上清，用濾紙吸去水分后，每孔加入酸化異丙醇100·L-1，靜置15 min，輕輕混勻后，492 nm波長測OD值。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 脾臟病理切片 空白對照組小鼠脾臟脾血竇分布于脾小體之間，未見擴散。紅、白髓分布整齊，排列均勻。模型對照組與空白對照組比較，脾臟結構廣泛破壞，白髓區(qū)脾小體廣泛增生，期間見大量淋巴細胞及單核、多核巨噬細胞增生。紅髓萎縮，脾血竇結構不清。潤燥靈高劑量組及醋酸潑尼松組較正常組比較未見明顯病理改變。潤燥靈中劑量組脾臟結構不規(guī)則，白髓區(qū)輕度增生。潤燥靈低劑量組脾臟結構破壞，白髓增生明顯，淋巴細胞、單核、多核巨噬細胞散在分布于紅髓之間。見圖1。

3.2 各組小鼠脾臟T細胞增殖轉化能力比較 MTT法檢測結果顯示，模型對照組OD值明顯高于空白對照組，2組比較，差異有統(tǒng)計學意義

（P < 0.01）；各用藥組治療后T細胞增殖有不同程度下降，除潤燥靈低劑量組外，其余3組與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；潤燥靈高、中劑量組T細胞的增殖與醋酸潑尼松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

4 討 論

SS是一種以侵犯外分泌腺為主的慢性、炎癥性自身免疫病。臨床上除口眼干澀等主要癥狀外，還會出現(xiàn)受累腺體T淋巴細胞浸潤、外周血中免疫球蛋白含量增多和高水平的自身抗體等免疫系統(tǒng)紊亂的表現(xiàn)。脾是機體最大的外周淋巴器官，其中含有大量的T細胞和B細胞，當這些免疫細胞被抗原刺激后，引起T細胞和B細胞增殖。SS屬中醫(yī)學“燥證”“燥痹”“燥毒”等范疇[4]。中醫(yī)藥較西藥治療SS具有明顯優(yōu)勢。根據(jù)SS的發(fā)病特點，本課題組將SS的主要病因病機歸為陰虛、瘀血及燥毒相互搏結[5-6]，而致五臟六腑失其所養(yǎng)，五官九竅失其滋潤。潤燥靈方對改善SS癥狀有較好療效[2]。朱躍蘭[7]也認為，SS的病機在于燥、毒、瘀三者間的相互作用，并指出治療當以潤燥、解毒、活血為原則。劉維[8]指出，治療SS應以清熱解毒、潤燥護陰為原則。潤燥靈方中腫節(jié)風、玄參、白花蛇舌草清熱解毒，當歸潤燥活血，姜黃、紫草、赤芍化瘀通絡，生地黃養(yǎng)陰生津。

本研究結果顯示，模型對照組與空白對照組小鼠比較，脾臟病理改變明顯。潤燥靈高劑量組、醋酸潑尼松組與空白對照組脾臟比較，未見明顯病理改變。潤燥靈中、低劑量組脾臟均有較明顯病理改變，且潤燥靈中劑量組脾臟的病理改變較潤燥靈低劑量組輕。說明潤燥靈濃度越高對小鼠脾臟的修復效果越好，并且潤燥靈高劑量對修復小鼠脾臟的作用同醋酸潑尼松相當。

SS模型小鼠脾臟中T細胞的增殖能力經(jīng)MTT法檢測顯示，模型對照組SS小鼠脾臟中T細胞的增殖明顯高于空白對照組（P < 0.01）；加用潤燥靈治療后，高、中、低劑量組均有較明顯改善，各用藥組治療后小鼠脾臟中T細胞的增殖均明顯小于模型對照組（P < 0.01），說明醋酸潑尼松與潤燥靈均可以抑制SS模型大鼠體內(nèi)亢進的細胞免疫反應。但潤燥靈高、中、低劑量組對SS小鼠脾臟T細胞的增殖抑制作用不及醋酸潑尼松對照組（P < 0.01），說明潤燥靈對抑制SS模型大鼠體內(nèi)細胞免疫反應的能力不及醋酸潑

尼松。

在以前的研究中，筆者對潤燥靈治療SS的作用機制進行了探討，其能夠通過調(diào)節(jié)SS模型小鼠水分子通道蛋白5，改善模型小鼠的唾液量[9-10]。本次研究觀察了潤燥靈對SS模型小鼠的治療作用，并對其免疫機制做了初步探討，為后續(xù)進一步探討潤燥靈對于T細胞的調(diào)節(jié)作用打下基礎。

5 參考文獻

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收稿日期：2015-09-03；修回日期：2015-12-07